Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmadaki destekleri ve yardımları için Enfeksiyon ve Bağışıklık Okulu bünyesindeki Flow Core Facility ve Glasgow Imaging Facility'ye (GIF) minnetle teşekkür eder.

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çok sayıda fonksiyonel OC'nin in vitro olarak kolay kültürlenmesi ve izolasyonu, kemik biyolojisi ve OC aracılı hastalıkların anlaşılmasını ilerletmek için önemlidir. Klasik olarak, OC'ler osteoblastlar veya stromal hücreler ve dalak veya kemik iliğinden hematopoetik hücreler ile ko-kültürlerde üretildi38,39. Osteoklastogenezin anlaşılmasında önemli bir atılım, RANKL'nin OC oluşumunun, farklılaşmasının ve sağkalımının ana düzenleyicisi olarak tanımlanmasıydı40. RANKL'ye bağımlı kültür sistemlerinin erken protokolleri, OC üretimi 21,41,42 için PBMC'leri kullandı. Bununla birlikte, bu karışık kültürler uzundur ve OC farklılaşması ve fonksiyonu üzerindeki doğrudan etkileri test etme yeteneğini sınırlayan birçok kafa karıştırıcı faktör sunar. Bu protokol, optimal osteoklastogenezin 7 gün içinde elde edilebildiği insan periferik CD14 + monositlerinden osteoklastogenezin etkili ve güvenilir bir in vitro modelini tanımlamaktadır (Şekil 1 ve Şekil 2), diğer bazı protokollerle karşılaştırıldığında oldukça hızlıdır43,44,45,46. Bu protokolün ana ayırt edici özellikleri (1) saflaştırılmış CD14 + monositlerin kullanımı, (2) monositlerin RANKL'ye maruz kalmadan önce M-CSF ile astarlanması, (3) kültürün uzunluğu (<7 gün) ve (4) OC oluşumunun (TRAP boyama) ve fonksiyonun (rezorpsiyon, ATP üretimi, aktin halkası yeniden düzenlenmesi) inhibitörlerle inhibisyonunun güvenilir bir şekilde tespit edilmesidir. 
Metodolojinin optimizasyonu sırasında, birkaç kritik nokta belirlenmiştir. OC'lerin in vitro farklılaşmasının büyük ölçüde CD14 + monositlerinin tohumlama yoğunluğuna bağlı olduğu gözlenmiştir. Böylece, bu protokolde, hücreler yüksek yoğunlukta (1 x 105 hücre / 96 delikli bir plakanın kuyusu, 100 μL ortamda) tohumlanır, çünkü hücrelerin birbirleriyle etkileşime girebilmeleri ve kaynaşmaya ve olgun OC'ler haline gelmelerine yakın olmaları esastır. Benzer şekilde, hücrelerin çok yüksek bir yoğunlukta tohumlanması, orta sınırlamalar ve gerekli alanın eksikliği nedeniyle farklılaşmalarını ve büyümelerini sınırlar. Ayrıca, bu protokolle maksimum başarı elde etmek için, yoğunluk gradyanı ayrımını dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve CD14 + hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonunun mümkün olduğunca saf olmasını sağlamak önemlidir. Örneğin, yetersiz yıkama adımları, trombositlerin çıkarılmamasına neden olur ve bu da OC farklılaşmasını47,48'i inhibe eder. Benzer şekilde, tek başına M-CSF ile uyarılan izole CD14 + preparatlarında minör T hücresi kontaminasyonunun varlığı, potansiyel olarak T hücreleri49 tarafından RANKL sekresyonu yoluyla OC farklılaşmasına neden olabilir. Bu nedenle, her deney için bir M-CSF kontrolü eklemek önemlidir. Özellikle yeni bir izolasyon kiti kullanırken rutin saflık kontrolü, numunenin saflığını sağlamak için de önerilir.
Optimum OC sayıları (aralık: ~200-1.600 OC / kuyu), nükleozitler ve L-glutamin ile zenginleştirilmiş α-MEM ortamı kullanılarak elde edilir. Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) ve Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı da dahil olmak üzere diğer geleneksel kültür ortamları, OC verimini etkiler. FBS'nin kaynağı osteoklastogenezi de etkileyebilir. Farklı FBS partileri, RANK-L kaynaklı osteoklastogenezin azalmasına ve M-CSF kontrollerinde düşük sayıda TRAP + çok çekirdekli hücrenin ortaya çıkmasına neden olabilir (Ek Şekil 3). Bu nedenle, tutarlı sonuçlar elde etmek için, yeni FBS partilerini kullanmadan önce test etmeniz ve farklılaştırma sürecindeki varyasyonları en aza indirmek için deneyler boyunca aynı partiyle devam etmeniz önerilir. Ek olarak, donörden donöre değişkenlik, bitiş noktasında elde edilen farklılaşmış OC'lerin toplam sayısı açısından, örneğin sağlıklı donörleri hastalarla karşılaştırmak için bu protokolü kullanırken bir sınırlama oluşturur. Bu gibi durumlarda, tam olarak aynı koşulları ve aynı miktarda ortam, FBS ve diğer reaktifleri kullanmak zorunludur.
Optimum OC farklılaşması ve olgunlaşması için bir diğer gerekli adım, RANKL ilavesinden önce monositlerin M-CSF ile astarlanmasıdır. Hücrelerin RANKL'den önce M-CSF 18-24 saate maruz kalması, monositleri RANK ekspresyonu 15,26'yı yukarı regüle etmeye hazırlar. Bu zaman noktasında RANKL ilavesi, doza bağımlı bir şekilde optimal OC farklılaşmasını sağlar. OC farklılaşma derecesi donörden donöre değişir; Bununla birlikte, 25 ng / mL RANKL genellikle çoğu donörde çok sayıda OC'yi ayırt etmek için yeterlidir. Ek olarak, 25 ng / mL RANKL, test bileşiklerinin hem arttırıcı hem de inhibitör etkilerinin değerlendirilmesini kolaylaştırdığı için, bileşiklerin ilk taraması için tahlillerde kullanılabilir. Diğer kültür sistemleri, RANKL ilavesinden önce daha uzun M-CSF ön inkübasyon süreleri kullanmıştır, ancak bu, osteoklastogenez50 için daha uzun bir kültürleme süresi ile sonuçlanır. Ek olarak, astarlanmış monositleri gece boyunca inkübe etmeye bırakmak, tamamen yapışkan bir durumda olmasa da, plakaya yapışmalarını sağlar. Bu nedenle, RANKL ilk kez tanıtıldığında, astarlanmış monositlerin ayrılmasını ve kaybını önlemek için ortam tamamen değiştirilmek yerine çok dikkatli bir şekilde yarı yarıya değiştirilmelidir. Orta derecede tükenmeyi önlemek ve hücre ölümünü önlemek için ortamın her 3-4 günde bir yenilenmesi gerekir. Ayrıca, bu tahlilde kullanılan düşük hacim nedeniyle (96 delikli bir plakada 100 μL / kuyu), tahlil kuyularının etrafında sulu bir çözelti (yani, steril damıtılmışH2O veya PBS) ile doldurulmuş boş kuyucuklardan oluşan bir çerçeveye sahip olmak son derece önemlidir. Bu, orta buharlaşmayı ve kenar etkilerini önler.
Son olarak, metabolik tahliller için (örneğin, ATP tahlilleri), replikalar arasında büyük standart sapmalardan kaçınmak için hücrelerin canlı olması zorunludur (Şekil 5). Hücrelerin yüksek canlılığı, hücrelerin sıralanması ve sıralanan OC'lerin daha fazla kültürlenmesi için de önemlidir (Şekil 4). Bununla birlikte, bu yöntemin birkaç sınırlaması vardır. Tamamen olgun OC'ler çok yapışkandır ve plakalardan ayrılması zordur. Daha büyük OC'lerin ayrılması genellikle imkansızdır, bu da daha düşük bir hücre verimine yol açabilir. Bu nedenle, hücrelerin sıralamadan sonra ve gerekli konsantrasyonda kaplanmadan önce sayılması gerekir. Ayrıca, mevcut protokolde, akış sitometrisi için aşağı akış yüzey boyamasında membran değişikliklerini önlemek için OC'leri ayırmak için enzimatik olmayan bir yöntem (accutase) kullanılmaktadır. Hücre kazıyıcıların kullanımı (hem yumuşak hem de sert uçlu) da test edildi ve yüksek hücre ölümüne yol açtı. %0,05 Tripsin/EDTA çözeltileri kullanan enzimatik dekolmanı, çıkış yönündeki uygulamalar için membran bütünlüğü gerekmediğinde daha yüksek müstakil OC verimi için kullanılabilir. Ek olarak, OC'lerin bir araya toplanmasını önlemek için, hücre ayrılmasını takiben tüm tamponlarda yüksek konsantrasyonda EDTA kullanılması ve akış sitometrisi ediniminden önce uygun filtreleme şiddetle tavsiye edilir. OC kültürlerinin olgun OC'ler, OC öncülleri ve makrofajlardan oluşan heterojen bir hücre popülasyonu olduğunu belirtmek önemlidir. Makrofajlar OC'lerden kolayca ayırt edilebilir, ancak hem mononükleer pre-OC'ler hem de multinükleer OC'ler OSCAR'ı ifade eder ve mevcut yöntemle ayırt edilemez (Şekil 4). Gerçekten de, bu son konu, bu yöntemin temel sınırlamasını oluşturmaktadır. Ek olarak, düşük bir OSCAR ekspresyonu M-CSF kültürlerinde de mevcuttur (Şekil 4B) ve OC soyağacı taahhüdü için hazırlanmış makrofajları gösterebilir. OSCAR+ hücrelerinin kapısını, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, FMO boyama sinyaline göre ayarlamak önemlidir.
Özetle, bu protokol, dolaşımdaki birincil insan monositlerinden aktif ve fonksiyonel olarak olgun OC'lerin verimli üretimi için optimize edilmiş ve sağlam bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokolün gücü, kısa sürede OC üretme ve çok sayıda farklılaşmış OC üretme yeteneğidir. Bu yöntem, OC farklılaşmasının ve fonksiyonunun altında yatan temel mekanizmaların araştırılmasının yolunu açar.

Osteoklastlar (OC'ler), kemiği rezorbe etmek için eşsiz bir kapasiteye sahip hematopoetik soyun çok çekirdekli dev hücreleridir. İskelet 1,2'nin geliştirilmesinden ve sürekli yeniden şekillendirilmesinden sorumludurlar. Gelişimin iskelet evrelerinde, OC'ler ve dokuda yerleşik makrofajlar eritro-miyeloid progenitörlerden türetilir ve kemik nişini ve organ dokularını kolonize eder. Fizyolojik koşullarda, normal kemik gelişimi ve diş erüpsiyonu için eritro-miyeloid progenitörler gereklidir, dolaşımdaki kan monositlerinin kemik nişine akması, OC'lerin, kemik kütlesinin ve kemik iliği boşluğunun doğum sonrası bakımını sağlar3. Patolojik koşullar altında, monositler aktif inflamasyon bölgelerine alınır ve patolojik kemik yıkımına katkıda bulunabilir 4,5.
Çeşitli artrit formları olan hastalar eklem iltihabı yaşarlar ve OCs6'nın neden olduğu ilerleyici eklem yıkımına yol açarlar. Örneğin, romatoid artritte (RA), aşırı aktive olmuş OC'ler patolojik kemik erozyonu ve eklem yıkımından sorumludur 7,8 ve mevcut tedaviler genellikle kemik hasarını iyileştirmez veya durdurmaz 9,10,11. RA hastalarında dolaşımdaki monositlerde hem popülasyon dağılımı hem de transkriptomik ve epigenetik imzalar açısından değişiklikler bildirilmiştir12,13,14. Ayrıca, aktif hastalığı olan RA hastalarında inflamatuar stimülasyona verilen monosit yanıtlarının değişmiş monosit yanıtlarının osteoklastogenezi etkilediği bildirilmiştir15,16,17.
OC'lerin farklılaşması, miyeloid öncü hücrelerin OC öncüllerine farklılaşmaya bağlılığını içeren karmaşık çok adımlı bir süreçtir. Osteoklastogenez sırasında, OC'ler hücre-hücre füzyonu, eksik sitokinezi ve fisyon ve füzyon 18,19,20 olarak tanımlanan nükleer bir geri dönüşüm süreci yoluyla dev ve çok çekirdekli hale gelir. OC'leri in vitro olarak ayırt etme yeteneği, kemik biyolojisinin anlaşılmasında önemli ilerlemelere izin vermiştir21. OC'ler, makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) ve nükleer faktör kappa-B ligandının (RANKL) reseptör aktivatörüne maruz kaldıklarında öncüllerden ayrılırlar. İkincisi, enflamatuar koşullar altında bile OC'lerin in vitro ve in vivo normal gelişimi ve işlevi için gereklidir 6,22,23. RANKL, osteoblastlar ve osteositlerin yanı sıra iltihaplı RA sinovyum 2,24,25'teki aktive T hücreleri ve fibroblastlar tarafından sunulur. OC farklılaşma işlemi sırasında, M-CSF'ye maruz kalan monositler, hücre zarlarındaki nükleer faktör kappa-B (RANK) ekspresyonunun reseptör aktivatörünü yukarı regüle eder ve daha sonra RANKL ile uyarılma altında, tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) pozitif mononükleer pre-OC'lere ve daha sonra çok çekirdekli OC'lere 15,26'ya farklılaşır. OC'ler birkaç enzim üretir, bunların arasında en önemlisi, kemik27 içindeki fosfoproteinlerin parçalanmasını sağlayan TRAP'tır. OC farklılaşmasının bir düzenleyicisi ve belirteci, OC ile ilişkili reseptördür (OSCAR). OC soyu28'e bağlı öncü hücrelerde erken regüle edilir. Olgun dev çok çekirdekli OC'ler, karıştırılmış bir sınır21,29,30'u çevreleyen bir aktin halkasından yapılmış büyük bir sızdırmazlık bölgesi oluşturarak iskelet matrisini bozabilir (rezorbe edebilir). OC'lerin kemik rezorpsiyon kabiliyeti, sitoiskeletin yeniden düzenlenmesini ve bunun sonucunda polarizasyonu ve karıştırılmış sınır olarak adlandırılan kıvrımlı bir zarın oluşumunu gerektirir. Karıştırılmış sınır, aktin halkası veya sızdırmazlık bölgesi olan F-aktin bakımından zengin bir yapının büyük bir dairesel bandı ile çevrilidir. Aktin halka bütünlüğü, OC'lerin hem in vitro hem de in vivo kemiği rezorbe etmesi için gereklidir ve kusurlu karıştırılmış sınır oluşumu alt vakuolar adenozin trifosfataz (V-ATPaz) ekspresyonu31,32,33 ile ilişkilidir. Dahası, OC'ler mitokondri bakımından zengin hücrelerdir ve adenozin trifosfat (ATP), karıştırılmış sınırda lokalize olan OC'lerdeki mitokondriyal benzeri yapılarla ilişkilidir31,32,33. Rotenon, mitokondriyal kompleks I'in güçlü bir inhibitörü olarak işlev görür ve ATP üretimini etkiler. Rotenonun ayrıca OC farklılaşmasını ve fonksiyon34'ü inhibe ettiği gösterilmiştir.
Bu protokol, insan periferik kan örneklerinden in vitro osteoklastogenezin etkili ve optimize edilmiş bir yöntemini tanımlamaktadır. İnsan periferik kanında CD14+ monositler OC'lerinana kaynağıdır 15,35,36. Bu protokolde, maruziyetin kinetiği ve M-CSF ve RANKL konsantrasyonları optimum osteoklastogenez için ayarlanmıştır. Mononükleer hücreler ilk önce tam kanda bulunan eritrositlerden ve granülositlerden yoğunluk gradyanı ile ayrılır; daha sonra manyetik boncuklarla pozitif seleksiyon kullanılarak CD14 + monositler için zenginleştirilirler. İzole CD14+ monositler daha sonra M-CSF ile gece boyunca inkübe edilir. Bu, monositleri RANK 15,26'nın ifadesini yukarı regüle etmeye hazırlar. Daha sonra RANKL'nin eklenmesi, osteoklastogenezi ve multinükleasyonu zamana bağlı bir şekilde indükler. Aktif emici OC'ler, hücre zarının kenarındaki F-aktin halkalarının karakteristik dağılımını30,32 ve TRAP için boyama gösterir. Olgun OC'ler, TRAP + çok çekirdekli (üçten fazla çekirdek) hücrelerin nicelleştirilmesiyle analiz edilir. Olgun OC'lerin fonksiyonel kapasiteleri rezorpsiyonları, aktin halkası bütünlüğü ve ATP üretimi ile değerlendirilebilir. Ayrıca, farklılaştırılmış CD14-OSCAR + OC'ler zenginleştirilebilir ve bazı bileşiklerin OC işlevselliği üzerindeki etkilerini mineral (veya dentin) rezorpsiyonu ve F-aktin organizasyonu yoluyla değerlendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, bu çalışmada, bilinen bir OC inhibitörü olan rotenone, OC'lerin işlevselliğini etkileyen bir bileşiğin bir örneği olarak kullanılmıştır. Rotenon altında azalmış OC rezorpsiyon aktivitesi, azalmış ATP üretimi ve aktin halkası parçalanması ile ilişkilidir. Sonuç olarak, bu protokol, OC farklılaşmasının ve fonksiyonunun in vitro olarak çeşitli biyolojik yönlerini incelemek için referans yöntem olarak kullanılabilecek sağlam bir tahlil oluşturur.
Bu metodoloji, (1) dolaşımdaki monositlerin sağlık ve hastalıklarda OC'lere farklılaşma potansiyelini ve (2) terapötik adayların OC farklılaşması ve fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu sağlam osteoklastogenez protokolü, kemik hedefli tedavilerin hem öncü hücrelerden OC farklılaşması hem de olgun OC'lerin fonksiyonu üzerindeki etkinliğinin ve mekanizmalarının belirlenmesini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Osteoklastlar (OC'ler), iskelet gelişiminde ve yetişkin kemik yeniden şekillenmesinde önemli rol oynayan kemik emici hücrelerdir. Birçok kemik bozukluğu, OC'lerin artmış farklılaşması ve aktivasyonundan kaynaklanır, bu nedenle bu patobiyolojinin inhibisyonu anahtar bir terapötik prensiptir. OC'lerin miyeloid öncüllerden farklılaşmasını sağlayan iki temel faktör vardır: makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve nükleer faktör kappa-B ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü. İnsan dolaşımındaki CD14 + monositlerin in vitro OC'lere farklılaştığı uzun zamandır bilinmektedir. Bununla birlikte, maruz kalma süresi ve RANKL konsantrasyonu, farklılaşma verimliliğini etkiler. Gerçekten de, in vitro insan OC'lerinin üretimi için protokoller tanımlanmıştır, ancak bunlar genellikle zayıf ve uzun bir farklılaşma sürecine neden olmaktadır. Burada, işlevsel olarak aktif olgun insan OC'lerini zamanında üretmek için sağlam ve standartlaştırılmış bir protokol sağlanmıştır. CD14 + monositler, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) zenginleştirilir ve RANK'yi yükseltmek için M-CSF ile astarlanır. Daha sonra RANKL'ye maruz kalmak, doza ve zamana bağlı bir şekilde OC'ler üretir. OC'ler, tartarat aside dirençli fosfataz (TRAP) ve ışık mikroskobu analizi ile boyanarak tanımlanır ve ölçülür. Çekirdeklerin ve F-aktinin immünofloresan boyaması, fonksiyonel olarak aktif OC'leri tanımlamak için kullanılır. Ek olarak, OSCAR + CD14 − olgun OC'ler, akış sitometri hücresi sıralama ve OC işlevselliği mineral (veya dentin / kemik) rezorpsiyon testleri ve aktin halkası oluşumu ile ölçülerek daha da zenginleştirilir. Son olarak, bilinen bir OC inhibitörü olan rotenon, olgun OC'lerde kullanılır ve adenozin trifosfat (ATP) üretiminin aktin halkası bütünlüğü ve OC fonksiyonu için gerekli olduğunu gösterir. Sonuç olarak, bu çalışmada, aktin halkası boyama ve ATP testi ile kombinasyon halinde, OC fonksiyonunu değerlendirmek ve farklılaşma sürecini modüle edebilen yeni terapötik bileşikleri taramak için yararlı bir in vitro model sağlayan bu çalışmada çok sayıda OC'yi ayırt etmek için sağlam bir tahlil yapılmıştır.

CD14+ monositlerden OC üretimi Bu yöntem, çok sayıda OC'yi insan periferik kan CD14 + monositlerinden in vitro, tipik olarak 1 hafta içinde kolayca ayırt etmeyi amaçlamıştır. İlk olarak, CD14 + monositleri PBMC'lerden zenginleştirildi ve daha önce bildirildiği gibi RANK'ı yükseltmek için bir gecede M-CSF ile astarlandı15. Monosit astarlamayı takiben, OC farklılaşması ve olgunlaşması için optimum RANKL konsantrasyonunu belirlemek için, 25ng / mL M-CSF ile birlikte 1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL ve 100 ng / mL'lik RANKL konsantrasyonları kullanıldı. RANKL ilavesi, doza bağımlı bir şekilde artan sayıda büyük TRAP-pozitif çok çekirdekli OC üretti ve bu, TRAP boyama kullanılarak değerlendirildi. Olgun OC'ler, çoklu çekirdeğe sahip TRAP-pozitif hücreler olarak tanımlanır (tipik olarak üçten fazla; Şekil 2A,B ve Ek Şekil 1). Ayrıca, OC'nin monositlerden farklılaşmasının kinetiği, 2-14 günlük bir kültür periyodu boyunca TRAP boyama ve ışık mikroskobu kullanılarak araştırıldı. Bu örnekte, OC'lerin kültürde ne kadar hızlı farklılaştığını değerlendirmek için 50 ng / mL RANKL'lik bir ara konsantrasyon kullanılarak OC farklılaşması seçildi. Bu kültür koşullarında, çok çekirdekli OC'ler 5. günden itibaren görülebildi ve 7. günde optimal farklılaşmaya ulaşıldı (Şekil 2C). Kültürlerin plastikler üzerinde 10 günden fazla uzun süre inkübasyonu, anormal derecede dev kaynaşmış hücrelerle sonuçlandı. Bu protokolde, 6-8. günler genellikle OC üretiminin optimal bitiş noktası olarak kullanılır. OC'ler ölçülebilir veya aşağı akış testleri için kullanılabilir.
Farklılaştırılmış OC'lerin fonksiyonel değerlendirmesi Üretilen OC'lerin fonksiyonel aktivitesini belirlemek için, mineralize bir yüzey üzerindeki OC'leri ayırt ederek emici aktivitelerini inceledik. Büyük OC'ler sadece 7 günlük bir kültür periyodundan sonra üretildiğinden ve mineral substratı emmek için yeterli zamana izin vermek için, kültürler 10. güne kadar korunmuştur. Yuvarlak deliklerin veya rezorpsiyon çukurlarının oluşumu, sadece hem M-CSF hem de RANKL ile muamele edilmiş hücreleri içeren kuyucukların mineralize yüzeylerinde gözlenmiştir (Şekil 3). Böylece, çözünmüş mineralize yüzeyin yüzdesi (rezorpsiyon çukurları) OC emici kapasitesinin belirlenmesine izin verir. Ek olarak, bu protokolü takiben 7. güne kadar hem plastik hem de cam hazneli slaytlarda farklılaşan OC'ler, immünofloresan boyama ile görselleştirilebilen iyi organize edilmiş bir aktin halkası yapısı göstermiştir (Ek Şekil 2).
Bir inhibitörün olgun OC fonksiyonu üzerindeki etkisi Yukarıda belirtilen kültürleme koşulları, bilinen OC inhibitörü rotenon34'ün varlığında in vitro üretilen OC'lerin fonksiyonel kapasitesini belirlemek için kullanılmıştır. OC'ler 6-8 gün boyunca farklılaştırıldı ve CD14-OSCAR+ OC'ler ve OC öncülleri akım sitometrisi ile zenginleştirildi (Şekil 4). Zenginleştirilmiş hücreler daha sonra 3 gün boyunca pro-osteoklastojenik ortamda (25 ng / mL, M-CSF ve RANKL) mineral kaplı 96 delikli bir plaka üzerine kuyu başına 50.000 hücre / kaplanmış olarak kaplandı. Rotenon ile tedavi (Şekil 5A, B) doza bağlı olarak, önceki çalışmalarla tutarlı olarak, tedavi edilmemiş kontrol kuyusuna kıyasla mineralize yüzeyin emilimini inhibe etmiştir34. Ek olarak, OC işlevselliği ATP üretimi ve aktin halkası oluşumu ile değerlendirildi. OC rezorpsiyonunun rotenona bağımlı inhibisyonu, ATP üretiminin inhibisyonu ile ilişkiliydi (Şekil 5C). Rezorbe eden OC'ler, sitoiskelet organizasyonunu teşvik ederek rezorptif kapasitelerini düzenleyen oldukça polarize hücrelerdir. Alexa fluor 647 konjuge phalloidin, rotenon varlığında veya yokluğunda kültürlenen olgun OC'lerin F-aktin sitoiskeletini etiketlemek için kullanıldı. Rotenon, olgun OC'lerin RANKL türevi aktin halkasının parçalanmasına neden olmuştur (Şekil 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Şekil 2: CD14+ monosit öncüllerinden etkili bir şekilde ayrılan OC'ler. CD14+ monositler manyetik olarak zenginleştirildi, 96 delikli plakalarda 1 x 105 hücre/kuyuda kaplandı ve 25 ng/mL M-CSF ile gece boyunca inkübe edildi. (A) M-CSF astarlı monositler, artan konsantrasyonlarda RANKL (1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL ve 100 ng / mL) ile uyarıldı, 7. günde sabitlendi ve TRAP için boyandı. Görüntüler elde edildi ve TRAP + çok çekirdekli hücreler (ÇUŞ'lar) sayıldı. TRAP boyamasının temsili görüntüleri Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. Hata çubukları ortalama ± SD gösterir (n = 3). Veriler, eşleştirilmiş veriler için tek yönlü ANOVA ve Holm-Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi ile analiz edilmiştir; * P ≤ 0.05 ve ** P ≤ 0.005. (B) 7. günde M-CSF türevi makrofajlara kıyasla tipik OC / iyi beklenen OC miktarını ve morfolojilerini 25 ng / mL RANK-L'nin altında gösteren 96 delikli bir plakanın TRAP boyalı bir kuyusunun temsili görüntüsü. Ölçek çubukları: 1000 μm. (C) 50 ng/mL RANKL'nin altındaki OC oluşumunun temsili görüntüleri, 2. günden 14. güne kadar TRAP boyama ile değerlendirildi. OC'ler 5. günden itibaren görülebilir. Dev anormal şekilde kaynaşmış OC'ler 10 gün sonra ortaya çıkar. Ölçek çubukları: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Şekil 3: CD14+ monositlerden farklılaşan emici OC'ler. PBMC'lerden izole edilen CD14+ hücreleri, mineral tahlil yüzey (osteo-tahlil) plakalarında 25 ng/mL, M-CSF (M) ve RANKL (R) varlığında 10 gün boyunca OC'lere farklılaştırıldı. (A) 10. günde rezorpsiyonu analiz etmek için 10x büyütmede çekilen temsili yeniden yapılandırılmış kuyucukların görüntüleri (gri renkte mineral substrat; beyaz renkte rezorpsiyon çukurları). Ölçek çubukları: 1000 μm. (B) Emilen alanın yüzdesinin ölçülmesi. Rezorpsiyon verileri Wilcoxon eşleştirilmiş analizi ile analiz edildi. Hata çubukları ortalama ± SD gösterir (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Şekil 4: CD14−OSCAR+ OC'lerin akış sitometrisi zenginleştirmesi. CD14 + monositleri PBMC'lerden zenginleştirildi ve OC'ler daha önce tarif edildiği gibi farklılaştırıldı. Yapışkan OC kültürleri accutase ile ayrıldı ve flow sitometrisi için boyandı. (A-C) 8. gündeki OC'ler CD14 ve OSCAR ekspresyonuna göre sıralandı. (A) Temsilci sıralama geçit stratejisi. Hücreler ölü boyama için negatif olan singlet'lar olarak kapatıldı ve CD14 + OSCAR + (kırmızı) ve CD14 − OSCAR + (mavi) alt kümeleri sıralandı. (B) RANKL türevi OC'lerin (camgöbeği) örtüşen OSCAR boyamasını gösteren temsili grafikler ve kontrol M-CSF türevli makrofajlar (turuncu). Kırmızı renkte, RANKL türevi OC'lerin OSCAR izotip boyalı kontrolü bulunur. (C) Sıralanan popülasyonlar plastik üzerine kaplandı ve pro-OC ortamında (25 ng / mL M-CSF ve 50 ng / mL RANKL) 2 saat boyunca yapışmasına izin verildi, ardından TRAP boyama ve görselleştirme yapıldı. Temsili görüntüler, CD14+ alt kümesinde (kırmızı) TRAP+ hücrelerinin eksikliğini ve CD14− alt kümesinde (mavi) mono ve çok çekirdekli TRAP+ ön OC'leri ve OC'leri gösterir. Ölçek çubukları: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Şekil 5: Olgun OC'lerin işlevini değerlendirmek için yapılan testler. Olgun OC'lerin fonksiyonunu değerlendirmek için, PBMC'lerden izole edilen CD14+ hücreleri ya tek başına M-CSF (M) ile kültürlendi ya da 7 gün boyunca RANKL (R) ile kombine edildi, OC'ler akış sitometrisi ile zenginleştirildi ve OC'ler daha sonra 24 saat boyunca inhibitör rotenon ile tedavi edildi. (A) Olgun OC'ler akış sitometrisi (CD14-OSCAR+ ) ile sıralandı ) ve 3 gün boyunca rotenon varlığında veya yokluğunda bir mineral tahlil yüzeyinde kültürlendi, daha sonra hücreler ağartıldı ve emilen alanı (beyaz rezorpsiyon çukurları) ortaya çıkarmak için 10x'te görüntülendi. (A) Kuyuların temsili olarak yeniden yapılandırılmış görüntüleri. Ölçek çubukları: 1000 μm. (B) Emilen alanın yüzdesinin nicelleştirilmesi. (B)'deki veriler Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi (n=7) ile tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir; * P ≤ 0,05 ve ** P ≤ 0,01. Hata çubukları ortalama ± SD'yi gösterir. (C) RANKL ile farklılaştırılan ve araç veya rotenon (10 nM ve 30 nM) ile tedavi edilen farklılaşmamış ve gün 7 farklılaşmış olgun OC'lerin toplam hücre içi ATP içeriği. Burada, 2DG ve oligomisin tahlil için pozitif kontrol olarak kullanıldı ve hücre lizisi ve ATP miktarından 30 dakika önce eklendi. Hata çubukları ortalama ± SD (n = 4) gösterir. Veriler, tek yönlü bir ANOVA ve Dunnett'in eşleştirilmiş veriler için çoklu karşılaştırma testi ile analiz edilmiştir. ** P ≤ 0,01. (D) Aktin halkası oluşumu (kırmızı) ve çekirdekler (mavi) için boyanmış, aktin halkasının inhibitör ile kaybını gösteren olgun OC'lerin temsili 20x görüntüsü. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plaka formatı</td>
			<td>96 kuyu plakası</td>
			<td>48 kuyu plakası</td>
			<td>24 kuyu plakası</td>
			<td>12 kuyu plakası</td>
			<td>6 kuyu plakası</td>
		</tr><tr><td>hacim</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8–1 mL</td>
			<td>1,8–2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Farklı plaka formatları için hücre süspansiyonunun hacmi. Hacimler 1 x 106 hücre/mL çözeltiden başlayarak hesaplanır ve hücre-hücre füzyonu için optimum yoğunluk sağlar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Florofor, klon</td>
			<td>106 hücre başına hacim (μL)</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Siyanin7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Hücre sıralama arabelleği</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2 : Antikor ana karışım çözeltisi. 
Ek Şekil 1: RANKL doz yanıtının TRAP boyaması. CD14+ monositler manyetik olarak zenginleştirilmiş, 96 delikli plakalarda 1 x 105 hücre/kuyuda kaplanmış ve Şekil 2'de olduğu gibi 25 ng/mL M-CSF ile gece boyunca inkübe edilmiştir. TRAP boyamasının temsili görüntüleri, artan RANKL konsantrasyonları (1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL ve 100 ng / mL) ile uyarılan, 7. günde TRAP için sabitlenmiş ve boyanmış MCSF astarlı monositleri göstermektedir. Ölçek çubukları: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Tamamen farklılaşmış OC'lerde hareketli halka boyaması. (A) TC plastik üzerinde farklılaştırılmış ve AF647 falloidin (kırmızı renkte) ile boyanmış OC'lerin 10 kat büyütülmesi. Ölçek çubuğu: 400 μm. (B) Cam hazneli slaytlarda farklılaştırılmış ve AF488 falloidin (sarı renkte) ile boyanmış OC'lerin 40x büyütülmesi. Ölçek çubuğu: 100 μm.Çekirdekler DAPI ile boyanır, (A) içinde mavi ve (B) içinde camgöbeği ile gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 3: Farklı FBS partilerinin OC farklılaşma verimliliği üzerindeki etkisi. OC'ler CD14+ monositlerden 7 gün boyunca 25 ng/mL M-CSF ve 50 ng/mL RANKL (MR) varlığında ayırt edildi. Kontrol kuyularında sadece M-CSF (M) vardı. (A) Temsili 10x büyütme (ölçek çubukları: 400 μm) ve (B) iki farklı FBS grubunda bir donörden farklılaştırılmış TRAP boyalı OC'lerin nicelleştirilmesi. Hata çubukları, üç teknik çoğaltmanın ortalama ± SD'sini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0. Protokolümüz, farklılaşma süreçlerinin ve işlevlerinin altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek osteoklast in vitro üretmek için optimize edilmiş ve tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, sadece bir hafta içinde çok sayıda fonksiyonel olarak aktif osteoklast üretme yeteneğidir. Saflaştırılmış monositler kullanılarak ve zamanında sitokinler eklenerek yüksek farklılaşma verimi elde edilir.Osteoklastlar, artritin her formunda kemik yıkımından sorumludur ve bu yöntem, farklılaşmalarını ve / veya işlevlerini modüle edebilen yeni terapötik bileşikleri taramak için araçlar sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Patricia Riedlova olacaktır. Başlamak için, kanı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktararak PBMC'leri izole edin.Taze kan için eşit hacimde steril PBS ile veya lökosit konileri ve kabarık katlar için 1: 3 oranında seyreltin. Kanı ters çevirerek yavaşça karıştırın. Üç mililitre yoğunluk gradyan ortamı içeren 15 mililitrelik tüpler hazırlayın ve karıştırmayı önleyerek yoğunluk gradyanı ortamının üstüne yavaşça sekiz ila 10 mililitre seyreltilmiş kan tabakası koyun.Tüpü 400 x g'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca frensiz olarak santrifüj edin. Ardından üst katmanı bir Pasteur pipet ile dikkatlice atın. PBMC'leri içeren alt fazlar arası tabakayı toplayın ve bu katmanı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.Steril PBS ile 50 mililitreye kadar olan hücreleri askıya alın ve artık yoğunluk gradyan ortamını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak tam frenle yıkayın. Artık trombositleri çıkarmak için, makalede açıklandığı gibi santrifüjleme işlemini tekrarlayın, izole edilmiş ve saflaştırılmış PBMC'leri 20 mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve standart yöntemi izleyerek bir hemasitometre kullanarak sayın. CD14 + monositleri zenginleştirmek için, 1 x 10'u yedinci PBMC'lere uygun bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'de pelet edin.Süpernatantı attıktan ve hücre peletini hücre ayırma tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca kapak açıkken 100 mikrolitre başına 10 mikrolitre antikor kokteyli ile inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, 100 mikrolitre başına 10 mikrolitre manyetik nanopartikül boncuğu ekleyin ve kapak açıkken üç dakika boyunca inkübe edin. Hücre ayırma arabelleği ile ses seviyesini 2,5 mililitreye kadar doldurun.Tüpü bir mıknatısa yerleştirin ve kapağı kapalıyken üç dakika boyunca inkübe edin. Şimdi, tüp hala mıknatısın içindeyken negatif hücre popülasyonunu ters çevirerek sürekli bir hareketle atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın, manyetik boncuklara tutturulmuş zenginleştirilmiş CD14 + monositleri, hücre süspansiyon tamponunun 2,5 mililitresinde yeniden askıya alarak yıkayın ve tüpü mıknatısa geri yerleştirin.İzole edilmiş hücreleri daha önce gösterildiği gibi sayın. Toplanan hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri% 10 FBS ile tam alfa minimum esansiyel ortamda mililitre başına 1 milyon hücrede yeniden askıya alın.Osteoklastı ayırt etmek için, hücre süspansiyonuna mililitre başına 25 nanogramlık son konsantrasyonda M-CSF ekleyin ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için pipetleyerek iyice karıştırın. Düz tabanlı 96 delikli bir plakada kuyu başına süspansiyonun 100 mikrolitresini plakalayın. Daha sonra, kültür sisteminde orta buharlaşmayı ve kenar etkilerini önlemek için kaplanmış hücrelerin etrafına kuyu başına 200 mikrolitre steril damıtılmış su ekleyin.Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede yaklaşık 18 ila 20 saat boyunca inkübe edin. M-CSF ve RANK ligand ile desteklenmiş taze medya hazırlayın. İnkübasyondan sonra, bir P200 pipet kullanarak ortamın yarısını aspirasyonla dikkatlice çıkarın ve mililitre başına 25 nanogramlık son konsantrasyonda M-CSF ve RANK ligand ile desteklenmiş taze, ılık tam ortam ile değiştirin.Hücreleri yedi ila 14 gün boyunca osteoklastlara ayırın ve her üç günde bir ortamın tamamen değiştirilmesiyle değiştirin. Ortamı çıkardıktan sonra, farklılaşmış yapışkan osteoklastları, hazırlanan fiksatif çözeltinin kuyucuk başına 100 mikrolitre ile sabitleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Yapışkan hücrelerin çizilmesini önlemek için kuyucukların dibine dokunmayın.Kuyucuklar 300 mikrolitre steril damıtılmış su ile üç kez yıkandıktan sonra, plakaları kurutun ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre taze hazırlanmış boyama çözeltisi ekleyin. Plakayı karanlıkta 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boyama çözeltisini ters çevirerek çıkarın ve plakayı üç kez damıtılmış su kuyusu başına 300 mikrolitre ile yıkayın.Tabakları kağıt havluların üzerine dokundurarak fazla suyu çıkarın ve tabakları açık bırakın ve gece boyunca ışıktan hava kurumasına kadar koruyun. Karo seçeneğine sahip bir parlak alan mikroskobu kullanarak, tüm kuyu yüzeyini yakalamak için 10x veya 20x'te görüntü çekin. Bir hücre sayacı eklentisine sahip bir görüntü analiz yazılımı kullanarak üçten fazla çekirdeğe sahip TRAP + mor boyalı hücreler olarak tanımlanan osteoklastları manuel olarak sayın.İzole CD14 + monositlerin 100 mikrolitresini 18 delikli bir oda slaytında, 1 x 10'luk bir hücre yoğunluğunda, kuyu başına beşinci hücrelere kadar plakalayın. Osteoklastları, daha önce gösterildiği gibi M-CSF ve RANK ligand varlığında her üç günde bir tam bir ortam değişikliği ile ayırt edin. Bitiş noktasında, ortamı yavaşça çıkarın ve pH 7.4'te 200 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS ile her bir kuyuyu iki kez yıkayın.Kuyucukların adımlar arasında kurumasına izin vermeyin. Numuneyi PBS'de kuyucuk başına 100 mikrolitre% 4 formaldehit çözeltisi ile sabitleyin ve hafifçe çalkalayarak yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri iki kez PBS kuyusu başına 200 mikrolitre ile yıkayın.PBS'de seyreltilmiş %0.1 Triton x-100 çözeltisinin kuyu başına 100 mikrolitre ile hücreleri geçirgenleştirin ve daha önce gösterildiği gibi 10 dakika inkübe edin. Kuyucuk başına 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek ve sinyali arttırmak için,% 2 sığır serum albümini ve PBS çözeltisi ile yapılan 100 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin.Hafifçe çalkalayarak yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, her bir kuyucuğa% 2 BSA / PBS çözeltisi içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre floresan konjuge faloidin çözeltisi ekleyin. Kuyucuk başına 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın.Çekirdekleri, 300 nanomolar DAPI içeren bir PBS çözeltisinin kuyucuk başına 100 mikrolitre ile lekeleyin. 10 ila 15 dakika sonra, DAPI çözeltisini çıkarın ve kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile değiştirin. Boyamayı dört ila 40x'te uygun immünofloresan veya konfokal mikroskoplar kullanarak görselleştirin.Matür osteoklastlar TRAP+multipl nükleat hücreleri olarak tanımlanır. RANK ligandının eklenmesi, doza bağımlı bir şekilde artan sayıda büyük TRAP + çok çekirdekli osteoklastlar üretti. Monositlerden osteoklast farklılaşmasının kinetiği iki ila 14 günlük bir kültür periyodu boyunca araştırıldı.Çok çekirdekli osteoklastlar beşinci günden itibaren görülebildi ve yedinci günde optimal farklılaşmaya ulaşıldı. Osteoklastların mineralize yüzeylere farklılaşması, yuvarlak deliklerin veya rezorpsiyon çukurlarının oluşumunu analiz ederek rezorpsiyon aktivitelerini değerlendirmeyi sağlar. Rezorpsiyon yüzdesi, M-CSF ve RANK ligand varlığında tek başına M-CSF ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artar.Ayrıca, rotenon dozuna bağlı olarak tedavi, tedavi edilmemiş kontrol kuyusuna kıyasla mineralize yüzeyin emilimini inhibe etmiştir. Osteoklast rezorpsiyonunun rotenona bağımlı inhibisyonu, ATP üretiminin inhibisyonu ile ilişkiliydi. Olgun OCS'nin RANK ligand kaynaklı aktin halkasının parçalanması rotenon varlığında gözlendi.Zenginleştirilmiş monositlerin trombosit içermediğinden, hücrelerin doğru yoğunlukta kaplandığından ve kenar etkisini önlemek için çevredeki kuyucukların suyla doldurulduğundan emin olmak önemlidir. Bu protokol, osteoklastların nasıl oluştuğunu ve hem temel hem de translasyonel bilimde işlevlerini neyin etkilediğini mekanik olarak sorgulamak için özellikle yararlıdır. Örneğin, bu süreçleri modüle edebilen bileşikler veya proteinler kullanarak.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...