Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af National Science Foundation-prisen MCB-2012074. Forfatterne takker Dr. Craig W. Vander Kooi fra University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology for værdifulde diskussioner og støtte. Forfatterne takker også Dr. Matthew S. Gentry fra University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology for hans støtte. Vi vil gerne takke Dr. Sara Lagalwar, formand for Skidmore College Neuroscience-programmet, for at give os mulighed for at bruge LICOR C-cifret blotscanner til western blot-billeddannelse.

1. Fremstilling af ConA-Sepharose perler
<ol><li>Der fremstilles 250 ml bindingsbuffer indeholdende 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 0,2 mMCaCl2. pH-værdien justeres ved hjælp af 1 M NaOH-opløsning.</li>
	<li>Pipette 250 μL ConA-Sepharose perlesuspension i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Indholdet centrifugeres ved 10.000 x g i 30 s ved 4 °C. Supernatanten kasseres. BEMÆRK: 250 μL ConA-Sepharose-perler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør er nødvendigt for hver ...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Denne undersøgelse demonstrerer den vellykkede udvikling af et nyt in vitro-sedimenteringsassay, der muliggør bestemmelse af bindingsaffiniteten af glucan-glucanphosphatase-interaktioner. Analysedesignet udnytter den specifikke binding af lectin ConA til glucaner via hydroxylresterne af glucose til indirekte at fange opløselige kulhydratsubstrater på Sepharose-perler. Dette muliggør adskillelse af bundne og ubundne proteinfraktioner via centrifugering og bestemmelse af bindingsaffiniteten ...

Glucanphosphataser er medlemmer af en funktionelt forskelligartet underfamilie af fosfataser med dobbelt specificitet (DSP'er) inden for proteintyrosinphosphatase (PTP) superfamilie1. De er fundet i de fleste livsformer, herunder vidt forskellige fotosyntetiske organismer, mennesker, hvirveldyr og nogle hvirvelløse dyr og protister 2,3,4. Planter indeholder tre kendte glucanphosphataser: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) og Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Planter, der mangler glucanphosphataser, viser nedsat nedbrydning af forbigående stivelse og akkumulering af stivelse i bladene 8,9. Laforin er grundlæggeren af glucanphosphatasefamilien, der dephosphorylerer glykogen hos hvirveldyr og mennesker 3,10. Mutationerne af laforin resulterer i neurodegenerativ Lafora sygdom, en dødelig autosomal recessiv form for epilepsi11. Glucanphosphataser er nødvendige for glykogen og stivelsesmetabolisme og har vist sig at være vigtige enzymer til modulering af stivelsesindhold i planter og behandling af neurodegenerativ Lafora sygdom12,13. Nylige røntgenkrystallografiundersøgelser af glucanphosphataser med model glucansubstrater har kastet lys over substratbinding og den katalytiske mekanisme for glucandephosphorylering14,15,16,17. Den nuværende forståelse af, hvordan glucanphosphataser binder sig til deres fysiologiske substrater, er imidlertid ufuldstændig.
Stivelse er en uopløselig polymer af glucose fremstillet af 80% -90% amylopectin og 10% -20% amylose18. Substraterne for planteglucanphosphataser er phosphorylerede kulhydratmolekyler, såsom glykogen og stivelsesgranulat. De fosforylerede glucosylrester er til stede ved et fosfat:glucosyl-restforhold på 1:600. Interessant nok er fosfaterne kun til stede på amylopectinmolekylerne19. Hovedplanten glucanphosphatase SEX4 virker på stivelsesgranulatet for at dephosphorylere amylopectinmolekyler. Røntgenkrystalstrukturen i SEX4 kombineret med strukturstyrede mutageneseundersøgelser har vist de unikke substratspecificiteter ved SEX4 for forskellige positioner inden for en glucanstruktur15. Vi viste for nylig, at den biologisk relevante aktivitet af SEX4 kun kan observeres, når den virker på dets opløselige amylopectinsubstrater20. Imidlertid har forståelse af glucan-SEX4-interaktioner vist sig at være vanskelig på grund af substratets strukturelle kompleksitet, bredere bindingsspecificiteter og lave bindingsaffiniteter mellem proteinet og dets substrater. Disse problemer har hindret evnen til at anvende metoder, der almindeligvis anvendes i protein-ligandinteraktioner, såsom isotermisk titreringskalorimetri (ITC), nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) -baserede assays.
Interessant nok er meget af vores forståelse af kulhydrat-protein-interaktioner kommet fra at studere lektiner. Concanavalin A (ConA) er en bælgplantelektinfamilie af proteiner, der oprindeligt blev ekstraheret fra jackbønnen. ConA binder kulhydrater med høj specificitet, hvilket er fordelagtigt for dets anvendelse i lægemiddelmålretning og leveringsapplikationer. Bindingen af ConA til en række substrater indeholdende ikke-reducerende α-D-mannosyl og α-D-glucosyl er blevet grundigt undersøgt19,20. Kommercielt tilgængelige ConA-bundne Sepharose-perler bruges almindeligvis til at rense glycoproteiner og glycolipider21. ConA binder sig til disse glucaner via C3-, C4- og C6-hydroxylgrupper af glucoseresterne. ConA-Sepharose-perler er også blevet anvendt med succes til at måle bindingen af glykogen-protein og stivelse-proteininteraktioner22,23. I denne undersøgelse brugte vi ConA-Sepharose-perler til at udvikle et bindingsassay til måling af bindingsspecificiteterne af glucanphosphatase-amylopectininteraktioner.
Tidligere blev et ConA-baseret sedimenteringsassay anvendt til at vurdere glucanphosphatasesubstratbindingsevne14,20,24. I denne undersøgelse blev den samme strategi brugt til at udvikle en ny metode til bestemmelse af bindingsaffiniteten af glucan-glucanphosphatase og kulhydratinteraktioner. Denne metode har også en fordel til at undersøge forskellige opløselige kulhydrat-proteininteraktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Glucanphosphataser tilhører den større familie af fosfataser med dobbelt specificitet (DSP), der dephosphorylerer glucansubstrater, såsom glykogen hos dyr og stivelse i planter. Krystalstrukturerne af glucanphosphatase med modelglucansubstrater afslører forskellige glucanbindende grænseflader lavet af DSP og kulhydratbindende domæner. Imidlertid er kvantitative målinger af glucan-glucanphosphatase-interaktioner med fysiologisk relevante substrater grundlæggende for den biologiske forståelse af glucanphosphatasefamilien af enzymer og reguleringen af energimetabolisme. Dette manuskript rapporterer et Concanavalin A (ConA)-baseret in vitro-sedimenteringsassay designet til at detektere glucanphosphatasers substratbindingsaffinitet mod forskellige glucansubstrater. Som et bevis på konceptet blev dissociationskonstanten (KD) for glucanphosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) og amylopectin bestemt. Karakteriseringen af SEX4-mutanter og andre medlemmer af glucanphosphatasefamilien af enzymer demonstrerer yderligere nytten af dette assay til at vurdere differentiel binding af protein-kulhydratinteraktioner. Disse data viser egnetheden af dette assay til at karakterisere en bred vifte af stivelses- og glykogeninteragerende proteiner.

Et af nøglefunktionerne i glucanphosphatasefamilien af proteiner er deres evne til at binde til glucansubstrater. For det første blev bindingskapaciteten af SEX4 til ConA-Sepharose: amylopectinperler analyseret ved hjælp af SDS-PAGE (figur 2A). Bovint serumalbumin (BSA) tjente som en negativ kontrol til påvisning af enhver uspecifik binding af proteiner til ConA-Sepharose:amylopectinperlerne. SDS-PAGE-analysen af proteiner viste tilstedeværelsen af SEX4-protein i pelletfraktionen og BSA...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Denne metode beskriver et lektinbaseret in vitro-sedimentationsassay til kvantificering af bindingsaffiniteten af glucanphosphatase og amylopectin. Dette co-sedimenteringsassay er pålideligt til måling af glucanphosphatasesubstratbinding og kan påføres forskellige opløselige glucansubstrater.

Concanavalin A-baseret sedimentationsassay til måling af substratbinding af glucanphosphataser

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Dette concanavalin A-baserede in vitro sedimenteringsassay er designet til at måle bindingsaffinitet af glucanphosphataser mod forskellige STA-substrater. De oplysninger, vi får fra denne metode, er grundlæggende for vores forståelse af glucanphosphatasefamilien af enzymer. Kulhydratproteininteraktioner er relativt svage, derfor kan nuværende metoder ikke detektere glucanphosphatase og glucaninteraktioner.Vores lektinbaserede cosedimentationsassay kan detektere bindingsaffinitet i millimolært område. Karakteriseringen af SEX4-mutanter såvel som andre medlemmer af glucanphosphatasefamilien af enzymer demonstrerer dette assays evne til at kvantificere proteinkulhydratinteraktioner. En af de mest udfordrende dele af analysen er at optimere substratets koncentrationsområde.Vi anbefaler, at du starter med et bredere interval for at få en idé og derefter indsnævrer til et bestemt interval. Til at begynde med, pipette 250 mikroliter ConA-sepharose perler suspension i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Centrifuger indholdet ved 10.000 G i 30 sekunder ved fire grader Celsius.Efter bortskaffelse af supernatanten tilsættes 750 mikroliter bindingsbuffer til hvert glas, der indeholder 250 mikroliter ConA-sepharoseperler. Centrifuger rørene ved 10.000 G i et minut ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Derefter fremstilles tofoldige fortyndinger af den opløselige amylopectinopløsning for at fremstille en serie på to milliliter fortyndede amylopectinopløsninger.For at forberede ConA-sepharose-amylopectinperlerne tilsættes 250 mikroliter af hver fortyndet amylopectinopløsning til rørene indeholdende 250 mikroliter ConA-sepharoseperler, præekvilibrerede og bindende buffere. Bland indholdet godt og mærk rørene med den tilsvarende amylopectinkoncentration. Inkuber rørindholdet på et roterende hjul ved fire grader Celsius i 30 minutter og centrifuger rørene ved 10.000 G i et minut.Bland 250 mikroliter ConA-sepharose amylopectinperler med 100 mikroliter bindingsbuffer indeholdende 10 mikrogram stivelsesoverskud fire eller SEX4-protein, 10 millimolar dithiothretol og 10 mikromolar proteasehæmmercocktail. Inkuber indholdet ved fire grader Celsius i 45 minutter med forsigtig rotation. Derefter centrifugeres glassene ved 10.000 G i et minut og afpipetteres forsigtigt 50 mikroliter supernatant i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugeglas.Tilsæt 20 mikroliter 4X SDS-sidefarvestof og 10 mikroliter destilleret vand til hvert rør, der indeholder 50 mikroliter af de opsamlede supernatantfraktioner, og mærk dem som S.Tilsvarende tilsættes 20 mikroliter 4X SDS-sidefarvestof og 80 mikroliter destilleret vand i rørene indeholdende vaskede ConA-sepharoseamylopectin SEX4-perler. Efter tilsætning af farvestof og vand opvarmes alle prøverne ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Når ConA-sepharose-amylopectin SEX4-perlerne er centrifugeret ved 10.000 G i et minut, skal du gemme supernatanten og mærke den som P.Load 40 mikroliter af de ubundne proteinprøver mærket som S i 4 til 12% præfabrikerede polyacrylamidgelbrønde fra den laveste substratkoncentration til den højeste, idet den første bane reserveres til en proteinmolekylvægtmarkør.Brug en anden gel til at indlæse de glucanbundne proteinprøver mærket P.Tilsæt frisklavet SDS-sideløbende buffer til begge kamre i apparatet, og kør gelen ved 150 volt i 35 minutter, eller indtil farvestoffronten når bunden af gelen. Tag derefter gelkassetten fra apparatet og fjern afstandsstykkerne og glaspladerne for at adskille gelen til western blot-analyse. Lav en liter overførselsbuffer indeholdende 5,8 gram trisbase, 2,9 gram glycin, 0,37 gram SDS og 200 ml methanol.For at overføre de størrelsesadskilte proteiner fra polyacrylamidgelen til en nitrocellulosemembran samles svampe, filterpapir, gel og nitrocellulosemembran i henhold til den vestlige overførselsprotokol og kører ved 70 volt i en time. Efter at have kørt gelen, inkuberes nitrocellulosemembranen i en proteinopløsning af 1 til 5% bovin serumalbumin eller mælkeprotein i 50 ml TBST-buffer i en time for at forhindre ikke-specifik proteinbinding. Membranen vaskes tre gange med TBST-buffer for at fjerne ubundet blokeringsopløsning.Derefter inkuberes membranen i en time med det fortyndede peberrodsperoxidasebundne antistof, der er specifikt for histidinmærket protein. Vask derefter membranen tre gange i TBST-buffer for at fjerne eventuelle ubundne antistoffer. Til digital billeddannelse fremstilles en opløsning af lige dele af kemiluminescerende substratopløsninger, 750 mikroliter hver i et 1,5 ml rør, og inkuber membranen i mindst fem minutter i opløsningen.Placer membranproteinsiden nedad på blotscanneren, og kør opkøbssoftwaren for at kvantificere proteinet i både pellet- og supernatantfraktionerne. For at hente dataene skal du starte de kvantitative signalmålinger ved hjælp af anskaffelsessoftwaren med blotscanneren. Alle kvantitative målinger i supernatant- og pelletfraktionerne normaliseres til det samlede proteinindhold.I det mættende bindingseksperiment plottes procentdelen af proteinbundet versus amylopektinkoncentration og passer dataene ved hjælp af dataanalysesoftware til beregning af dissociationskonstanten, Kd.Bindingskapaciteten af SEX4 til ConA-sepharose amylopectinperler blev analyseret ved hjælp af SDS-side. Der blev observeret tilstedeværelse af SEX4-protein i pelletfraktionen og bovin serumalbumin i supernatantfraktionen. W278A, en kendt SEX4-mutant med signifikant reduceret glucanbindingsevne, optrådte i supernatantfraktionen, hvilket indikerer anvendeligheden og specificiteten af dette assay.Western blotting-analyse afslørede en signifikant stigning i påvisningen af SEX4, og metoden er specifik til påvisning af glucanphosphater med et endeterminalhistidinmærke. Cosedimentationsanalysen blev testet ved tre forskellige SEX4-koncentrationer. Mens to mikrogram SEX4 er tilstrækkeligt til at visualisere gennem kemiluminescensdetektion, giver brug af fem eller 10 mikrogram SEX4 mulighed for mere nøjagtig detektion.Der blev også noteret øget SEX4-binding med øget amylopektinkoncentration. Bindingsaffiniteten af amylopectin og SEX4 vildtypeprotein ved forskellige koncentrationer blev bestemt, og de procentvise proteinbundne data til den specifikke bindingsmodel på et sted gav en Kd på ca. 1,03 milligram pr. milliliter. Anvendeligheden af denne metode til måling af bindingen af laforin, LSF2, majs SEX4 og kartoffel SEX4 mod kartoffelamylopectin blev vurderet.Resultaterne viste, at de testede proteiner fra agronomisk vigtige afgrøder også er forskelligt bundet til amylopectin. Det er afgørende at huske normaliseringen af alle kvantitative målinger i pellet- og supernatantfraktionerne til den samlede proteinbelastning. For at sikre, at alt amylopectin er bundet til perlerne, gemmes supernatantfraktionerne for at udføre dyb glukoseanalysen senere.Glucanphosphatase anvendes forskellige mekanismer til at binde, lokalisere og dephosphorylatkulhydrater. Denne metode muliggør udforskning af glucanphosphatases binding til forskellige strukturelle domæner inden for store polymere komplekser til positionsspecifik dephosphorylering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitative immunofluorescens foranstaltning globale lokaliseret Oversættelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...