Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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Cette étude a été soutenue par le prix MCB-2012074 de la National Science Foundation. Les auteurs remercient le Dr Craig W. Vander Kooi du Département de biochimie et de biologie moléculaire de l’Université de Floride pour ses précieuses discussions et son soutien. Les auteurs remercient également le Dr Matthew S. Gentry du Département de biochimie et de biologie moléculaire de l’Université de Floride pour son soutien. Nous tenons à remercier la Dre Sara Lagalwar, présidente du programme de neurosciences du Collège Skidmore, de nous avoir permis d’utiliser le scanner par transfert C LICOR pour l’imagerie par transfert Western.

1. Préparation des billes de ConA-Sepharose
<ol><li>Fabriquer 250 mL d’un tampon liant contenant 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 et 0,2 mM CaCl2. Ajuster le pH à l’aide d’une solution de NaOH 1 M.</li>
	<li>Pipeter 250 μL de suspension de billes ConA-Sepharose dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger le contenu à 10 000 x g pendant 30 s à 4 °C. Jetez le surnageant. REMARQUE : 250 μL de billes de ConA-Sepharose dans un tube microcentrifuge de...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Cette étude démontre le développement réussi d’un nouveau test de sédimentation in vitro qui permet de déterminer l’affinité de liaison des interactions glucane-glucane phosphatase. La conception du dosage tire parti de la liaison spécifique de la lectine ConA aux glucanes via les résidus hydroxyles du glucose pour capturer indirectement les substrats glucidiques solubilisés sur les billes de sépharose. Cela permet la séparation des fractions protéiques liées et non liées par...

Les phosphatases glucanes sont membres d’une sous-famille fonctionnellement diversifiée de phosphatases à double spécificité (DSP) au sein de la superfamille1 de la protéine tyrosine phosphatase (PTP). Ils ont été trouvés dans la plupart des formes de vie, y compris les organismes photosynthétiques très divergents, les humains, les vertébrés et certains invertébrés et protistes 2,3,4. Les plantes contiennent trois phosphatases glucanes connues : Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) et Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Les plantes dépourvues de phosphatases glucanes présentent une diminution des taux de dégradation transitoire de l’amidon et d’accumulation d’amidon dans les feuilles 8,9. La laforine est le membre fondateur de la famille des phosphatases glucanes qui déphosphoryle le glycogène chez les vertébrés et les humains 3,10. Les mutations de la laforine entraînent la maladie neurodégénérative de Lafora, une forme autosomique récessive mortelle de l’épilepsie11. Les phosphatases glucanes sont nécessaires au métabolisme du glycogène et de l’amidon et sont apparues comme des enzymes importantes pour moduler la teneur en amidon des plantes et traiter la maladie neurodégénérative de Lafora12,13. Des études récentes de cristallographie aux rayons X sur des phosphatases de glucane avec des substrats de glucane modèles ont mis en lumière la liaison du substrat et le mécanisme catalytique de la déphosphorylation du glucane14,15,16,17. Cependant, la compréhension actuelle de la façon dont les phosphatases glucanes se lient à leurs substrats physiologiques est incomplète.
L’amidon est un polymère insoluble de glucose composé de 80% à 90% d’amylopectine et de 10% à 20% d’amylose18. Les substrats des phosphatases de glucane végétaux sont des molécules de glucides phosphorylés, telles que le glycogène et les granules d’amidon. Les résidus de glucosyle phosphorylés sont présents à un rapport phosphate:glucosyl de 1:600. Fait intéressant, les phosphates ne sont présents que sur les molécules d’amylopectine19. La plante principale glucane phosphatase SEX4 agit sur le granule d’amidon pour déphosphoryler les molécules d’amylopectine. La structure cristalline en rayons X de SEX4 combinée à des études de mutagénèse guidée par la structure a démontré les spécificités uniques du substrat de SEX4 pour différentes positions au sein d’une structure de glucane15. Nous avons récemment montré que l’activité biologiquement pertinente de SEX4 ne peut être observée que lorsqu’elle agit sur ses substrats d’amylopectine solubilisés20. Cependant, la compréhension des interactions glucane-SEX4 s’est avérée difficile en raison de la complexité structurelle du substrat, des spécificités de liaison plus larges et des faibles affinités de liaison entre la protéine et ses substrats. Ces problèmes ont entravé la capacité d’utiliser des méthodes couramment utilisées dans les interactions protéine-ligand, telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et les tests basés sur des tests immuno-enzymatiques (ELISA).
Fait intéressant, une grande partie de notre compréhension des interactions glucides-protéines provient de l’étude des lectines. La concanavaline A (ConA) est une famille de lectines de légumineuses extraites à l’origine du haricot jacquier. ConA lie les glucides avec une spécificité élevée, ce qui est avantageux pour son utilisation dans les applications de ciblage et d’administration de médicaments. La liaison de ConA à une variété de substrats contenant du α-D-mannosyl non réducteur et du α-D-glucosyl a été largement étudiée19,20. Les billes de sépharose liées à ConA disponibles dans le commerce sont couramment utilisées pour purifier les glycoprotéines et les glycolipides21. ConA se lie à ces glucanes via les groupes hydroxyles C3, C4 et C6 des résidus de glucose. Les billes ConA-Sepharose ont également été utilisées avec succès pour mesurer la liaison des interactions glycogène-protéine et amidon-protéine22,23. Dans cette étude, nous avons utilisé des billes ConA-Sepharose pour développer un test de liaison afin de mesurer les spécificités de liaison des interactions phosphatase-amylopectine glucane.
Auparavant, un test de sédimentation basé sur ConA a été utilisé pour évaluer la capacité de liaison du substrat de la phosphataseglucane 14,20,24. Dans cette étude, la même stratégie a été utilisée pour développer une nouvelle méthode permettant de déterminer l’affinité de liaison de la phosphatase glucane-glucane et des interactions glucidiques. Cette méthode présente également un avantage pour étudier diverses interactions glucides-protéines solubilisées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Les phosphatases glucanes appartiennent à la grande famille des phosphatases à double spécificité (DSP) qui déphosphorylent les substrats de glucanes, tels que le glycogène chez les animaux et l’amidon chez les plantes. Les structures cristallines de la phosphatase glucane avec des substrats de glucane modèles révèlent des interfaces distinctes de liaison au glucane constituées de domaines DSP et de liaison aux glucides. Cependant, les mesures quantitatives des interactions de la phosphatase glucane-glucane avec des substrats physiologiquement pertinents sont fondamentales pour la compréhension biologique de la famille des enzymes phosphatases glucane et la régulation du métabolisme énergétique. Ce manuscrit rapporte un essai de sédimentation in vitro basé sur la concanavaline A (ConA) conçu pour détecter l’affinité de liaison au substrat des phosphatases glucanes contre différents substrats de glucanes. Comme preuve de concept, la constante de dissociation (KD) de la phosphatase glucane Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) et de l’amylopectine a été déterminée. La caractérisation des mutants SEX4 et d’autres membres de la famille des enzymes phosphatases glucane démontre une fois de plus l’utilité de ce test pour évaluer la liaison différentielle des interactions protéine-glucides. Ces données démontrent la pertinence de ce test pour caractériser une large gamme de protéines interagissant avec l’amidon et le glycogène.

L’une des principales caractéristiques de la famille des protéines de la phosphatase glucane est leur capacité à se lier aux substrats de glucanes. Tout d’abord, la capacité de liaison de SEX4 aux billes de ConA-Sepharose:amylopectine a été analysée à l’aide de SDS-PAGE (Figure 2A). L’albumine sérique bovine (BSA) a servi de témoin négatif pour détecter toute liaison non spécifique des protéines aux billes ConA-Sépharose:amylopectine. L’analyse SDS-PAGE des protéin...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Cette méthode décrit un essai de sédimentation in vitro à base de lectine pour quantifier l’affinité de liaison de la phosphatase glucane et de l’amylopectine. Ce test de co-sédimentation est fiable pour mesurer la liaison du substrat de la phosphatase glucane et peut être appliqué à divers substrats de glucane solubilisés.

Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Ce test de sédimentation in vitro à base de concanavaline A est conçu pour mesurer l’affinité de liaison des phosphatases glucanes contre différents substrats STA. L’information que nous obtenons de cette méthode est fondamentale pour notre compréhension de la famille des enzymes de la phosphatase glucane. Les interactions entre les protéines glucidiques sont relativement faibles, de sorte que les méthodes actuelles ne peuvent pas détecter les interactions entre la phosphatase glucane et le glucane.Notre test de cosédimentation à base de lectine peut détecter l’affinité de liaison dans la gamme millimolaire. La caractérisation des mutants SEX4 ainsi que d’autres membres de la famille des enzymes phosphatases glucanes démontre la capacité de ce test à quantifier les interactions entre les protéines glucidiques. L’une des parties les plus difficiles du test consiste à optimiser la plage de concentration du substrat.Nous vous recommandons de commencer par une gamme plus large pour vous faire une idée, puis de réduire pour une gamme spécifique. Pour commencer, pipeter 250 microlitres de suspension de billes de ConA-sépharose dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Centrifuger le contenu à 10 000 G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius.Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 750 microlitres du tampon de liaison à chaque tube contenant 250 microlitres de billes de ConA-sépharose. Centrifuger les tubes à 10 000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant. Ensuite, préparez deux dilutions de la solution d’amylopectine solubilisée pour obtenir une série de solutions d’amylopectine diluées de deux millilitres.Pour préparer les billes d’amylopectine ConA-sépharose, ajouter 250 microlitres de chaque solution d’amylopectine diluée aux tubes contenant 250 microlitres de billes de ConA-sépharose prééquilibrées et tampon de liaison. Bien mélanger le contenu et étiqueter les tubes avec la concentration d’amylopectine correspondante. Incuber le contenu du tube sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes et centrifuger les tubes à 10 000 G pendant une minute.Mélanger 250 microlitres de billes d’amylopectine ConA-sépharose avec 100 microlitres du tampon de liaison contenant 10 microgrammes d’amidon en excès quatre, ou protéine SEX4, 10 millimolaires de dithiothréitol et 10 micromolaires de cocktail inhibiteur de protéase. Incuber le contenu à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes en tournant doucement. Ensuite, centrifugez les tubes à 10 000 G pendant une minute et pipettez soigneusement 50 microlitres du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Ajoutez 20 microlitres de colorant de page 4X SDS et 10 microlitres d’eau distillée à chaque tube contenant 50 microlitres des fractions surnageantes collectées et étiquetez-les comme S.De même, ajoutez 20 microlitres de colorant de page 4X SDS et 80 microlitres d’eau distillée dans les tubes contenant des billes d’amylopectine ConA-sépharose SEX4 lavées. Après avoir ajouté du colorant et de l’eau, chauffer tous les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois que les billes d’amylopectine SEX4 de ConA-sépharose sont centrifugées à 10 000 G pendant une minute, conservez le surnageant et étiquetez-le comme P.Chargez 40 microlitres des échantillons de protéines non liés étiquetés comme S dans 4 à 12% de puits de gel de polyacrylamide préfabriqué de la concentration de substrat la plus faible à la plus élevée, en réservant la première voie pour un marqueur de poids moléculaire de la protéine.Utilisez un deuxième gel pour charger les échantillons de protéines liées au glucane étiquetés P.Ajouter un tampon de page SDS fraîchement préparé aux deux chambres de l’appareil et faire fonctionner le gel à 150 volts pendant 35 minutes ou jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel. Ensuite, retirez la cassette de gel de l’appareil et retirez les entretoises et les plaques de verre pour séparer le gel pour l’analyse par transfert Western. Faites un litre de tampon de transfert contenant 5,8 grammes de tris base, 2,9 grammes de glycine, 0,37 grammes de FDS et 200 millilitres de méthanol.Pour transférer les protéines séparées par la taille du gel de polyacrylamide à une membrane de nitrocellulose, assemblez les éponges, les papiers filtres, le gel et la membrane de nitrocellulose selon le protocole de transfert Western et faites fonctionner à 70 volts pendant une heure. Après avoir fait couler le gel, incuber la membrane de nitrocellulose dans une solution protéique de 1 à 5% d’albumine sérique bovine ou de protéines de lait dans 50 millilitres de tampon TBST pendant une heure pour éviter la liaison aux protéines non spécifiques. Lavez la membrane trois fois à l’aide d’un tampon TBST pour éliminer toute solution bloquante non liée.Ensuite, incuber la membrane pendant une heure avec l’anticorps dilué lié à la peroxydase de raifort spécifique de la protéine marquée à l’histidine. Ensuite, lavez la membrane trois fois dans un tampon TBST pour éliminer tous les anticorps non liés. Pour l’imagerie numérique, fabriquez une solution de parties égales de solutions de substrat chimiluminescentes, 750 microlitres chacune dans un tube de 1,5 millilitre, et incuber la membrane pendant au moins cinq minutes dans la solution.Placez le côté de la protéine membranaire vers le bas sur le scanner de transfert et exécutez le logiciel d’acquisition pour quantifier la protéine dans les fractions de granulés et de surnageants. Pour acquérir les données, démarrez les mesures quantitatives du signal à l’aide du logiciel d’acquisition avec le scanner de transfert. Normaliser toutes les mesures quantitatives dans les fractions surnageantes et granulées à la protéine totale chargée.Dans l’expérience de liaison saturante, tracer le pourcentage de protéines liées à la concentration d’amylopectine et ajuster les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données pour calculer la constante de dissociation, Kd.La capacité de liaison de SEX4 aux billes d’amylopectine ConA-sépharose a été analysée à l’aide de la page SDS. La présence de la protéine SEX4 dans la fraction granulée et de l’albumine sérique bovine dans la fraction surnageante a été notée. W278A, un mutant SEX4 connu avec une capacité de liaison au glucane significativement réduite, est apparu dans la fraction surnageante, indiquant l’utilité et la spécificité de ce test.L’analyse Western blot a révélé une augmentation significative de la détection de SEX4 et la méthode est spécifique pour détecter les phosphates de glucane avec une étiquette histidine terminale terminale. Le test de cosédimentation a été testé à trois concentrations SEX4 différentes. Alors que deux microgrammes de SEX4 sont suffisants pour visualiser par détection par chimiluminescence, l’utilisation de cinq ou 10 microgrammes de SEX4 permet une détection plus précise.En outre, une augmentation de la liaison SEX4 avec une concentration accrue d’amylopectine a été notée. L’affinité de liaison de l’amylopectine et de la protéine de type sauvage SEX4 à différentes concentrations a été déterminée et les données liées au pourcentage de protéines au modèle spécifique de liaison à un site ont donné un Kd d’environ 1,03 milligramme par millilitre. L’applicabilité de cette méthode pour mesurer la liaison de la laforine, du LSF2, du maïs SEX4 et de la pomme de terre SEX4 à l’amylopectine de pomme de terre a été évaluée.Les résultats ont démontré que les protéines testées provenant de cultures importantes sur le plan agronomique sont également liées différemment à l’amylopectine. Il est crucial de se rappeler la normalisation de toutes les mesures quantitatives dans les fractions granulées et surnageantes à la protéine totale chargée. Pour vous assurer que toute l’amylopectine est liée aux billes, conservez les fractions surnageantes pour effectuer le test de glucose profond plus tard.La phosphatase glucane est utilisée par des mécanismes distincts pour lier, localiser et déphosphoryler les glucides. Cette méthode permet d’explorer la liaison de la phosphatase glucane à différents domaines structuraux au sein de grands complexes polymères pour la déphosphorylation spécifique à la position.

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