Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Författarna tackar Flow Core Facility och Glasgow Imaging Facility (GIF) inom School of Infection and Immunity för deras stöd och hjälp i detta arbete.

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Enkel odling och isolering av ett stort antal funktionella OCs in vitro är viktiga för att öka förståelsen av benbiologi och OC-medierade sjukdomar. Klassiskt genererades OC i samkulturer med osteoblaster eller stromaceller och hematopoetiska celler från mjälten eller benmärgen38,39. Ett betydande genombrott i förståelsen av osteoklastogenes var identifieringen av RANKL som den viktigaste regulatorn för OC-bildning, differentiering och överlevnad40. Tidiga protokoll för RANKL-beroende kultursystem använde PBMC för OC-generering21,41,42. Dessa blandade kulturer är dock långa och presenterar många förvirrande faktorer som begränsar möjligheten att testa de direkta effekterna på OC-differentiering och funktion. Detta protokoll beskriver en effektiv och tillförlitlig in vitro-modell av osteoklastogenes från humana perifera CD14 + -monocyter där optimal osteoklastogenes kan erhållas inom 7 dagar (figur 1 och figur 2), vilket är betydligt snabbare jämfört med vissa andra protokoll43,44,45,46. De viktigaste kännetecknen för detta protokoll är (1) användningen av renade CD14 + -monocyter, (2) priming av monocyterna med M-CSF före exponering för RANKL, (3) kulturens längd (<7 dagar) och (4) tillförlitlig detektion av hämning av OC-bildning (TRAP-färgning) och funktion (resorption, ATP-produktion, aktinringomorganisation) med hämmare. 
Under optimeringen av metodiken identifierades flera kritiska punkter. Det har observerats att in vitro-differentieringen av OCs till stor del är beroende av sådddensiteten hos CD14 + -monocyterna. Således seedas cellerna i detta protokoll med hög densitet (1 x 105 celler / brunn av en 96-brunnsplatta, i 100 μL medium), eftersom det är viktigt för cellerna att kunna interagera med varandra och att vara i närheten av säkring och bli mogna OC. På samma sätt begränsar såddceller med en densitet som är för hög deras differentiering och tillväxt på grund av medelbegränsningar och brist på det nödvändiga utrymmet. För att uppnå maximal framgång med detta protokoll är det dessutom viktigt att utföra densitetsgradientseparationen noggrant och se till att den anrikade populationen av CD14 + -celler är så ren som möjligt. Till exempel resulterar otillräckliga tvättsteg i brist på avlägsnande av blodplättar, vilket följaktligen hämmar OC-differentiering47,48. På liknande sätt kan förekomsten av mindre T-cellkontaminering i isolerade CD14 + -preparat stimulerade med M-CSF ensam resultera i OC-differentiering, potentiellt via RANKL-utsöndring av T-celler49. Därför är det viktigt att inkludera en M-CSF-kontroll för varje experiment. En rutinmässig renhetskontroll, särskilt vid användning av en ny isoleringssats, rekommenderas också för att säkerställa provets renhet.
Optimala OC-tal (intervall: ~ 200-1,600 OC / brunn) uppnås med hjälp av α-MEM-medium berikat med nukleosider och L-glutamin. Andra konventionella odlingsmedier, inklusive Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) och Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påverkar OC-avkastningen. Källan till FBS kan också påverka osteoklastogenes. Olika satser av FBS kan leda till minskad RANK-L-härledd osteoklastogenes, liksom uppkomsten av lågt antal TRAP + flerkärniga celler i M-CSF-kontrollerna (kompletterande figur 3). För att uppnå konsekventa resultat rekommenderas därför att testa nya FBS-satser före användning och att fortsätta med samma sats under experimenten för att minimera variationer i differentieringsprocessen. Dessutom utgör variationen mellan givare och donatorer, när det gäller det totala antalet differentierade aktiva substanser som erhållits vid sluttidpunkten, en begränsning när man använder detta protokoll för att jämföra till exempel friska givare med patienter. I dessa fall är det absolut nödvändigt att använda exakt samma förhållanden och samma parti medium, FBS och andra reagens.
Ett annat nödvändigt steg för optimal OC-differentiering och mognad är att prima monocyterna med M-CSF före RANKL-tillsatsen. Cellernas exponering för M-CSF 18-24 timmar före RANKL primar monocyterna för att uppreglera RANK-uttryck15,26. Tillägg av RANKL vid denna tidpunkt säkerställer optimal OC-differentiering på ett dosberoende sätt. Graden av OC-differentiering varierar från givare till givare; 25 ng/ml RANKL är dock vanligtvis tillräckligt för att särskilja ett stort antal OC hos de flesta givare. Dessutom kan 25 ng/ml RANKL användas i analyser för initial screening av föreningar, eftersom det underlättar utvärderingen av både de förstärkande och hämmande effekterna av testföreningarna. Andra odlingssystem har använt längre M-CSF-förinkubationstider före RANKL-tillägg, men detta resulterar i en längre odlingstid för osteoklastogenes50. Dessutom lämnar de grundade monocyterna att inkubera över natten tillåter dem att fästa vid plattan, om än inte i ett helt vidhäftande tillstånd. Därför, när RANKL introduceras för första gången, måste mediet bytas mycket noggrant snarare än helt ändras för att förhindra lossning och förlust av de grundade monocyterna. Mediet måste också uppdateras var 3-4: e dag för att undvika medelutarmning och förhindra celldöd. På grund av den låga volym som används i denna analys (100 μl/brunn i en platta med 96 brunnar) är det dessutom av yttersta vikt att ha en ram av tomma brunnar som är fyllda med en vattenlösning (dvs. steril destilleradH2Oeller PBS) runt analysbrunnarna. Detta förhindrar medium avdunstning och kanteffekter.
Slutligen, för metaboliska analyser (t.ex. ATP-analyser) är det absolut nödvändigt att cellerna är livskraftiga för att undvika stor standardavvikelse mellan replikaten (figur 5). Hög livskraft hos cellerna är också viktigt för sortering av cellerna och för vidare odling av de sorterade OC (figur 4). Denna metod har dock flera begränsningar. Fullt mogna OC är mycket vidhäftande och svåra att lossa från plattorna. De större OC är ofta omöjliga att lossa, vilket kan leda till ett lägre cellutbyte. Därför måste cellerna räknas efter sortering och före plätering vid önskad koncentration. I detta protokoll används dessutom en icke-enzymatisk metod (accutas) för att lossa p-p-ämnena för att förhindra membranförändringar i nedströms ytfärgning för flödescytometri. Användningen av cellskrapor (både med mjuka eller hårda ändar) testades också och ledde till hög celldöd. Enzymatisk avskiljning med 0,05% trypsin / EDTA-lösningar kan användas för ett högre utbyte av fristående OCs när membranintegritet inte krävs för nedströmsapplikationer. Dessutom, för att förhindra att p-piller klumpar ihop, rekommenderas starkt användning av en hög koncentration av EDTA i alla buffertar efter cellavskiljning, liksom lämplig filtrering före flödescytometriförvärv. Det är viktigt att notera att OC-kulturer är en heterogen population av celler som består av mogna OC, OC-prekursorer och makrofager. Makrofager kan lätt skiljas från OC, även om både mononukleära pre-OC och multinukleära OC uttrycker OSCAR och inte kan särskiljas med den nuvarande metoden (figur 4). Den sistnämnda frågan utgör faktiskt den huvudsakliga begränsningen med denna metod. Dessutom finns ett lågt uttryck av OSCAR också i M-CSF-kulturer (figur 4B) och kan indikera makrofager som är grundade för OC-härstamningsåtagande. Det är viktigt att ställa in grinden för OSCAR+ -celler baserat på FMO-färgningssignalen, som visas i figur 4B.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en optimerad och robust metod för effektiv produktion av aktiva och funktionellt mogna OCs från cirkulerande primära humana monocyter. Styrkan i detta protokoll är dess förmåga att generera OC på kort tid och ge ett stort antal differentierade OC. Denna metod öppnar för att undersöka de grundläggande mekanismerna bakom OC-differentiering och funktion.

Osteoklaster (OC) är flerkärniga jätteceller av hematopoetisk härstamning med en unik förmåga att resorbera ben. De ansvarar för utveckling och kontinuerlig ombyggnad av skelettet 1,2. I skelettfaserna av utveckling härrör OC och vävnadsbosatta makrofager från erytro-myeloida föregångare och koloniserar bennischen och organvävnaderna. Under fysiologiska förhållanden krävs erytro-myeloida föregångare för normal benutveckling och tandutbrott, medan tillströmningen av cirkulerande blodmonocyter i bennischen ger postnatalt underhåll av OC, benmassa och benmärgshålighet3. Under patologiska förhållanden rekryteras monocyter till platser med aktiv inflammation och kan bidra till patologisk benförstöring 4,5.
Patienter med flera former av artrit upplever ledinflammation, vilket leder till progressiv ledförstörelse orsakad av OC6. Till exempel, vid reumatoid artrit (RA), är överaktiverade OC ansvariga för patologisk benerosion och ledförstörelse 7,8, och nuvarande behandlingar förbättrar eller stoppar ofta inte benskadorna9,10,11. Förändringar i cirkulerande monocyter både vad gäller populationsfördelning och transkriptomiska och epigenetiska signaturer har rapporterats hos RA-patienter12,13,14. Dessutom har det rapporterats att förändrade monocytsvar på inflammatorisk stimulering påverkar osteoklastogenes hos RA-patienter med aktiv sjukdom15,16,17.
Differentieringen av OC är en komplex flerstegsprocess som innefattar involvering av myeloida prekursorceller för differentiering till OC-prekursorer. Under osteoklastogenes blir OC jätte och flerkärnig genom cell-cellfusion, ofullständig cytokinese och en kärnåtervinningsprocess som beskrivs som fission och fusion18,19,20. Förmågan att differentiera p-piller in vitro har möjliggjort betydande framsteg i förståelsen av benbiologi21. OC skiljer sig från prekursorer vid exponering för makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator för nukleär faktor kappa-B-ligand (RANKL). Det senare är viktigt för normal utveckling och funktion av p-piller in vitro och in vivo, även under inflammatoriska tillstånd 6,22,23. RANKL presenteras av osteoblaster och osteocyter, samt av aktiverade T-celler och fibroblaster i inflammerat RA-synovium 2,24,25. Under OC-differentieringsprocessen uppreglerar monocyter som exponerats för M-CSF receptoraktivator för kärnfaktorkappa-B (RANK) -uttryck på deras cellmembran och, under efterföljande stimulering med RANKL, differentieras till tartrat resistent surt fosfatas (TRAP)-positiva mononukleära pre-OCs och sedan till multinucleated OCs15,26. OC producerar flera enzymer, den främsta bland dem är TRAP, som möjliggör nedbrytning av fosfoproteiner i ben27. En regulator och markör för OC-differentiering är den OC-associerade receptorn (OSCAR). Det uppregleras tidigt i prekursorceller som förbinder sig till OC-linjen28. Mogna jätte flerkärniga OC kan bryta ner (resorbera) skelettmatrisen genom att generera en stor tätningszon, som är gjord av en aktinring som omger en rufsig kant21,29,30. Benresorptionsförmågan hos OC kräver cytoskelettomorganisation och därmed polarisering och bildning av ett krökt membran, vilket är den så kallade ruffled gränsen. Den rufsiga gränsen är omgiven av ett stort cirkulärt band av en F-aktinrik struktur, som är aktinringen eller tätningszonen. Aktinringintegritet är avgörande för att OC ska resorbera ben både in vitro och in vivo, och defekt ruffled kantbildning är associerad med lägre vakuolär adenosintrifosfatas (V-ATPas) uttryck31,32,33. Dessutom är OC mitokondririka celler, och adenosintrifosfat (ATP) associeras med mitokondriella strukturer i OC lokaliserade vid den rufflade gränsen31,32,33. Rotenon verkar som en stark hämmare av mitokondriellt komplex I och påverkar ATP-produktionen. Rotenon har också visat sig hämma OC-differentiering och funktion34.
Detta protokoll beskriver en effektiv och optimerad metod för in vitro osteoklastogenes från humana perifera blodprover. I humant perifert blod är CD14 + -monocyter huvudkällan till OC15,35,36. I detta protokoll har exponeringskinetiken och koncentrationerna av M-CSF och RANKL justerats för optimal osteoklastogenes. Mononukleära celler separeras först från erytrocyterna och granulocyterna närvarande i helblod genom densitetsgradient; de berikas sedan för CD14 + -monocyter med hjälp av positivt urval med magnetiska pärlor. De isolerade CD14 + monocyterna inkuberas sedan över natten med M-CSF. Detta primar monocyterna för att uppreglera uttrycket av RANK15,26. Den efterföljande tillsatsen av RANKL inducerar osteoklastogenes och multinukleation på ett tidsberoende sätt. Aktivt resorberande OC visar den karakteristiska fördelningen av F-aktinringar vid kanten av cellmembranet30,32 och färgning för TRAP. Mogna OCs analyseras genom att kvantifiera TRAP+ flerkärniga (mer än tre kärnor) celler. Den funktionella kapaciteten hos mogna OC kan bedömas genom deras resorption, aktinringintegritet och ATP-produktion. Dessutom kan differentierade CD14− OSCAR+ OCs anrikas och användas för att bedöma effekterna av vissa föreningar på OC-funktionalitet via mineralresorption (eller dentin) och F-aktinorganisation. I detta arbete används dessutom en känd OC-hämmare, rotenon, som ett exempel på en förening som påverkar funktionaliteten hos OC. Minskad OC-resorptionsaktivitet under rotenon är förknippad med minskad ATP-produktion och aktinringfragmentering. Sammanfattningsvis etablerar detta protokoll en robust analys som kan användas som referensmetod för att studera flera biologiska aspekter av OC-differentiering och funktion in vitro. 
Denna metod kan användas för att bedöma (1) potentialen hos cirkulerande monocyter att differentiera till OC i hälsa och sjukdomar, samt (2) effekten av terapeutiska kandidater på OC-differentiering och funktion. Detta robusta osteoklastogenesprotokoll möjliggör bestämning av effekt och mekanismer för benriktade terapier på både OC-differentiering från prekursorceller och funktionen hos mogna OC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Osteoklaster (OC) är benresorberande celler som spelar en avgörande roll i skelettutveckling och ombyggnad av vuxna ben. Flera bensjukdomar orsakas av ökad differentiering och aktivering av OC, så hämningen av denna patobiologi är en viktig terapeutisk princip. Två nyckelfaktorer driver differentieringen av OC från myeloida prekursorer: makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator av kärnfaktor kappa-B-ligand (RANKL). Humana cirkulerande CD14 + -monocyter har länge varit kända för att differentiera till OC in vitro. Exponeringstiden och koncentrationen av RANKL påverkar dock differentieringseffektiviteten. Faktum är att protokoll för generering av humana OCs in vitro har beskrivits, men de resulterar ofta i en dålig och långvarig differentieringsprocess. Häri tillhandahålls ett robust och standardiserat protokoll för att generera funktionellt aktiva mogna mänskliga OCs i tid. CD14 + monocyter anrikas från humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) och grundas med M-CSF för att uppreglera RANK. Efterföljande exponering för RANKL genererar OC på ett dos- och tidsberoende sätt. OCs identifieras och kvantifieras genom färgning med tartrat syrabeständigt fosfatas (TRAP) och ljusmikroskopianalys. Immunofluorescensfärgning av kärnor och F-aktin används för att identifiera funktionellt aktiva OC. Dessutom anrikas OSCAR+CD14− mogna OCs ytterligare via flödescytometricellsortering och OC-funktionalitet kvantifierad genom mineralresorptionsanalyser (eller dentin/ben) och aktinringbildning. Slutligen används en känd OC-hämmare, rotenon, på mogna OCs, vilket visar att adenosintrifosfat (ATP) produktion är avgörande för aktinringintegritet och OC-funktion. Sammanfattningsvis etableras en robust analys för differentiering av ett stort antal OCs i detta arbete, vilket i kombination med aktinringsfärgning och en ATP-analys ger en användbar in vitro-modell för att utvärdera OC-funktion och för att screena för nya terapeutiska föreningar som kan modulera differentieringsprocessen.

OC-generering från CD14 + monocyter Denna metod syftade till att enkelt skilja ett stort antal OC från humana perifera CD14 + -monocyter in vitro, vanligtvis inom 1 vecka. För det första anrikades CD14 + -monocyter från PBMC och grundades med M-CSF över natten för att uppreglera RANK, som tidigare rapporterats15. Efter monocytpriming, för att bestämma den optimala koncentrationen av RANKL för OC-differentiering och mognad, användes RANKL-koncentrationer på 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml och 100 ng / ml, tillsammans med 25ng / ml m-csf. Tillsatsen av RANKL gav ett ökande antal stora TRAP-positiva flerkärniga OCs på ett dosberoende sätt, och detta bedömdes med hjälp av TRAP-färgning. Mogna OC definieras som TRAP-positiva celler med flera kärnor (vanligtvis mer än tre; Figur 2A, B och kompletterande figur 1). Vidare undersöktes kinetiken för OC-differentiering från monocyter med hjälp av TRAP-färgning och ljusmikroskopi under en 2-14 dagars odlingsperiod. I detta fall valdes OC-differentiering med en mellanliggande koncentration på 50 ng / ml RANKL för att bedöma hur snabbt OCs differentierades i kultur. Under dessa odlingsförhållanden var flerkärniga OC synliga från dag 5 och framåt, och optimal differentiering uppnåddes dag 7 (figur 2C). Den långvariga inkubationen av kulturer utöver 10 dagar på plast resulterade i onormalt jätte smälta celler. I detta protokoll används vanligtvis dag 6-8 som den optimala slutpunkten för OC-generering. OC kan kvantifieras eller användas för nedströmsanalyser.
Funktionell bedömning av differentierade organiserad brottslighet För att bestämma den funktionella aktiviteten hos de genererade OC: erna undersökte vi deras resorptiva aktivitet genom att differentiera OC: erna på en mineraliserad yta. Eftersom stora OC genereras först efter en 7 dagars odlingsperiod, och för att ge tillräckligt med tid att resorbera mineralsubstratet, bibehölls kulturerna fram till dag 10. Bildandet av runda hål, eller resorptionsgropar, observerades endast på de mineraliserade ytorna av brunnar innehållande celler som hade behandlats med både M-CSF och RANKL (figur 3). Således möjliggör procentandelen upplöst mineraliserad yta (resorptionsgropar) bestämning av OC-resorptiv kapacitet. Dessutom visade OC: erna differentierade efter detta protokoll fram till dag 7, både på plast- och glaskammarglas, en välorganiserad aktinringstruktur som kunde visualiseras genom immunofluorescerande färgning (kompletterande figur 2).
Effekt av en hämmare på mogen OC-funktion De ovan nämnda odlingsbetingelserna användes för att bestämma den funktionella förmågan hos in vitro-genererade OCs i närvaro av den kända OC-hämmaren, rotenon34. OCs differentierades i 6-8 dagar, och CD14−OSCAR+ OCs och OC-prekursorer anrikades via flödescytometri (figur 4). De anrikade cellerna pläterades sedan vid 50 000 celler/per brunn på en mineralbelagd 96-brunnsplatta i pro-osteoklastogent medium (25 ng/ml, m-csf och RANKL) i 3 dagar. Behandling med rotenon (figur 5A,B) hämmade dosberoende resorptionen av den mineraliserade ytan i jämförelse med den obehandlade kontrollbrunnen, i överensstämmelse med tidigare studier34. Dessutom utvärderades OC-funktionalitet via ATP-produktion och aktinringbildning. Den rotenonberoende hämningen av OC-resorptionen var associerad med hämningen av ATP-produktionen (figur 5C). Resorberande p-piller är starkt polariserade celler som reglerar deras resorptiva kapacitet genom att främja cytoskeletal organisation. Alexa fluor 647 konjugerat falloidin användes för att märka F-aktincytoskelettet hos de mogna OC: erna odlade i närvaro eller frånvaro av rotenon. Rotenon orsakade fragmenteringen av den RANKL-härledda aktinringen hos de mogna OC (figur 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figur 2: OC som effektivt skiljer sig från CD14 + monocytprekursorer. CD14 + monocyter anrikades magnetiskt, pläterades vid 1 x 105 celler / brunn i 96-brunnsplattor och inkuberades över natten med 25 ng / mL M-CSF. (A) M-CSF-grundade monocyter stimulerades med ökande koncentrationer av RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml och 100 ng/ml), fixerades och färgades för TRAP dag 7. Bilder förvärvades och TRAP + flerkärniga celler (MNC) räknades. Representativa bilder av TRAP-färgning visas i kompletterande figur 1. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD (n = 3). Data analyserades med en enkelriktad ANOVA och Holm-Sidaks multipla jämförelsetest för parade data; * P ≤ 0,05 och ** P ≤ 0,005. (B) Representativ bild av en TRAP-färgad brunn på en platta med 96 brunnar som visar den typiska mängden OC/väl förväntat och deras morfologi under 25 ng/ml RANK-L jämfört med M-CSF-härledda makrofager dag 7. Skalstänger: 1000 μm. (C) Representativa bilder av OC-bildning under 50 ng/ml RANKL bedömda via TRAP-färgning från dag 2 till dag 14. OCs är synliga från dag 5 och framåt. Jätte onormalt smälta OC är närvarande efter 10 dagar. Skalstänger: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figur 3: Resorptiva OC differentierade från CD14 + monocyter. CD14 + -celler isolerade från PBMC differentierades i 10 dagar till OC i närvaro av 25 ng / mL M-CSF (M) och RANKL (R) på mineralanalysytan (osteoanalys) plattor. (A) Bilder av representativa rekonstruerade brunnar tagna med 10x förstoring för att analysera resorptionen på dag 10 (mineralsubstrat i grått; resorptionsgropar i vitt). Skalstänger: 1000 μm. (B) Kvantifiering av procentandelen resorberad area. Resorptionsdata analyserades med en Wilcoxon-paranalys. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figur 4: Anrikning av flödescytometri av CD14−OSCAR+ OCs. CD14 + monocyter anrikades från PBMC, och OC differentierades som tidigare beskrivits. Adherent OC-kulturer lossnade med accutas och färgades för flödescytometri. (A–C) OCs vid dag 8 sorterades baserat på CD14 och OSCAR uttryck. (A) Representativ sorteringsgrindstrategi. Cellerna var gated som singlets, negativ för död färgning, och CD14 + OSCAR + (röd) och CD14 − OSCAR + (blå) delmängder sorterades. B) Representativa diagram som visar överlappande OSCAR-färgning av OC härledda från RANKL (cyan) och makrofager som härrör från M-CSF (orange). I rött är OSCAR-isotypfärgad kontroll av RANKL-härledda OCs. (C) De sorterade populationerna pläterades på plast och fick fästa i 2 timmar i pro-OC-medium (25 ng / mL M-CSF och 50 ng / ml RANKL), följt av TRAP-färgning och visualisering. De representativa bilderna visar en brist på TRAP+-celler i CD14+-delmängden (röd) och mono- och flerkärnig TRAP+ pre-OC och OC i CD14−-delmängden (blå). Skalstänger: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figur 5: Tester för att bedöma funktionen hos mogna aktiva organiska föreningar. För att utvärdera funktionen hos mogna OCs odlades CD14 + -celler isolerade från PBMCs antingen med M-CSF (M) ensam eller kombinerat med RANKL (R) i 7 dagar, OCs anrikades via flödescytometri och OC behandlades sedan med hämmaren rotenon i 24 timmar. (A) Mogna OCs sorterades via flödescytometri (CD14−OSCAR+) och odlades på en mineralanalysyta i närvaro eller frånvaro av rotenon i 3 dagar, varefter cellerna blektes och avbildades vid 10x för att avslöja det resorberade området (resorptionsgropar i vitt). (A) Representativa rekonstruerade bilder av brunnar. Skalstänger: 1000 μm. (B) Kvantifiering av procentandelen resorberad area. Data i (B) analyserades med en enkelriktad ANOVA med Dunns multipla jämförelsetest (n = 7); * P ≤ 0,05 och** P ≤ 0,01. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD. (C) Totalt intracellulärt ATP-innehåll av odifferentierade och dag 7 differentierade mogna OCs differentierade med RANKL och behandlade med antingen vehikel eller rotenon (10 nM och 30 nM). Här användes 2DG och oligomycin som positiva kontroller för analysen och tillsattes 30 min före celllys och ATP-kvantifiering. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD (n = 4). Data analyserades med en enkelriktad ANOVA och Dunnetts multipeljämförelsetest för parade data. ** P ≤ 0,01. (D) En representativ 20x bild av mogna OC färgade för aktinringbildning (röd) och kärnor (blå), som visar förlusten av aktinringen med hämmaren. Skalstänger: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plattans format</td>
			<td>96 brunnsplatta</td>
			<td>48 brunnsplatta</td>
			<td>24 brunnsplatta</td>
			<td>12 brunnsplatta</td>
			<td>6 brunnsplatta</td>
		</tr><tr><td>volym</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8–1 ml</td>
			<td>1,8–2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Cellsuspensionens volym för olika plattformat. Volymerna beräknas med utgångspunkt från en 1 x 106 celler/ml lösning och ger en optimal densitet för cell-cellfusion.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluorofor, klon</td>
			<td>Volym (μL) per 106 celler</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/cyanin7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffert för cellsortering</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Lösning av masterblandning av antikroppar. 
Kompletterande figur 1: TRAP-färgning av RANKL-dosresponsen. CD14 + monocyter anrikades magnetiskt, pläterades vid 1 x 105 celler / brunn i 96-brunnsplattor och inkuberades över natten med 25 ng / mL M-CSF, som i figur 2. Representativa bilder av TRAP-färgning visar MCSF-grundade monocyter stimulerade med ökande koncentrationer av RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml och 100 ng / ml), fixerade och färgade för TRAP på dag 7. Skalstänger: 400 μm. Klicka här <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: Verkande ringfärgning i helt differentierade OC. (A) En 10x förstoring av OC differentierad på TC-plast och färgad med AF647 falloidin (i rött). Skalstapel: 400 μm. (B) En 40x förstoring av OC differentierad på glaskammarglas och färgad med AF488 falloidin (i gult). Skalstapel: 100 μm.Kärnorna är färgade med DAPI, som visas i blått i (A) och i cyan i (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 3: Effekten av olika FBS-satser på OC-differentieringseffektivitet. OCs differentierades från CD14 + monocyter i närvaro av 25 ng / mL M-CSF och 50 ng / mL RANKL (MR) i 7 dagar. Kontrollbrunnarna hade endast M-CSF (M). (A) Representativa förstoringar på 10x (skalstapeler: 400 μm) och (B) Kvantifiering av TRAP-färgade OCs differentierade från en givare i två olika satser av FBS. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD för tre tekniska repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoklaster är viktiga benresorberande celler i kroppen. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för in vitro-differentiering av osteoklaster från humana perifera blodmonocyter. Denna metod kan användas som ett viktigt verktyg för att ytterligare förstå osteoklastbiologi vid homeostas och vid sjukdomar.

Differentiering av funktionella osteoklaster från humana perifera blod-CD14 + -monocyter

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Vårt protokoll beskriver en optimerad och reproducerbar metod för att generera osteoklast in vitro som kan användas för att undersöka mekanismerna bakom deras differentieringsprocess och funktionalitet. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att generera ett stort antal funktionellt aktiva osteoklaster inom bara en vecka. Högt differentieringsutbyte uppnås genom att använda renade monocyter och tillsätta cytokiner i tid.Osteoklaster är ansvariga för benförstöring i alla former av artrit, och denna metod ger verktygen för att screena nya terapeutiska föreningar som kan modulera deras differentiering och / eller funktioner. Patricia Riedlova, doktorand från vårt laboratorium, demonstrerar proceduren. För att börja, isolera PBMC: erna genom att överföra blodet till ett nytt 50-milliliter rör.Späd det med steril PBS i lika stor volym för färskt blod, eller ett förhållande 1: 3 för leukocytkottar och buffiga rockar. Blanda försiktigt blodet genom inversion. Förbered 15-milliliter rör innehållande tre milliliter densitetsgradientmedium och skikt långsamt åtta till 10 ml utspätt blod på toppen av densitetsgradientmediet och undvik blandning.Centrifugera röret vid 400 x g i 30 minuter vid rumstemperatur utan broms. Kassera sedan försiktigt det översta lagret med en Pasteur-pipett. Samla upp det undre interfasskiktet som innehåller PBMC:erna och överför detta lager till ett nytt 50-milliliterrör.Häng upp cellerna upp till 50 ml med steril PBS och tvätta bort restdensitetsgradientmediet genom centrifugering vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur med full broms. För att avlägsna kvarvarande trombocyter, upprepa centrifugeringsprocessen enligt beskrivningen i manuskriptet, suspendera de isolerade och renade PBMC: erna i 20 ml PBS och räkna dem med en hemacytometer enligt standardmetoden. För att berika CD14 + monocyter, överför 1 x 10 till de sjunde PBMC: erna till ett lämpligt polystyren rundbottenrör och pellet cellerna vid 300 x g i fem minuter.Efter att ha kasserat supernatanten och återsuspenderat cellpelleten i cellseparationsbuffert, inkubera cellerna med 10 mikroliter antikroppscocktail per 100 mikroliter med locket på i 10 minuter. Vid slutet av inkubationen tillsätt 10 mikroliter av de magnetiska nanopartikelpärlorna per 100 mikroliter och inkubera i tre minuter med locket på. Fyll på volymen till 2,5 ml med cellseparationsbufferten.Placera röret i en magnet och inkubera i tre minuter med locket av. Kassera nu den negativa cellpopulationen med ett kontinuerligt drag genom inversion medan röret fortfarande är i magneten. Ta bort röret från magneten, Tvätta de anrikade CD14 + monocyterna fästa vid magnetpärlorna genom att resuspendera dem i 2,5 ml av cellsuspensionsbufferten och placera röret tillbaka i magneten.Räkna de isolerade cellerna som visats tidigare. Centrifugera de uppsamlade cellerna vid 300 x g i fem minuter. Efter kassering av supernatanten, suspendera cellerna igen vid 1 miljon celler per milliliter i fullständigt alfa minimum essentiellt medium med 10% FBS.För att differentiera osteoklasten, tillsätt M-CSF vid en slutlig koncentration av 25 nanogram per milliliter till cellsuspensionen och blanda genom pipettering noggrant för att homogenisera cellsuspensionen. Platta 100 mikroliter av suspensionen per brunn i en platt botten 96-brunnsplatta. Tillsätt sedan 200 mikroliter sterilt destillerat vatten per brunn runt de pläterade cellerna för att förhindra mediumavdunstning och kanteffekter i odlingssystemet.Inkubera cellerna över natten i cirka 18 till 20 timmar vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Förbered färska medier kompletterade med M-CSF och RANK-ligand. Efter inkubationen, avlägsna försiktigt hälften av mediet genom aspiration med en P200-pipett och ersätt det med färskt, varmt komplett medium kompletterat med M-CSF- och RANK-ligand vid en slutlig koncentration av 25 nanogram per milliliter.Differentiera cellerna i osteoklaster i sju till 14 dagar med en fullständig ersättning av medium var tredje dag. Efter avlägsnande av mediet fixeras de differentierade vidhäftande osteoklasterna med 100 mikroliter per brunn av den beredda fixeringslösningen och inkubera i en minut. Rör inte brunnarnas botten för att undvika att repa de vidhäftande cellerna.När brunnarna har tvättats tre gånger med 300 mikroliter sterilt destillerat vatten, knacka plattorna torra och tillsätt 100 mikroliter nyberedd färglösning till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i mörkret i 20 minuter. Efter inkubation, avlägsna färgningslösningen genom inversion och tvätta plattan tre gånger med 300 mikroliter per brunn destillerat vatten.Ta bort överflödigt vatten genom att knacka på plattorna på pappershanddukar och lämna plattorna öppna och skyddade från ljus till lufttorkning över natten. Använd ett ljusfältmikroskop med ett kakelalternativ, ta bilder på 10x eller 20x för att fånga hela brunnytan. Räkna manuellt de osteoklaster som identifierats som TRAP + lila färgade celler med mer än tre kärnor med hjälp av en bildanalysprogramvara med ett cellräknarplugin.Platta 100 mikroliter av de isolerade CD14 + monocyterna per brunn i en 18-brunnskammare vid en celldensitet av 1 x 10 till de femte cellerna per brunn. Differentiera osteoklasterna i närvaro av M-CSF och RANK-ligand som visats tidigare med en fullständig förändring av medium var tredje dag. Vid sluttidpunkten, ta försiktigt bort mediet och tvätta varje brunn två gånger med 200 mikroliter förvärmd PBS vid pH 7,4.Låt inte brunnarna torka mellan stegen. Fixera provet med 100 mikroliter per brunn 4% formaldehydlösning i PBS och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur på en orbitalskakare med försiktig skakning. Tvätta cellerna två gånger med 200 mikroliter per brunn PBS efter inkubation.Permeabilisera cellerna med 100 mikroliter per brunn av 0,1% Triton x-100-lösning utspädd i PBS och inkubera i 10 minuter som visats tidigare. Tvätta två gånger med 200 mikroliter per brunn PBS. För att blockera icke-specifik bindning och öka signalen, tillsätt 100 mikroliter blockeringslösning gjord med 2% bovint serumalbumin och PBS-lösning.Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur på en orbitalskakare med försiktig skakning. Efter avlägsnande av blockeringslösningen, tillsätt 100 mikroliter fluorescerande konjugerad falloidinlösning utspädd i 2% BSA / PBS-lösning till varje brunn. Tvätta två gånger med 200 mikroliter per brunn PBS.Färga kärnorna med 100 mikroliter per brunn av en lösning av PBS innehållande 300 nanomolar DAPI. Efter 10 till 15 minuter, ta bort DAPI-lösningen och ersätt den med 100 mikroliter per brunn PBS. Visualisera färgningen med lämpliga immunofluorescens- eller konfokalmikroskop vid fyra till 40x.De mogna osteoklasterna definieras som TRAP+multipla kärnceller. Tillsatsen av RANK-ligand gav ett ökande antal stora TRAP+flerkärniga osteoklaster på ett dosberoende sätt. Kinetiken för osteoklastdifferentiering från monocyter undersöktes under en två till 14-dagars odlingsperiod.Flerkärniga osteoklaster var synliga från dag fem och framåt, och optimal differentiering uppnåddes dag sju. Differentieringen av osteoklaster på mineraliserade ytor gör det möjligt att bedöma deras resorptionsaktivitet genom att analysera bildandet av runda hål eller resorptionsgropar. Procentandelen resorption ökar signifikant i närvaro av M-CSF och RANK-ligand jämfört med enbart M-CSF.Vidare hämmade behandling med rotenon dosberoende resorptionen av den mineraliserade ytan jämfört med den obehandlade kontrollbrunnen. Den rotenonberoende hämningen av osteoklastresorptionen var associerad med hämningen av ATP-produktionen. Fragmenteringen av den RANK-ligandhärledda aktinringen hos den mogna OCS observerades i närvaro av rotenon.Det är viktigt att se till att de anrikade monocyterna inte innehåller blodplättar, att cellerna pläteras med rätt densitet och att de omgivande brunnarna fylls med vatten för att undvika kanteffekten. Detta protokoll är särskilt användbart för att mekanistiskt förhöra hur osteoklaster bildas och vad som påverkar deras funktionalitet både i grundläggande och translationell vetenskap. Till exempel genom att använda föreningar eller proteiner som kan modulera dessa processer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ avbildning av Lineage-specifika Toll-like receptor-medierad signalering i monocyter och dendritiska celler från små Prover av blod

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyt differentiering och trombocytantal Formation från mänskliga sladd blod-derived CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bedömning av Synaptic gränssnittet för primära humant T-celler från perifert blod och lymfatisk vävnad

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolering, transfektion och kultur av primära mänskliga monocyter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...