Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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Diese Studie wurde durch den Preis der National Science Foundation MCB-2012074 unterstützt. Die Autoren danken Dr. Craig W. Vander Kooi vom Department of Biochemistry and Molecular Biology der University of Florida für wertvolle Gespräche und Unterstützung. Die Autoren danken auch Dr. Matthew S. Gentry vom Department of Biochemistry and Molecular Biology der University of Florida für seine Unterstützung. Wir bedanken uns bei Dr. Sara Lagalwar, Vorsitzende des Neurowissenschaftsprogramms des Skidmore College, für die Erlaubnis, den LICOR C-Digit-Blot-Scanner für die Western-Blot-Bildgebung zu verwenden.

1. Herstellung von ConA-Sepharose-Kügelchen
<ol><li>Stellen Sie 250 ml eines Bindepuffers her, der 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mMMgCl2 und 0,2 mM CaCl2enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH-Lösung ein.</li>
	<li>Pipettieren Sie 250 μl ConA-Sepharose-Bead-Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 10.000 x g für 30 s bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. HINWEIS: Für jede für den Assay verwendete Amylopektinkonze...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Diese Arbeit demonstriert die erfolgreiche Entwicklung eines neuartigen in vitro Sedimentationsassays, der die Bestimmung der Bindungsaffinität von Glucan-Glucan-Phosphatase-Interaktionen ermöglicht. Das Assay-Design nutzt die spezifische Bindung von Lektin ConA an Glucane über die Hydroxylreste der Glukose, um gelöste Kohlenhydratsubstrate indirekt auf Sepharose-Beads einzufangen. Dies ermöglicht die Trennung von gebundenen und ungebundenen Proteinfraktionen durch Zentrifugation und Besti...

Glucan-Phosphatasen sind Mitglieder einer funktionell vielfältigen Unterfamilie von Dual-Spezifitäts-Phosphatasen (DSPs) innerhalb der Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTP)-Superfamilie1. Sie wurden in den meisten Lebensformen gefunden, einschließlich sehr unterschiedlicher photosynthetischer Organismen, Menschen, Wirbeltieren und einigen wirbellosen Tieren und Protisten 2,3,4. Pflanzen enthalten drei bekannte Glucan-Phosphatasen: Stärkeüberschuss4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) und Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Pflanzen, denen Glucanphosphatasen fehlen, zeigen eine verringerte Rate des vorübergehenden Stärkeabbaus und der Anreicherung von Stärke in den Blättern 8,9. Laforin ist das Gründungsmitglied der Glucan-Phosphatase-Familie, die Glykogen bei Wirbeltieren und Menschen dephosphoryliert 3,10. Die Mutationen von Laforin führen zur neurodegenerativen Lafora-Krankheit, einer tödlich verlaufenden autosomal-rezessiven Form der Epilepsie11. Glucanphosphatasen sind für den Glykogen- und Stärkestoffwechsel notwendig und haben sich als wichtige Enzyme für die Modulation des Stärkegehalts in Pflanzen und die Behandlung der neurodegenerativen Lafora-Krankheit herauskristallisiert12,13. Neuere Röntgenkristallographie-Untersuchungen an Glucanphosphatasen mit Modell-Glucan-Substraten haben Aufschluss über die Substratbindung und den katalytischen Mechanismus der Glucan-Dephosphorylierunggegeben 14,15,16,17. Das derzeitige Verständnis darüber, wie Glucanphosphatasen an ihre physiologischen Substrate binden, ist jedoch unvollständig.
Stärke ist ein unlösliches Glukosepolymer, das zu 80%-90% aus Amylopektin und zu 10%-20% aus Amylosebesteht 18. Die Substrate für pflanzliche Glucanphosphatasen sind phosphorylierte Kohlenhydratmoleküle wie Glykogen- und Stärkekörner. Die phosphorylierten Glucosylreste liegen in einem Phosphat:Glucosyl-Restverhältnis von 1:600 vor. Interessanterweise sind die Phosphate nur auf den Amylopektinmolekülen19 vorhanden. Die pflanzliche Haupt-Glucan-Phosphatase SEX4 wirkt auf die Stärkekörner, um Amylopektinmoleküle zu dephosphorylieren. Die Röntgenkristallstruktur von SEX4 in Kombination mit strukturgesteuerten Mutagenesestudien hat die einzigartigen Substratspezifitäten von SEX4 für verschiedene Positionen innerhalb einer Glucanstruktur gezeigt15. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die biologisch relevante Aktivität von SEX4 nur beobachtet werden kann, wenn es auf seine solubilisierten Amylopektinsubstrateeinwirkt 20. Das Verständnis der Glucan-SEX4-Wechselwirkungen hat sich jedoch aufgrund der strukturellen Komplexität des Substrats, der breiteren Bindungsspezifität und der geringen Bindungsaffinitäten zwischen dem Protein und seinen Substraten als schwierig erwiesen. Diese Probleme haben die Fähigkeit behindert, Methoden zu nutzen, die üblicherweise in Protein-Ligand-Interaktionen verwendet werden, wie z. B. die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und ELISA-basierte Assays (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
Interessanterweise stammt ein Großteil unseres Verständnisses der Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen aus der Untersuchung von Lektinen. Concanavalin A (ConA) ist eine Familie von Leguminosen-Lektinen, die ursprünglich aus der Jackbohne gewonnen wurden. ConA bindet Kohlenhydrate mit hoher Spezifität, was für den Einsatz in Drug-Targeting- und Drug-Delivery-Anwendungen von Vorteil ist. Die Bindung von ConA an eine Vielzahl von Substraten, die nicht-reduzierendes α-D-Mannosyl und α-D-Glucosyl enthalten, wurde umfassend untersucht19,20. Kommerziell erhältliche ConA-gebundene Sepharose-Kügelchen werden üblicherweise zur Reinigung von Glykoproteinen und Glykolipiden verwendet21. ConA bindet an diese Glucane über C3-, C4- und C6-Hydroxylgruppen der Glukosereste. ConA-Sepharose-Beads wurden auch erfolgreich verwendet, um die Bindung von Glykogen-Protein- und Stärke-Protein-Wechselwirkungen zu messen22,23. In dieser Studie haben wir ConA-Sepharose-Beads verwendet, um einen Bindungsassay zu entwickeln, um die Bindungsspezifität von Glucan-Phosphatase-Amylopektin-Interaktionen zu messen.
Zuvor wurde ein ConA-basierter Sedimentationsassay verwendet, um die Bindungsfähigkeit des Glucanphosphatase-Substrats zu beurteilen14,20,24. In dieser Arbeit wurde die gleiche Strategie verwendet, um eine neuartige Methode zur Bestimmung der Bindungsaffinität von Glucan-Glucan-Phosphatase- und Kohlenhydrat-Interaktionen zu entwickeln. Diese Methode hat auch einen Vorteil für die Untersuchung verschiedener solubilisierter Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Glucan-Phosphatasen gehören zur größeren Familie der Dual-Spezifity-Phosphatasen (DSP), die Glucansubstrate wie Glykogen bei Tieren und Stärke bei Pflanzen dephosphorylieren. Die Kristallstrukturen der Glucan-Phosphatase mit Modell-Glucan-Substraten zeigen unterschiedliche Glucan-bindende Grenzflächen aus DSP- und Kohlenhydrat-bindenden Domänen. Quantitative Messungen von Glucan-Glucan-Phosphatase-Wechselwirkungen mit physiologisch relevanten Substraten sind jedoch grundlegend für das biologische Verständnis der Glucan-Phosphatase-Enzymfamilie und die Regulation des Energiestoffwechsels. Dieses Manuskript berichtet über einen Concanavalin A (ConA)-basierten in vitro Sedimentationsassay, der entwickelt wurde, um die Substratbindungsaffinität von Glucanphosphatasen gegen verschiedene Glucansubstrate nachzuweisen. Als Proof of Concept wurde die Dissoziationskonstante (KD) der Glucanphosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) und Amylopektin bestimmt. Die Charakterisierung von SEX4-Mutanten und anderen Mitgliedern der Glucan-Phosphatase-Familie von Enzymen demonstriert die Nützlichkeit dieses Assays zur Beurteilung der differentiellen Bindung von Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen. Diese Daten zeigen die Eignung dieses Assays zur Charakterisierung eines breiten Spektrums von Stärke- und Glykogen-interagierenden Proteinen.

Eines der Hauptmerkmale der Glucan-Phosphatase-Proteinfamilie ist ihre Fähigkeit, an Glucansubstrate zu binden. Zunächst wurde die Bindungskapazität von SEX4 an ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 2A). Rinderserumalbumin (BSA) diente als Negativkontrolle, um eine unspezifische Bindung von Proteinen an die ConA-Sepharose:Amylopektin-Kügelchen nachzuweisen. Die SDS-PAGE-Analyse von Proteinen zeigte das Vorhandensein von SEX4-Protein in der Pelletfraktion...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Diese Methode beschreibt einen lektinbasierten in vitro Sedimentationsassay zur Quantifizierung der Bindungsaffinität von Glucanphosphatase und Amylopektin. Dieser Co-Sedimentations-Assay ist zuverlässig für die Messung der Glucan-Phosphatase-Substratbindung und kann auf verschiedene solubilisierte Glucan-Substrate angewendet werden.

Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Dieser Concanavalin-A-basierte In-vitro-Sedimentationsassay wurde entwickelt, um die Bindungsaffinität von Glucanphosphatasen gegen verschiedene STA-Substrate zu messen. Die Informationen, die wir aus dieser Methode gewinnen, sind grundlegend für unser Verständnis der Glucan-Phosphatase-Enzymfamilie. Die Wechselwirkungen zwischen Kohlenhydratproteinen sind relativ schwach, so dass die derzeitigen Methoden die Wechselwirkungen zwischen Glucanphosphatase und Glucan nicht nachweisen können.Unser lektinbasierter Cosedimentationsassay kann eine Bindungsaffinität im millimolaren Bereich nachweisen. Die Charakterisierung von SEX4-Mutanten sowie anderen Mitgliedern der Glucan-Phosphatase-Familie von Enzymen demonstriert die Fähigkeit dieses Assays, Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen zu quantifizieren. Einer der schwierigsten Teile des Assays besteht darin, den Konzentrationsbereich des Substrats zu optimieren.Wir empfehlen, mit einem breiteren Bereich zu beginnen, um sich ein Bild zu machen, und dann auf einen bestimmten Bereich einzugrenzen. Pipettieren Sie zunächst 250 Mikroliter ConA-Sepharose-Beads-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 10.000 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, geben Sie 750 Mikroliter des Bindungspuffers in jedes Röhrchen mit 250 Mikrolitern ConA-Sepharose-Kügelchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 G eine Minute lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Als nächstes bereiten Sie zweifache Verdünnungen der solubilisierten Amylopektinlösung vor, um eine Reihe von zwei Millilitern verdünnten Amylopektinlösungen herzustellen.Zur Herstellung der ConA-Sepharose-Amylopektin-Kügelchen werden 250 Mikroliter jeder verdünnten Amylopektin-Lösung in die Röhrchen gegeben, die 250 Mikroliter ConA-Sepharose-Kügelchen mit Voräquilibrierung und Bindungspuffer enthalten. Mischen Sie den Inhalt gut und beschriften Sie die Röhrchen mit der entsprechenden Amylopektinkonzentration. Inkubieren Sie den Röhrcheninhalt auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius für 30 Minuten und zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 10.000 G.Mischen Sie 250 Mikroliter ConA-Sepharose-Amylopektin-Kügelchen mit 100 Mikrolitern des Bindungspuffers, der 10 Mikrogramm überschüssige Stärke oder SEX4-Protein, 10 Millimolar Dithiothreitol und 10 Mikromolar Proteasehemmer-Cocktail enthält. Inkubieren Sie den Inhalt bei vier Grad Celsius für 45 Minuten unter sanfter Rotation. Anschließend werden die Röhrchen bei 10.000 G eine Minute lang zentrifugiert und 50 Mikroliter des Überstands vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert.Geben Sie 20 Mikroliter 4X SDS-Seitenfarbstoff und 10 Mikroliter destilliertes Wasser in jedes Röhrchen, das 50 Mikroliter der gesammelten Überstandsfraktionen enthält, und kennzeichnen Sie sie als S. Geben Sie in ähnlicher Weise 20 Mikroliter 4X SDS-Seitenfarbstoff und 80 Mikroliter destilliertes Wasser in die Röhrchen mit gewaschenen ConA-Sepharose-Amylopektin-SEX4-Kügelchen. Nach Zugabe von Farbstoff und Wasser erhitzen Sie alle Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Nachdem die ConA-Sepharose-Amylopektin SEX4-Kügelchen eine Minute lang bei 10.000 G zentrifugiert wurden, bewahren Sie den Überstand auf und markieren Sie ihn als P.Laden Sie 40 Mikroliter der ungebundenen Proteinproben, die als S gekennzeichnet sind, in 4 bis 12 % vorgefertigte Polyacrylamidgel-Vertiefungen von der niedrigsten bis zur höchsten Substratkonzentration, wobei die erste Spur für einen Proteinmolekulargewichtsmarker reserviert wird.Verwenden Sie ein zweites Gel, um die mit P gekennzeichneten Glucan-gebundenen Proteinproben zu laden.Geben Sie frisch vorbereiteten SDS-Puffer in beide Kammern der Apparatur und lassen Sie das Gel 35 Minuten lang mit 150 Volt laufen oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht. Nehmen Sie dann die Gelkassette aus dem Gerät und entfernen Sie die Abstandshalter und Glasplatten, um das Gel für die Western-Blot-Analyse zu trennen. Stellen Sie einen Liter Transferpuffer her, der 5,8 Gramm Trisbase, 2,9 Gramm Glycin, 0,37 Gramm SDS und 200 Milliliter Methanol enthält.Um die größengetrennten Proteine aus dem Polyacrylamid-Gel auf eine Nitrozellulose-Membran zu übertragen, werden die Schwämme, das Filterpapier, das Gel und die Nitrozellulose-Membran gemäß dem westlichen Transferprotokoll zusammengebaut und eine Stunde lang mit 70 Volt betrieben. Inkubieren Sie die Nitrozellulosemembran nach dem Laufen des Gels in einer Proteinlösung aus 1 bis 5 % Rinderserumalbumin oder Milchprotein in 50 Millilitern TBST-Puffer für eine Stunde, um eine unspezifische Proteinbindung zu verhindern. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer, um ungebundene Blockierungslösung zu entfernen.Als nächstes inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang mit dem verdünnten Meerrettichperoxidase-gebundenen Antikörper, der für das Histidin-markierte Protein spezifisch ist. Waschen Sie die Membran dann dreimal mit TBST-Puffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Für die digitale Bildgebung stellen Sie eine Lösung aus gleichen Teilen chemilumineszierender Substratlösungen her, jeweils 750 Mikroliter in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, und inkubieren Sie die Membran mindestens fünf Minuten lang in der Lösung.Legen Sie das Membranprotein mit der Seite nach unten auf den Blot-Scanner und führen Sie die Erfassungssoftware aus, um das Protein sowohl in der Pellet- als auch in der Überstandsfraktion zu quantifizieren. Um die Daten zu erfassen, starten Sie die quantitativen Signalmessungen mit der Erfassungssoftware mit dem Blot-Scanner. Normalisieren Sie alle quantitativen Messungen in den Überstands- und Pelletfraktionen auf das insgesamt beladene Protein.Im Sättigungsbindungsexperiment wird der Prozentsatz der Proteinbindung im Vergleich zur Amylopektinkonzentration aufgetragen und die Daten mithilfe einer Datenanalysesoftware angepasst, um die Dissoziationskonstante Kd zu berechnen.Die Bindungskapazität von SEX4 an ConA-Sepharose-Amylopektin-Beads wurde mit Hilfe der SDS-Seite analysiert. Das Vorhandensein von SEX4-Protein in der Pelletfraktion und Rinderserumalbumin in der Überstandsfraktion wurde festgestellt. W278A, eine bekannte SEX4-Mutante mit signifikant reduzierter Glucanbindungsfähigkeit, erschien in der Überstandsfraktion, was auf den Nutzen und die Spezifität dieses Assays hinweist.Die Western-Blotting-Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der Detektion von SEX4 und die Methode ist spezifisch für den Nachweis von Glucanphosphaten mit einem endterminalen Histidin-Tag. Der Cosedimentationsassay wurde bei drei verschiedenen SEX4-Konzentrationen getestet. Während zwei Mikrogramm SEX4 ausreichen, um durch Chemilumineszenz-Detektion sichtbar zu machen, ermöglicht die Verwendung von fünf oder 10 Mikrogramm SEX4 eine genauere Detektion.Außerdem wurde eine erhöhte SEX4-Bindung bei erhöhter Amylopektinkonzentration festgestellt. Die Bindungsaffinität von Amylopektin und SEX4-Wildtyp-Protein in verschiedenen Konzentrationen wurde bestimmt, und die prozentualen proteingebundenen Daten für das spezifische Bindungsmodell an einer Stelle ergaben einen Kd von etwa 1,03 Milligramm pro Milliliter. Die Anwendbarkeit dieser Methode zur Messung der Bindung von Laforin, LSF2, Mais SEX4 und Kartoffel-SEX4 gegen Kartoffel-Amylopektin wurde untersucht.Die Ergebnisse zeigten, dass die getesteten Proteine aus agronomisch wichtigen Nutzpflanzen auch differentiell an Amylopektin gebunden sind. Es ist wichtig, sich an die Normalisierung aller quantitativen Messungen in den Pellet- und Überstandsfraktionen auf das insgesamt beladene Protein zu erinnern. Um sicherzustellen, dass das gesamte Amylopektin an die Kügelchen gebunden ist, bewahren Sie die überstehenden Fraktionen auf, um später den Tiefenglukosetest durchzuführen.Die Glucanphosphatase wird durch verschiedene Mechanismen zur Bindung, Lokalisierung und Dephosphorylierung von Kohlenhydraten eingesetzt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Bindung der Glucanphosphatase an verschiedene strukturelle Domänen innerhalb großer Polymerkomplexe zur positionsspezifischen Dephosphorylierung.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...