Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation award MCB-2012074. De auteurs bedanken Dr. Craig W. Vander Kooi van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor waardevolle discussies en ondersteuning. De auteurs bedanken ook Dr. Matthew S. Gentry van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor zijn steun. We willen Dr. Sara Lagalwar, voorzitter van het Skidmore College Neuroscience-programma, bedanken voor het feit dat ze ons in staat heeft gesteld om de LICOR C-digit blot-scanner te gebruiken voor western blot-beeldvorming.

1. Bereiding van ConA-Sepharose kralen
<ol><li>Maak 250 ml van een bindingsbuffer met 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 en 0,2 mM CaCl2. Pas de pH aan met behulp van 1 M NaOH-oplossing.</li>
	<li>Pipetteer 250 μL ConA-Sepharose kraalsuspensie in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer de inhoud bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. OPMERKING: 250 μL ConA-Sepharose-kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml is nodig voor elke ...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Deze studie toont de succesvolle ontwikkeling van een nieuwe in vitro sedimentatietest waarmee de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase-interacties kan worden bepaald. Het testontwerp maakt gebruik van de specifieke binding van lectine ConA aan glucanen via de hydroxylresiduen van glucose om indirect opgeloste koolhydraatsubstraten op Sepharose-kralen te vangen. Dit maakt de scheiding van gebonden en ongebonden eiwitfracties via centrifugatie en bepaling van de bindingsaffiniteit van ...

Glucaanfosfatasen zijn leden van een functioneel diverse onderfamilie van duale specificiteitsfosfatasen (DSP's) binnen de eiwit tyrosinefosfatase (PTP) superfamilie1. Ze zijn gevonden in de meeste levensvormen, waaronder sterk uiteenlopende fotosynthetische organismen, mensen, gewervelde dieren en sommige ongewervelde dieren en protisten 2,3,4. Planten bevatten drie bekende glucaanfosfatasen: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) en Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Planten zonder glucaanfosfatasen vertonen een verminderde snelheid van tijdelijke zetmeelafbraak en ophoping van zetmeel in de bladeren 8,9. Laforin is de stichtende van de glucaanfosfatasefamilie die glycogeen defosforyleert bij gewervelde dieren en mensen 3,10. De mutaties van laforine resulteren in neurodegeneratieve ziekte van Lafora, een fatale autosomaal recessieve vorm van epilepsie11. Glucaanfosfatasen zijn nodig voor het glycogeen- en zetmeelmetabolisme en zijn naar voren gekomen als belangrijke enzymen voor het moduleren van het zetmeelgehalte in planten en de behandeling van neurodegeneratieve ziekte van Lafora12,13. Recente röntgenkristallografiestudies op glucaanfosfatasen met modelglucaansubstraten hebben licht geworpen op substraatbinding en het katalytische mechanisme van glucaandefosforylering14,15,16,17. Het huidige begrip van hoe glucaanfosfatasen binden aan hun fysiologische substraten is echter onvolledig.
Zetmeel is een onoplosbaar polymeer van glucose gemaakt van 80% -90% amylopectine en 10% -20% amylose18. De substraten voor plantaardige glucaanfosfatasen zijn gefosforyleerde koolhydraatmoleculen, zoals glycogeen- en zetmeelkorrels. De gefosforyleerde glucosylresiduen zijn aanwezig in een verhouding van 1:600 fosfaat:glucosylresidu. Interessant is dat de fosfaten alleen aanwezig zijn op de amylopectinemoleculen19. De belangrijkste plant glucaanfosfatase SEX4 werkt op de zetmeelkorrel om amylopectinemoleculen te defosforyleren. De röntgenkristalstructuur van SEX4 in combinatie met structuurgeleide mutagenesestudies heeft de unieke substraatspecificiteiten van SEX4 aangetoond voor verschillende posities binnen een glucaanstructuur15. We hebben onlangs aangetoond dat de biologisch relevante activiteit van SEX4 alleen kan worden waargenomen wanneer het inwerkt op de opgeloste amylopectinesubstraten20. Het begrijpen van glucaan-SEX4-interacties is echter moeilijk gebleken vanwege de structurele complexiteit van het substraat, bredere bindingsspecificaties en lage bindingsaffiniteiten tussen het eiwit en zijn substraten. Deze problemen hebben het vermogen belemmerd om methoden te gebruiken die vaak worden gebruikt in eiwit-ligandinteracties, zoals isothermische titratiecalorimetrie (ITC), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -gebaseerde assays.
Interessant is dat veel van ons begrip van koolhydraat-eiwitinteracties afkomstig is van het bestuderen van lectines. Concanavalin A (ConA) is een peulvrucht lectine familie van eiwitten oorspronkelijk geëxtraheerd uit de jack boon. ConA bindt koolhydraten met een hoge specificiteit, wat voordelig is voor het gebruik ervan in toepassingen voor het richten en afleveren van geneesmiddelen. De binding van ConA aan een verscheidenheid aan substraten die niet-reducerend α-D-mannosyl en α-D-glucosyl bevatten, is uitgebreid bestudeerd19,20. In de handel verkrijgbare ConA-gebonden Sepharose-kralen worden vaak gebruikt om glycoproteïnen en glycolipiden te zuiveren21. ConA bindt aan deze glucanen via C3-, C4- en C6-hydroxylgroepen van de glucoseresiduen. ConA-Sepharose kralen zijn ook met succes gebruikt om de binding van glycogeen-eiwit en zetmeel-eiwit interacties te meten22,23. In deze studie gebruikten we ConA-Sepharose-kralen om een bindingstest te ontwikkelen om de bindingsspecificiteiten van glucaanfosfatase-amylopectine-interacties te meten.
Eerder werd een op ConA gebaseerde sedimentatietest gebruikt om het bindingsvermogen van glucaanfosfatasesubstraat te beoordelen14,20,24. In deze studie werd dezelfde strategie gebruikt om een nieuwe methode te ontwikkelen om de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase en koolhydraatinteracties te bepalen. Deze methode heeft ook een voordeel voor het onderzoeken van verschillende opgeloste koolhydraat-eiwitinteracties.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Glucaanfosfatasen behoren tot de grotere familie van dual specificity phosfatases (DSP) die glucaansubstraten defosforyleren, zoals glycogeen bij dieren en zetmeel in planten. De kristalstructuren van glucaanfosfatase met modelglucaansubstraten onthullen verschillende glucaanbindende interfaces gemaakt van DSP- en koolhydraatbindende domeinen. Kwantitatieve metingen van glucaan-glucaanfosfatase-interacties met fysiologisch relevante substraten zijn echter fundamenteel voor het biologische begrip van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen en de regulatie van het energiemetabolisme. Dit manuscript rapporteert een op Concanavaline A (ConA) gebaseerde in vitro sedimentatietest die is ontworpen om de substraatbindingsaffiniteit van glucaanfosfatasen tegen verschillende glucaansubstraten te detecteren. Als proof of concept werd de dissociatieconstante (KD) van glucaanfosfatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) en amylopectine bepaald. De karakterisering van SEX4-mutanten en andere leden van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen toont verder het nut van deze test aan om de differentiële binding van eiwit-koolhydraatinteracties te beoordelen. Deze gegevens tonen de geschiktheid van deze test aan om een breed scala aan zetmeel- en glycogeeninteragerende eiwitten te karakteriseren.

Een van de belangrijkste kenmerken van de glucaanfosfatasefamilie van eiwitten is hun vermogen om te binden aan glucaansubstraten. Eerst werd de bindingscapaciteit van SEX4 aan ConA-Sepharose:amylopectine beads geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE (Figuur 2A). Runderserumalbumine (BSA) diende als een negatieve controle om niet-specifieke binding van eiwitten aan de ConA-Sepharose: amylopectine-kralen te detecteren. De SDS-PAGE analyse van eiwitten toonde de aanwezigheid van SEX4-eiwit in de ...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Deze concanavaline A-gebaseerde in vitro sedimentatietest is ontworpen om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatasen tegen verschillende STA-substraten te meten. De informatie die we met deze methode verkrijgen, is fundamenteel voor ons begrip van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen. Koolhydraateiwitinteracties zijn relatief zwak, daarom kunnen de huidige methoden geen glucaanfosfatase- en glucaaninteracties detecteren.Onze op lectine gebaseerde cosedimentatietest kan bindingsaffiniteit in het millimolaire bereik detecteren. De karakterisering van SEX4-mutanten en andere leden van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen toont het vermogen van deze test om eiwitkoolhydraatinteracties te kwantificeren. Een van de meest uitdagende onderdelen van de test is het optimaliseren van het concentratiebereik van het substraat.We raden aan om te beginnen met een breder bereik om een idee te krijgen en vervolgens te beperken voor een specifiek bereik. Om te beginnen, pipet 250 microliter ConA-sepharose kralen suspensie in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Centrifugeer de inhoud op 10.000 G gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.Voeg na het weggooien van het supernatant 750 microliter van de bindbuffer toe aan elke buis met 250 microliter ConA-sepharosekorrels. Centrifugeer de buizen op 10.000 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Bereid vervolgens tweevoudige verdunningen van de opgeloste amylopectine-oplossing om een reeks van twee milliliter verdunde amylopectine-oplossingen te maken.Om de ConA-sepharose amylopectine-kralen te bereiden, voegt u 250 microliter van elke verdunde amylopectine-oplossing toe aan de buizen met 250 microliter ConA-sepharosekralen die vooraf zijn gebalanceerd en binden. Meng de inhoud goed en label de buisjes met de bijbehorende amylopectineconcentratie. Incubeer de buisinhoud op een roterend wiel bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten en centrifugeer de buizen gedurende één minuut op 10.000 G.Meng 250 microliter ConA-sepharose amylopectine kralen met 100 microliter van de bindingsbuffer met 10 microgram zetmeel overmaat vier, of SEX4 eiwit, 10 millimolar van dithiothreitol, en 10 micromolar van protease inhibitor cocktail. Incubeer de inhoud bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten met zachte rotatie. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende één minuut op 10.000 G en pipetteer voorzichtig 50 microliter van het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Voeg 20 microliter 4X SDS-paginakleurstof en 10 microliter gedestilleerd water toe aan elke buis met 50 microliter van de verzamelde bovennatantfracties en label ze als S.Voeg op dezelfde manier 20 microliter 4X SDS-paginakleurstof en 80 microliter gedestilleerd water toe aan de buizen met gewassen ConA-sepharose amylopectine SEX4-kralen. Na het toevoegen van kleurstof en water, verwarm alle monsters op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Zodra de ConA-sepharose amylopectine SEX4-kralen gedurende één minuut bij 10.000 G zijn gecentrifugeerd, slaat u het supernatant op en labelt u het als P.Load 40 microliter van de ongebonden eiwitmonsters gelabeld als S in 4 tot 12% prefab polyacrylamidegelputten van de laagste substraatconcentratie tot de hoogste, waarbij de eerste rijstrook wordt gereserveerd voor een eiwitmoleculaire gewichtsmarker.Gebruik een tweede gel om de glucaan gebonden eiwitmonsters met het label P. Voeg vers voorbereide SDS-paginaloopbuffer toe aan beide kamers van het apparaat en laat de gel gedurende 35 minuten op 150 volt lopen of totdat de kleurstofvoorkant de bodem van de gel bereikt. Neem vervolgens de gelcassette uit het apparaat en verwijder de afstandhouders en glasplaten om de gel te scheiden voor western blot-analyse. Maak een liter transferbuffer met 5,8 gram trisbase, 2,9 gram glycine, 0,37 gram SDS en 200 milliliter methanol.Om de grootte gescheiden eiwitten van de polyacrylamidegel over te brengen naar een nitrocellulosemembraan, monteert u de sponzen, filterpapieren, gel en nitrocellulosemembraan volgens het westerse overdrachtsprotocol en draait u gedurende een uur op 70 volt. Na het uitvoeren van de gel, incubeer het nitrocellulosemembraan in een eiwitoplossing van 1 tot 5% runderserumalbumine of melkeiwit in 50 milliliter TBST-buffer gedurende één uur om niet-specifieke eiwitbinding te voorkomen. Was het membraan drie keer met behulp van TBST-buffer om eventuele niet-gebonden blokkerende oplossing te verwijderen.Incubeer vervolgens het membraan gedurende een uur met het verdunde mierikswortelperoxidase gekoppelde antilichaam dat specifiek is voor histidine gelabeld eiwit. Was vervolgens het membraan drie keer in TBST-buffer om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Maak voor digitale beeldvorming een oplossing van gelijke delen chemiluminescente substraatoplossingen, elk 750 microliter in een buis van 1,5 milliliter, en incuber het membraan gedurende ten minste vijf minuten in de oplossing.Plaats het membraaneiwit met de zijkant naar beneden op de vlekscanner en voer de acquisitiesoftware uit om het eiwit in zowel de pellet- als de bovennatuurlijke fractie te kwantificeren. Om de gegevens te verkrijgen, start u de kwantitatieve signaalmetingen met behulp van de acquisitiesoftware met de blotscanner. Normaliseer alle kwantitatieve metingen in de supernatant- en pelletfracties tot het totale eiwit dat geladen is.In het verzadigingsbindingsexperiment wordt het percentage eiwitgebonden versus amylopectineconcentratie uitgezet en passen de gegevens toe met behulp van data-analysesoftware om de dissociatieconstante, Kd, te berekenen.De bindingscapaciteit van SEX4 aan ConA-sepharose amylopectine-kralen werd geanalyseerd met behulp van de SDS-pagina. De aanwezigheid van SEX4-eiwit in de pelletfractie en runderserumalbumine in de bovennatuurfractie werd opgemerkt. W278A, een bekende SEX4-mutant met een significant verminderd glucaanbindingsvermogen, verscheen in de bovennatuurlijke fractie, wat het nut en de specificiteit van deze test aangeeft.Western blotting-analyse onthulde een significante toename in de detectie van SEX4 en de methode is specifiek voor het detecteren van glucaanfosfaten met een eindterminale histidine-tag. De cosedimentatietest werd getest bij drie verschillende SEX4-concentraties. Hoewel twee microgram SEX4 voldoende is om te visualiseren door middel van chemiluminescentiedetectie, zorgt het gebruik van vijf of 10 microgram SEX4 voor een nauwkeurigere detectie.Ook werd een verhoogde SEX4-binding met een verhoogde amylopectineconcentratie waargenomen. De bindingsaffiniteit van amylopectine en SEX4 wild type eiwit bij verschillende concentraties werd bepaald en de procentuele eiwitgebonden gegevens aan het specifieke one site binding model gaven een Kd van ongeveer 1,03 milligram per milliliter. De toepasbaarheid van deze methode voor het meten van de binding van laforine, LSF2, maïs SEX4 en aardappel SEX4 tegen aardappelamylopectine werd beoordeeld.De resultaten toonden aan dat de geteste eiwitten uit agronomisch belangrijke gewassen ook differentieel gebonden zijn aan amylopectine. Het is cruciaal om de normalisatie van alle kwantitatieve metingen in de pellet- en bovennatuurlijke fracties tot de totale eiwitbelasting te onthouden. Om ervoor te zorgen dat alle amylopectine aan de kralen is gebonden, slaat u de bovennatuurlijke fracties op om de diepe glucosetest later uit te voeren.Glucaanfosfatase wordt gebruikt verschillende mechanismen om koolhydraten te binden, lokaliseren en defosforyleren. Deze methode maakt het mogelijk om de binding van glucaanfosfatase aan verschillende structurele domeinen binnen grote polymere complexen te onderzoeken voor positiespecifieke defosforylering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...