Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי פרס הקרן הלאומית למדע MCB-2012074. המחברים מודים לד"ר קרייג וונדר קוי מהמחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת פלורידה על דיונים חשובים ותמיכה. המחברים מודים גם לד"ר מתיו ס. ג'נטרי מהמחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת פלורידה על תמיכתו. ברצוננו להודות לד"ר שרה לגלוואר, יו"ר התוכנית למדעי המוח במכללת סקידמור, שאפשרה לנו להשתמש בסורק הכתם בן הספרות C של LICOR עבור דימות כתמים מערביים.

1. הכנת חרוזי ConA-Sepharose
<ol><li>צור 250 מ"ל של מאגר מחייב המכיל 67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 ו- 0.2 mM CaCl2. כוונן את רמת החומציות באמצעות תמיסת 1 M NaOH.</li>
	<li>פיפטה 250 μL של תרחיף חרוזי ConA-Sepharose לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התוכן ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C. השליכו את הסופר...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

מחקר זה מדגים את הפיתוח המוצלח של בדיקת שיקוע חוץ גופית חדשנית המאפשרת לקבוע את הזיקה הקושרת של אינטראקציות פוספטאז גלוקן-גלוקן. תכנון הבדיקה מנצל את הקישור הספציפי של לקטין ConA לגלוקנים באמצעות שאריות הידרוקסיל של גלוקוז כדי ללכוד בעקיפין מצעי פחמימות מסיסים על חרוזי ספארוז. זה...

פוספטזות גלוקניות שייכות לתת-משפחה מגוונת מבחינה תפקודית של פוספטזות ספציפיות כפולה (DSPs) בתוך משפחת העל של החלבון טירוזין פוספטאז (PTP)1. הם נמצאו ברוב צורות החיים, כולל אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים מאוד, בני אדם, בעלי חוליות, וכמה חסרי חוליות ופרוטיסטים 2,3,4. צמחים מכילים שלושה פוספטזים גלוקניים ידועים: עודפי עמילן4 (SEX4), כמו מין ארבע1 (LSF1), וכמו מין ארבע2 (LSF2)5,6,7. צמחים חסרי פוספטאז גלוקני מציגים שיעורים מופחתים של פירוק עמילן חולף והצטברות של עמילן בעלים 8,9. Laforin הוא החבר המייסד של משפחת phosphatase גלוקן כי dephosphorylates גליקוגן בחולייתנים ובני אדם 3,10. המוטציות של לאפורין גורמות למחלת לפורה נוירודגנרטיבית, צורה אוטוזומלית רצסיבית קטלנית של אפילפסיה11. פוספטזות גלוקן נחוצות למטבוליזם של גליקוגן ועמילן, והתגלו כאנזימים חשובים לוויסות תכולת העמילן בצמחים ולטיפול במחלת לפורה ניוונית12,13. מחקרי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן שנערכו לאחרונה על פוספטזות גלוקניות עם מצעי גלוקן מודל שפכו אור על קשירת המצע והמנגנון הקטליטי של זרחן גלוקני14,15,16,17. עם זאת, ההבנה הנוכחית של האופן שבו פוספטזים גלוקניים נקשרים למצעים הפיזיולוגיים שלהם אינה שלמה.
עמילן הוא פולימר בלתי מסיס של גלוקוז העשוי מ-80%-90% עמילופקטין ו-10%-20% עמילוז18. המצע לפוספטזות גלוקן צמחיות הוא מולקולות פחמימות זרחניות, כגון גרגרי גליקוגן ועמילן. שאריות הגלוקוזיל הזרחניות נמצאות ביחס שאריות פוספט:גלוקוזיל של 1:600. מעניין, פוספטים נמצאים רק על מולקולות עמילופקטין19. הצמח העיקרי גלוקן phosphatase SEX4 פועל על גרגיר עמילן כדי dephosphorylate עמילופקטין מולקולות. המבנה הגבישי של קרני רנטגן של SEX4 בשילוב עם מחקרי מוטגנזה מונחי מבנה הדגימו את ייחודיות המצע הייחודי של SEX4 עבור מיקומים שונים בתוך מבנה גלוקן15. לאחרונה הראינו כי ניתן לצפות בפעילות הרלוונטית ביולוגית של SEX4 רק כאשר פועלים על מצעי העמילופקטין המסיסים שלו20. עם זאת, הבנת אינטראקציות גלוקן-SEX4 הוכחה כקשה בשל המורכבות המבנית של המצע, ספציפיות קישור רחבה יותר וזיקות קישור נמוכות בין החלבון למצעים שלו. בעיות אלה פגעו ביכולת להשתמש בשיטות הנפוצות באינטראקציות חלבון-ליגנד, כגון קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC), ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ובדיקות מבוססות אנזימים מקושרים לאימונוסורבנט (ELISA).
באופן מעניין, חלק גדול מההבנה שלנו של אינטראקציות בין פחמימות לחלבונים הגיע ממחקר של לקטינים. Concanavalin A (ConA) היא משפחת קטניות לקטין של חלבונים שהופקו במקור משעועית הג'ק. ConA קושר פחמימות עם ספציפיות גבוהה, וזה יתרון לשימוש בו ביישומי מיקוד סמים ומשלוח. הקישור של ConA למגוון מצעים המכילים α-D-מנוסיל ו-α-D-גלוקוזיל לא מפחיתים נחקר בהרחבה19,20. חרוזי ספרוז הקשורים ל- ConA זמינים באופן מסחרי משמשים בדרך כלל לטיהור גליקופרוטאינים וגליקוליפידים21. ConA נקשר לגלוקנים אלה באמצעות קבוצות הידרוקסיל C3, C4 ו-C6 של שאריות הגלוקוז. חרוזי ConA-Sepharose שימשו בהצלחה גם למדידת הקישור של אינטראקציות גליקוגן-חלבון ועמילן-חלבון22,23. במחקר זה השתמשנו בחרוזי ConA-Sepharose כדי לפתח בדיקת קישור למדידת תכונות הקישור של אינטראקציות גלוקן פוספטאז-עמילופקטין.
בעבר, נעשה שימוש בבדיקת שיקוע מבוססת ConA כדי להעריך את יכולת הקישור של מצע גלוקן פוספטאז 14,20,24. במחקר זה, אותה אסטרטגיה שימשה לפיתוח שיטה חדשנית לקביעת הזיקה הקושרת של אינטראקציות גלוקן-גלוקן פוספטאז ופחמימות. לשיטה זו יש גם יתרון בחקירת אינטראקציות שונות של פחמימות-חלבונים מסיסים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

פוספטזות גלוקניות שייכות למשפחה הגדולה יותר של פוספטזות בעלות סגוליות כפולה (DSP) אשר מנטרלות מצעי גלוקן, כגון גליקוגן בבעלי חיים ועמילן בצמחים. המבנים הגבישיים של פוספטאז גלוקן עם מצעי גלוקן מודל חושפים ממשקים קושרי גלוקן נפרדים העשויים מתחומי DSP וקשירת פחמימות. עם זאת, מדידות כמותיות של אינטראקציות גלוקן-גלוקן פוספטאז עם מצעים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הן בסיסיות להבנה הביולוגית של משפחת האנזימים גלוקן פוספטאז ולוויסות חילוף החומרים של אנרגיה. כתב יד זה מדווח על בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת Concanavalin A (ConA) שנועדה לזהות את זיקת קשירת המצע של פוספטזות גלוקניות כנגד מצעים גלוקניים שונים. כהוכחת היתכנות, נקבע קבוע הדיסוציאציה (KD) של גלוקן פוספטאז Arabidopsis thaliana עמילן עודף4 (SEX4) ועמילופקטין נקבע. האפיון של מוטנטים SEX4 וחברים אחרים במשפחת האנזימים גלוקן פוספטאז מדגים עוד יותר את התועלת של בדיקה זו כדי להעריך את הקישור הדיפרנציאלי של אינטראקציות חלבון-פחמימות. נתונים אלה מדגימים את התאמתו של מחקר זה לאפיון מגוון רחב של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם עמילן וגליקוגן.

אחד המאפיינים העיקריים של משפחת החלבונים גלוקן פוספטאז הוא יכולתם להיקשר למצעים גלוקניים. ראשית, יכולת הקישור של SEX4 לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin נותחה באמצעות SDS-PAGE (איור 2A). אלבומין בסרום בקר (BSA) שימש כבקרה שלילית לזיהוי כל קשירה לא ספציפית של חלבונים לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin. ניתוח S...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת A זו של concanavalin נועדה למדוד זיקה קשירה של פוספטזות גלוקניות כנגד מצעי STA שונים. המידע שאנו מקבלים משיטה זו הוא בסיסי להבנתנו את משפחת האנזימים גלוקן פוספטאז. אינטראקציות חלבון פחמימות הן חלשות יחסית, ולכן השיטות הנוכחיות אינן יכולות לזהות אינטראקציות גלוקן פוספטאז וגלוקן.בדיקת הקוסדמנטציה מבוססת הלקטין שלנו יכולה לזהות זיקה קושרת בטווח המילימולרי. האפיון של מוטנטים SEX4 כמו גם חברים אחרים במשפחת האנזימים גלוקן פוספטאז מדגים את היכולת של בדיקה זו לכמת אינטראקציות פחמימות חלבוניות. אחד החלקים המאתגרים ביותר בבדיקה הוא לייעל את טווח הריכוז של המצע.אנו ממליצים להתחיל עם טווח רחב יותר כדי לקבל מושג ולאחר מכן לצמצם לטווח ספציפי. כדי להתחיל, פיפטה 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose תרחיף לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את התוכן ב 10, 000 G במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף 750 מיקרוליטר של חיץ הקישור לכל צינור המכיל 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose. צנטריפוגות את הצינורות ב 10, 000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, להכין דילולים כפולים של פתרון עמילופקטין מסיס לעשות סדרה של שני מיליליטר פתרונות עמילופקטין מדולל.כדי להכין את חרוזי העמילופקטין ConA-sepharose, הוסף 250 מיקרוליטר של כל תמיסת עמילופקטין מדוללת לצינורות המכילים 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose מאוזן מראש ומאגר קשירה. מערבבים היטב את התוכן ותייגו את הצינורות עם ריכוז העמילופקטין המתאים. לדגור על תוכן הצינור על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וצנטריפוגה את הצינורות ב 10, 000 G למשך דקה אחת.ערבבו 250 מיקרוליטר של חרוזי עמילופקטין ConA-sepharose עם 100 מיקרוליטר של חיץ הקישור המכיל 10 מיקרוגרם של עודפי עמילן ארבעה, או חלבון SEX4, 10 מילימולר של dithiothreitol, ו 10 מיקרומולר של קוקטייל מעכב פרוטאז. דוגרים על התוכן בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות בסיבוב עדין. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 10, 000 G במשך דקה אחת בזהירות פיפטה 50 מיקרוליטר של supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.הוסף 20 מיקרוליטר של צבע דף 4X SDS ו -10 מיקרוליטר של מים מזוקקים לכל צינור המכיל 50 מיקרוליטר של שברי supernatant שנאספו ותייג אותם כ- S.באופן דומה, הוסף 20 מיקרוליטר של צבע דף 4X SDS ו- 80 מיקרוליטר של מים מזוקקים לצינורות המכילים חרוזי ConA-sepharose amylopectin SEX4 שטופים. לאחר הוספת צבע ומים, מחממים את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ברגע שחרוזי עמילופקטין SEX4 של ConA-sepharose עוברים צנטריפוגה של 10, 000 גרם למשך דקה אחת, שמרו את הסופרנאטנט ותייגו אותו כ-P.Load 40 מיקרוליטר של דגימות החלבון הלא מאוגדות המסומנות כ-S לבארות ג'ל פוליאקרילאמיד פריקאסט של 4 עד 12% מריכוז המצע הנמוך ביותר לגבוה ביותר, תוך שמירת הנתיב הראשון לסמן משקל מולקולרי חלבוני.השתמש בג'ל שני כדי לטעון את דגימות החלבון הקשורות לגלוקן המסומנות P.Add דף SDS טרי מוכן חיץ ריצה לשני התאים של המכשיר ולהפעיל את הג'ל ב 150 וולט במשך 35 דקות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל. לאחר מכן קח את קלטת הג'ל מהמנגנון והסר את הספייסרים וצלחות הזכוכית כדי להפריד את הג'ל לניתוח כתמים מערביים. הפוך ליטר אחד של מאגר העברה המכיל 5.8 גרם של בסיס tris, 2.9 גרם של גליצין, 0.37 גרם של SDS, ו 200 מיליליטר של מתנול.כדי להעביר את החלבונים המופרדים בגודל מג'ל הפוליאקרילאמיד לקרום ניטרוצלולוז, הרכיבו את הספוגים, ניירות הסינון, הג'ל וקרום הניטרוצלולוז בהתאם לפרוטוקול ההעברה המערבי ופעלו במתח של 70 וולט למשך שעה. לאחר הפעלת הג'ל, יש לדגור על קרום הניטרוצלולוז בתמיסת חלבון של אלבומין בסרום בקר אחד עד 5% או חלבון חלב במאגר TBST של 50 מיליליטר למשך שעה אחת כדי למנוע קשירת חלבון לא ספציפית. שטפו את הממברנה שלוש פעמים באמצעות מאגר TBST כדי להסיר כל תמיסת חסימה לא מאוגדת.לאחר מכן, לדגור על הממברנה במשך שעה אחת עם נוגדן מדולל חזרת peroxidase מקושר ספציפי עבור חלבון מתויג היסטידין. לאחר מכן שטפו את הממברנה שלוש פעמים במאגר TBST כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. עבור הדמיה דיגיטלית, לעשות פתרון של חלקים שווים של פתרונות מצע chemiluminescent, 750 מיקרוליטר כל אחד בצינור 1.5 מיליליטר, לדגור את הממברנה לפחות חמש דקות בתמיסה.הניחו את צד חלבון הממברנה על סורק הכתם והריצו את תוכנת הרכישה כדי לכמת את החלבון הן בשבר הכדורי והן בשבר הסופרנאטנטי. כדי להשיג את הנתונים, התחל את מדידות האות הכמותיות באמצעות תוכנת הרכישה עם סורק הכתם. נרמלו את כל המדידות הכמותיות בשברי הסופרנאטנט והגלולה לסך החלבון הטעון.בניסוי הקישור הרווי, התווה את אחוז החלבון הקשור לעומת ריכוז העמילופקטין והתאים את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים לחישוב קבוע הדיסוציאציה, Kd.יכולת הקישור של SEX4 לחרוזי עמילופקטין ConA-sepharose נותחה באמצעות דף SDS. נצפתה נוכחות של חלבון SEX4 בחלק הכדורי ואלבומין בסרום בקר בחלק הסופרנאטנטי. W278A, מוטנט SEX4 ידוע עם יכולת קשירה גלוקנית מופחתת באופן משמעותי, הופיע בחלק הסופרנאטנטי, מה שמצביע על התועלת והספציפיות של בדיקה זו.ניתוח הכתמים המערבי גילה עלייה משמעותית בזיהוי SEX4 והשיטה ספציפית לאיתור פוספטים גלוקניים עם תג היסטידין סופי. בדיקת השקיעה נבדקה בשלושה ריכוזי SEX4 שונים. בעוד ששני מיקרוגרם של SEX4 מספיקים כדי להמחיש באמצעות זיהוי כימילומינסנציה, שימוש בחמישה או 10 מיקרוגרם של SEX4 מאפשר זיהוי מדויק יותר.כמו כן, נצפתה קשירת SEX4 מוגברת עם ריכוז עמילופקטין מוגבר. נקבעת זיקת הקישור של עמילופקטין וחלבון מסוג SEX4 פראי בריכוזים שונים, ואחוז הנתונים הקשורים לחלבון למודל הקישור הספציפי של אתר אחד נתן Kd של כ-1.03 מיליגרם למיליליטר. נבדקה תחולתה של שיטה זו למדידת קשירת לפורין, LSF2, תירס SEX4 ותפוח אדמה SEX4 כנגד עמילופקטין תפוחי אדמה.התוצאות הראו כי החלבונים שנבדקו מגידולים בעלי חשיבות אגרונומית קשורים באופן דיפרנציאלי גם לעמילופקטין. חשוב לזכור את הנורמליזציה של כל המדידות הכמותיות בשברים הכדוריים והסופרנטנטיים לסך כל החלבון הטעון. כדי להבטיח שכל העמילופקטין קשור לחרוזים, שמור את שברי הסופרנאטנט כדי לבצע את בדיקת הגלוקוז העמוק מאוחר יותר.גלוקן פוספטאז משמש מנגנונים נפרדים כדי לקשור, לאתר, dephosphorylate פחמימות. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקישור של פוספטאז גלוקני לתחומים מבניים שונים בתוך קומפלקסים פולימריים גדולים לדפוספורילציה ספציפית למיקום.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...