Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم MCB-2012074. يشكر المؤلفون الدكتور كريج دبليو فاندر كوي من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على المناقشات والدعم القيمين. كما يشكر المؤلفون الدكتور ماثيو س. جينتري من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على دعمه. نود أن نشكر الدكتورة سارة لاجالوار ، رئيسة برنامج علم الأعصاب في كلية سكيدمور ، على السماح لنا باستخدام ماسح اللطخة LICOR C-digit لتصوير البقع الغربية.

1. إعداد حبات ConA-Sepharose
<ol><li>اصنع 250 مل من مخزن مؤقت ملزم يحتوي على 67 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.5) و 10 مللي مول MgCl 2 و 0.2 مللي مول CaCl2. اضبط الأس الهيدروجيني باستخدام محلول 1 M NaOH.</li>
	<li>ماصة 250 ميكرولتر من تعليق حبة ConA-Sepharose في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي م?...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

توضح هذه الدراسة التطور الناجح لمقايسة ترسيب جديدة في المختبر تسمح بتحديد تقارب الارتباط لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان والجلوكان. يستفيد تصميم الفحص من الارتباط المحدد لليكتين كونا بالجلوكان عبر بقايا هيدروكسيل الجلوكوز لالتقاط ركائز الكربوهيدرات القابلة للذوبان بشكل غير مب?...

فوسفاتاز الجلوكان هي أعضاء في فصيلة فرعية متنوعة وظيفيا من الفوسفاتاز ثنائي الخصوصية (DSPs) داخل عائلة بروتين التيروزين الفوسفاتيز (PTP)1. تم العثور عليها في معظم أشكال الحياة ، بما في ذلك الكائنات الحية الضوئية المتباينة على نطاق واسع ، والبشر ، والفقاريات ، وبعض اللافقاريات والطلائعيات2،3،4. تحتوي النباتات على ثلاثة فوسفاتاز جلوكان معروفة: النشا الزائد 4 (SEX4) ، مثل الجنس four1 (LSF1) ، ومثل الجنس four2 (LSF2) 5،6،7. تظهر النباتات التي تفتقر إلى فوسفاتاز الجلوكان معدلات منخفضة من تدهور النشا المؤقت وتراكم النشا في الأوراق 8,9. لافورين هو العضو المؤسس لعائلة الفوسفاتيز الجلوكان التي تزيل الفسفوريلات الجليكوجين في الفقاريات والبشر 3,10. تؤدي طفرات اللافورين إلى مرض لافورا التنكسي العصبي ، وهو شكل صبغي جسدي متنحي قاتل من الصرع11. فوسفاتاز الجلوكان ضرورية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين والنشا وقد ظهرت كإنزيمات مهمة لتعديل محتوى النشا في النباتات وعلاج مرض لافورا التنكسي العصبي12,13. ألقت دراسات علم البلورات بالأشعة السينية الحديثة على فوسفاتاز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية الضوء على ارتباط الركيزة والآلية التحفيزية لإزالة فسفرة الجلوكان14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن الفهم الحالي لكيفية ارتباط فوسفاتاز الجلوكان بركائزها الفسيولوجية غير مكتمل.
النشا عبارة عن بوليمر غير قابل للذوبان من الجلوكوز مصنوع من 80٪ -90٪ أميلوبكتين و 10٪ -20٪ أميلوز18. ركائز فوسفاتاز الجلوكان النباتية هي جزيئات الكربوهيدرات المفسفرة ، مثل حبيبات الجليكوجين والنشا. توجد بقايا الجلوكوزيل المفسفرة عند نسبة 1: 600 فوسفات: بقايا الجلوكوزيل. ومن المثير للاهتمام أن الفوسفات موجود فقط على جزيئات الأميلوبكتين19. يعمل النبات الرئيسي جلوكان فوسفاتيز SEX4 على حبيبات النشا لإزالة الفسفرة من جزيئات الأميلوبكتين. أظهرت البنية البلورية للأشعة السينية ل SEX4 جنبا إلى جنب مع دراسات الطفرات الموجهة بالهيكل خصائص الركيزة الفريدة ل SEX4 لمواقع مختلفة داخل بنية جلوكان15. لقد أظهرنا مؤخرا أنه لا يمكن ملاحظة النشاط ذي الصلة بيولوجيا ل SEX4 إلا عند العمل على ركائز الأميلوبكتين القابلة للذوبان20. ومع ذلك ، فقد ثبت أن فهم تفاعلات glucan-SEX4 أمر صعب بسبب التعقيد الهيكلي للركيزة ، وخصائص الربط الأوسع ، والصلات المنخفضة بين البروتين وركائزه. وقد أعاقت هذه القضايا القدرة على استخدام الأساليب المستخدمة بشكل شائع في تفاعلات البروتين والليجند، مثل قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC)، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والمقايسات القائمة على مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
ومن المثير للاهتمام أن الكثير من فهمنا للتفاعلات بين الكربوهيدرات والبروتين قد جاء من دراسة المحاضرات. Concanavalin A (ConA) هي عائلة ليكتين من البقوليات من البروتينات المستخرجة أصلا من حبة جاك. يربط ConA الكربوهيدرات بخصوصية عالية ، وهو أمر مفيد لاستخدامه في تطبيقات استهداف الأدوية وتسليمها. تمت دراسة ارتباط ConA بمجموعة متنوعة من الركائز التي تحتوي على α-D-mannosyl غير المختزل و α-D-glucosyl على نطاق واسع19,20. تستخدم حبات السيفاروز المرتبطة ب ConA المتاحة تجاريا بشكل شائع لتنقية البروتينات السكرية والجليكوليبيدات21. يرتبط ConA بهذه الجلوكان عبر مجموعات هيدروكسيل C3 و C4 و C6 من بقايا الجلوكوز. كما تم استخدام حبات ConA-Sepharose بنجاح لقياس ارتباط تفاعلات بروتين الجليكوجين والنشاوالبروتين 22,23. في هذه الدراسة ، استخدمنا حبات ConA-Sepharose لتطوير مقايسة ملزمة لقياس خصائص الارتباط لتفاعلات الجلوكان فوسفاتيز والأميلوبكتين.
في السابق ، تم استخدام مقايسة الترسيب القائمة على ConA لتقييم قدرة ربط ركيزة الفوسفاتيزالجلوكان 14،20،24. في هذه الدراسة ، تم استخدام نفس الاستراتيجية لتطوير طريقة جديدة لتحديد تقارب الارتباط بين الفوسفاتيز الجلوكان وتفاعلات الكربوهيدرات. هذه الطريقة لها أيضا ميزة للتحقيق في مختلف تفاعلات الكربوهيدرات والبروتين القابلة للذوبان.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

تنتمي فوسفاتاز الجلوكان إلى عائلة أكبر من الفوسفاتاز ثنائية الخصوصية (DSP) التي تزيل الفسفور ركائز الجلوكان ، مثل الجليكوجين في الحيوانات والنشا في النباتات. تكشف الهياكل البلورية لفوسفاتيز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية عن واجهات ربط جلوكان مميزة مصنوعة من DSP ومجالات ربط الكربوهيدرات. ومع ذلك ، فإن القياسات الكمية لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان - الجلوكان مع الركائز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أساسية للفهم البيولوجي لعائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان وتنظيم استقلاب الطاقة. تشير هذه المخطوطة إلى اختبار ترسيب في المختبر قائم على Concanavalin A (ConA) مصمم للكشف عن تقارب ربط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان ضد ركائز الجلوكان المختلفة. كدليل على المفهوم ، تم تحديد ثابت التفكك (KD) لفوسفاتيز الجلوكان أرابيدوبسيس ثاليانا النشا الزائد 4 (SEX4) والأميلوبكتين. يوضح توصيف طفرات SEX4 والأعضاء الآخرين في عائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان فائدة هذا الفحص لتقييم الارتباط التفاضلي للتفاعلات بين البروتين والكربوهيدرات. توضح هذه البيانات مدى ملاءمة هذا الفحص لتوصيف مجموعة واسعة من البروتينات المتفاعلة مع النشا والجليكوجين.

واحدة من السمات الرئيسية لعائلة بروتينات الفوسفاتيز الجلوكان هي قدرتها على الارتباط بركائز الجلوكان. أولا ، تم تحليل قدرة ربط SEX4 ب ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين باستخدام SDS-PAGE (الشكل 2A). كان ألبومين مصل الأبقار (BSA) بمثابة عنصر تحكم سلبي للكشف عن أي ارتباط غير محدد للبروتينات ب?...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

تم تصميم مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على concanavalin A لقياس تقارب الارتباط لفوسفاتاز الجلوكان مقابل ركائز STA المختلفة. المعلومات التي نكتسبها من هذه الطريقة أساسية لفهمنا لعائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكانية. تفاعلات بروتين الكربوهيدرات ضعيفة نسبيا ، وبالتالي لا يمكن للطرق الحالية اكتشاف تفاعلات الفوسفاتيز والجلوكان الجلوكان.يمكن لمقايسة الترسيب القائمة على الليكتين أن تكتشف تقارب الارتباط في نطاق المليمول. يوضح توصيف طفرات SEX4 بالإضافة إلى أعضاء آخرين في عائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان قدرة هذا الفحص على تحديد تفاعلات الكربوهيدرات البروتينية. أحد أكثر الأجزاء تحديا في الفحص هو تحسين نطاق تركيز الركيزة.نوصي بالبدء بنطاق أوسع للحصول على فكرة ثم تضييق نطاق معين. للبدء ، ماصة 250 ميكرولتر من حبات ConA-sepharose معلقة في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي محتويات في 10،000 غرام لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية.بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت للربط إلى كل أنبوب يحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ConA-sepharose. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10،000 غرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية وإزالة طف. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيفات مزدوجة من محلول الأميلوبكتين القابل للذوبان لصنع سلسلة من محاليل الأميلوبكتين المخففة بملليلتر.لتحضير حبات الأميلوبكتين ConA-sepharose ، أضف 250 ميكرولترا من كل محلول أميلوبكتين مخفف إلى الأنابيب التي تحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ConA-sepharose العازلة المتوازنة والملزمة. امزج المحتويات جيدا وقم بتسمية الأنابيب بتركيز الأميلوبكتين المقابل. احتضان محتويات الأنبوب على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 10،000 جم لمدة دقيقة واحدة.امزج 250 ميكرولترا من حبات الأميلوبكتين ConA-sepharose مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط الذي يحتوي على 10 ميكروغرام من النشا الزائد أربعة ، أو بروتين SEX4 ، و 10 ملليمولار من ديثيوثريتول ، و 10 ميكرومولار من كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني. احتضان المحتويات عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة مع دوران لطيف. ثم أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10،000 G لمدة دقيقة واحدة وبعناية ماصة 50 ميكرولتر من طاف في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي microcentritailt.أضف 20 ميكرولترا من صبغة صفحة 4X SDS و 10 ميكرولترات من الماء المقطر إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولترا من الكسور الطافية المجمعة وقم بتسميتها على أنها S.وبالمثل ، أضف 20 ميكرولترا من صبغة صفحة 4X SDS و 80 ميكرولترا من الماء المقطر في الأنابيب التي تحتوي على حبات ConA-sepharose amylopectin SEX4 المغسولة. بعد إضافة الصبغة والماء ، سخني جميع العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بمجرد طرد حبات ConA-sepharose amylopectin SEX4 بالطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة دقيقة واحدة ، احفظ المادة الطافية وقم بتسميتها على أنها P.Load 40 ميكرولترا من عينات البروتين غير المنضمة المسمى S في 4 إلى 12٪ آبار جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب من أدنى تركيز للركيزة إلى الأعلى ، مع الاحتفاظ بالممر الأول لعلامة الوزن الجزيئي للبروتين.استخدم هلاما ثانيا لتحميل عينات البروتين المرتبطة بالجلوكان المسمى P.أضف صفحة SDS المعدة حديثا لتشغيل المخزن المؤقت لكلا حجرتي الجهاز وقم بتشغيل الجل عند 150 فولت لمدة 35 دقيقة أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل. ثم خذ كاسيت الجل من الجهاز وقم بإزالة الفواصل والألواح الزجاجية لفصل الجل لتحليل اللطخة الغربية. اصنع لترا واحدا من المخزن المؤقت للنقل يحتوي على 5.8 جرام من قاعدة تريس ، و 2.9 جرام من الجلايسين ، و 0.37 جرام من SDS ، و 200 ملليلتر من الميثانول.لنقل حجم البروتينات المنفصلة من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء النيتروسليلوز ، قم بتجميع الإسفنج وأوراق الترشيح والهلام وغشاء النيتروسليلوز وفقا لبروتوكول النقل الغربي وتشغيله عند 70 فولت لمدة ساعة واحدة. بعد تشغيل الجل ، احتضان غشاء النيتروسليلوز في محلول بروتين من 1 إلى 5٪ من ألبومين مصل الأبقار أو بروتين الحليب في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت TBST لمدة ساعة واحدة لمنع ارتباط البروتين غير المحدد. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت TBST لإزالة أي محلول مانع غير منضم.بعد ذلك ، احتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة مع الجسم المضاد المرتبط ببيروكسيديز الفجل المخفف المحدد للبروتين الموسوم بالهستدين. ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات في المخزن المؤقت TBST لإزالة أي أجسام مضادة غير منضمة. للتصوير الرقمي ، اصنع محلولا من أجزاء متساوية من محاليل الركيزة الكيميائية ، 750 ميكرولترا لكل منها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، واحتضان الغشاء لمدة خمس دقائق على الأقل في المحلول.ضع جانب البروتين الغشائي لأسفل على ماسح اللطخة وقم بتشغيل برنامج الاستحواذ لتحديد كمية البروتين في كل من الكسور الحبيبية والأجزاء الطافية. للحصول على البيانات ، ابدأ قياسات الإشارة الكمية باستخدام برنامج الاستحواذ مع ماسح اللطخة. تطبيع جميع القياسات الكمية في الأجزاء الطافية والحبيبات إلى إجمالي البروتين المحمل.في تجربة الربط المشبعة ، ارسم النسبة المئوية للبروتين المرتبط مقابل تركيز الأميلوبكتين وتناسب البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات لحساب ثابت التفكك ، Kd.تم تحليل قدرة ربط SEX4 بحبات الأميلوبكتين ConA-sepharose باستخدام صفحة SDS. لوحظ وجود بروتين SEX4 في جزء الحبيبات وألبومين مصل الأبقار في الجزء الطافي. ظهر W278A ، وهو متحولة SEX4 معروفة مع قدرة ربط جلوكان منخفضة بشكل كبير ، في الجزء الطافي ، مما يشير إلى فائدة وخصوصية هذا الفحص.كشف تحليل النشاف الغربي عن زيادة كبيرة في الكشف عن SEX4 والطريقة محددة للكشف عن فوسفات الجلوكان بعلامة الهستيدين الطرفية. تم اختبار مقايسة الترسيب بثلاثة تركيزات مختلفة من SEX4. في حين أن ميكروغرام من SEX4 يكفي للتصور من خلال الكشف عن التلألؤ الكيميائي ، فإن استخدام خمسة أو 10 ميكروغرام من SEX4 يسمح باكتشاف أكثر دقة.أيضا ، لوحظ زيادة ارتباط SEX4 مع زيادة تركيز الأميلوبكتين. تم تحديد تقارب الارتباط للأميلوبكتين والبروتين البري SEX4 بتركيزات مختلفة وأعطت بيانات النسبة المئوية المرتبطة بالبروتين لنموذج ربط موقع واحد محدد Kd حوالي 1.03 ملليغرام لكل ملليلتر. تم تقييم قابلية تطبيق هذه الطريقة لقياس ارتباط اللافورين و LSF2 والذرة SEX4 والبطاطس SEX4 ضد أميلوبكتين البطاطس.أظهرت النتائج أن البروتينات المختبرة من المحاصيل المهمة زراعيا مرتبطة أيضا بشكل تفاضلي بالأميلوكتين. من الأهمية بمكان أن نتذكر تطبيع جميع القياسات الكمية في الحبيبات والكسور الطافية إلى إجمالي البروتين المحمل. للتأكد من أن كل الأميلوبكتين مرتبط بالخرز ، احفظ الكسور الطافية لإجراء فحص الجلوكوز العميق لاحقا.يستخدم فوسفاتيز الجلوكان آليات متميزة لربط الكربوهيدرات وتحديد موقعها وإزالة الفسفرة. تسمح هذه الطريقة باستكشاف ارتباط فوسفاتيز الجلوكان بمجالات هيكلية مختلفة داخل معقدات بوليمرية كبيرة لإزالة الفسفرة الخاصة بالموضعي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...