Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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इस अध्ययन को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पुरस्कार एमसीबी -2012074 द्वारा समर्थित किया गया था। क्रेग डब्ल्यू वेंडर कूई फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान विभाग के मूल्यवान चर्चा ओं और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। लेखक ों ने अपने समर्थन के लिए फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान विभाग के डॉ मैथ्यू एस जेंट्री को भी धन्यवाद दिया। हम स्किडमोर कॉलेज न्यूरोसाइंस प्रोग्राम के अध्यक्ष डॉ सारा लागलवार को धन्यवाद देना चाहते हैं, जिन्होंने हमें पश्चिमी ब्लॉट इमेजिंग के लिए एलआईसीओआर सी-डिजिट ब्लॉट स्कैनर का उपयोग करने की अनुमति दी।

1. कोना-सेफ्राइस मोतियों की तैयारी
<ol><li>67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, और0.2 mM CaCl2 युक्त बाइंडिंग बफर का 250 mL बनाएं। 1 M NaOH समाधान का उपयोग करके पीएच समायोजित करें।</li>
	<li>1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोना-से?...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

यह अध्ययन एक नए इन विट्रो अवसादन परख के सफल विकास को दर्शाता है जो ग्लूकन-ग्लूकन फॉस्फेट इंटरैक्शन के बाध्यकारी संबंध के निर्धारण की अनुमति देता है। परख डिजाइन ग्लूकोज के हाइड्रॉक्सिल अवशेषों के ?...

ग्लूकन फॉस्फेटेस प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेटेस (पीटीपी) सुपरफैमिली1 के भीतर दोहरी विशिष्टता फॉस्फेटेस (डीएसपी) के कार्यात्मक रूप से विविध उपपरिवार के सदस्य हैं। वे अधिकांश जीवन रूपों में पाए गए हैं, जिनमें व्यापक रूप से भिन्न प्रकाश संश्लेषक जीव, मनुष्य, कशेरुक, और कुछ अकशेरुकी और प्रोटिस्ट 2,3,4 शामिल हैं। पौधों में तीन ज्ञात ग्लूकन फॉस्फेटेस होते हैं: स्टार्च अतिरिक्त 4 (सेक्स 4), जैसे सेक्स फोर 1 (एलएसएफ 1), और लाइक सेक्स फोर2 (एलएसएफ 2) 5,6,7। जिन पौधों में ग्लूकन फॉस्फेटेस की कमी होती है,वे पत्तियों में क्षणभंगुर स्टार्च क्षरण और स्टार्च के संचय की दर में कमी प्रदर्शित करते हैं। लाफोरिन ग्लूकन फॉस्फेट परिवार का संस्थापक सदस्य है जो कशेरुक और मनुष्यों में ग्लाइकोजन को डीफॉस्फोराइलेट करता है 3,10. लाफोरिन के उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप न्यूरोडीजेनेरेटिव लाफोरा रोग होता है, जो मिर्गी का एक घातक ऑटोसोमल रिसेसिव रूपहै। ग्लाइकोजन और स्टार्च चयापचय के लिए ग्लूकन फॉस्फेटेस आवश्यक हैं और पौधों में स्टार्च सामग्री को संशोधित करने और न्यूरोडीजेनेरेटिव लाफोरा रोग12,13 के इलाज के लिए महत्वपूर्ण एंजाइमों के रूप में उभरे हैं। मॉडल ग्लूकन सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन फॉस्फेटेस पर हाल के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध्ययनों ने सब्सट्रेट बाइंडिंग और ग्लूकन डीफॉस्फोराइलेशन14,15,16,17 के उत्प्रेरक तंत्र पर प्रकाश डाला है। हालांकि, ग्लूकन फॉस्फेटेस अपने शारीरिक सब्सट्रेट्स से कैसे जुड़ते हैं, इसकी वर्तमान समझ अधूरी है।
स्टार्च ग्लूकोज का एक अघुलनशील बहुलक है जो 80% -90% एमाइलोपेक्टिन और 10% -20% एमाइलोज18 से बना है। प्लांट ग्लूकन फॉस्फेटेस के लिए सब्सट्रेटफॉस्फोराइलेटेड कार्बोहाइड्रेट अणु होते हैं, जैसे ग्लाइकोजन और स्टार्च ग्रैन्यूल। फॉस्फोराइलेटेड ग्लूकोसिल अवशेष 1: 600 फॉस्फेट: ग्लूकोसिल अवशेष अनुपात में मौजूद हैं। दिलचस्प बात यह है कि फॉस्फेट केवल एमाइलोपेक्टिन अणुओं19 पर मौजूद हैं। मुख्य पौधे ग्लूकन फॉस्फेट सेक्स 4 स्टार्च ग्रेन्युल पर एमाइलोपेक्टिन अणुओं को डीफॉस्फोराइलेट करने के लिए कार्य करता है। संरचना-निर्देशित म्यूटेनेसिस अध्ययनों के साथ संयुक्त सेक्स 4 की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना ने ग्लूकन संरचना15 के भीतर विभिन्न पदों के लिए सेक्स 4 की अनूठी सब्सट्रेट विशिष्टताओं का प्रदर्शन किया है। हमने हाल ही में दिखाया है कि सेक्स 4 की जैविक रूप से प्रासंगिक गतिविधि केवल तभी देखी जा सकती है जब इसके घुलनशील एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट्स20 पर कार्य किया जाता है। हालांकि, सब्सट्रेट की संरचनात्मक जटिलता, व्यापक बाध्यकारी विशिष्टताओं और प्रोटीन और उसके सब्सट्रेट्स के बीच कम बाध्यकारी समानताओं के कारण ग्लूकन-सेक्स 4 इंटरैक्शन को समझना मुश्किल साबित हुआ है। इन मुद्दों ने आमतौर पर प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन में उपयोग की जाने वाली विधियों का उपयोग करने की क्षमता में बाधा डाली है, जैसे कि इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)-आधारित परख।
दिलचस्प बात यह है कि कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन इंटरैक्शन की हमारी अधिकांश समझ लेक्टिन का अध्ययन करने से आई है। कॉनकानावेलिन ए (कोना) मूल रूप से जैक बीन से निकाले गए प्रोटीन का एक फलियां लेक्टिन परिवार है। कोना उच्च विशिष्टता के साथ कार्बोहाइड्रेट को बांधता है, जो दवा लक्ष्यीकरण और वितरण अनुप्रयोगों में इसके उपयोग के लिए फायदेमंद है। नॉनरिड्यूसिंग α-डी-मैनोसिल और α-डी-ग्लूकोसिल युक्त विभिन्न प्रकार के सब्सट्रेट्स के लिए कोना के बंधन का बड़े पैमानेपर अध्ययन किया गया है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोना-बाउंड सेफ्राइस मोती आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन और ग्लाइकोलिपिड्स21 को शुद्ध करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। कोना ग्लूकोज अवशेषों के सी 3, सी 4 और सी 6 हाइड्रॉक्सिल समूहों के माध्यम से इन ग्लूकेन को बांधता है। कोना-सेफ्राइस मोतियों का उपयोग ग्लाइकोजन-प्रोटीन और स्टार्च-प्रोटीन इंटरैक्शन22,23 के बंधन को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इस अध्ययन में, हमने ग्लूकेन फॉस्फेट-एमाइलोपेक्टिन इंटरैक्शन की बाध्यकारी विशिष्टताओं को मापने के लिए एक बाध्यकारी परख विकसित करने के लिए कोना-सेफ्रॉस बीड्स का उपयोग किया।
इससे पहले, एक कोना-आधारित अवसादन परख को ग्लूकन फॉस्फेट सब्सट्रेट बाइंडिंग क्षमता 14,20,24 का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया था। इस अध्ययन में, ग्लूकन-ग्लूकन फॉस्फेट और कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन के बाध्यकारी संबंध को निर्धारित करने के लिए एक नई विधि विकसित करने के लिए एक ही रणनीति का उपयोग किया गया था। इस विधि में विभिन्न घुलनशील कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए एक फायदा भी है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

ग्लूकन फॉस्फेटेस दोहरी विशिष्टता फॉस्फेटेस (डीएसपी) के बड़े परिवार से संबंधित हैं जो जानवरों में ग्लाइकोजन और पौधों में स्टार्च जैसे ग्लूकेन सब्सट्रेट्स को डीफॉस्फोराइलेट करते हैं। मॉडल ग्लूकन सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन फॉस्फेट की क्रिस्टल संरचनाएं डीएसपी और कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग डोमेन से बने अलग-अलग ग्लूकेन-बाइंडिंग इंटरफेस को प्रकट करती हैं। हालांकि, शारीरिक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन-ग्लूकन फॉस्फेट इंटरैक्शन के मात्रात्मक माप एंजाइमों के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार की जैविक समझ और ऊर्जा चयापचय के विनियमन के लिए मौलिक हैं। यह पांडुलिपि एक कॉनकानावेलिन ए (कोना) आधारित इन विट्रो अवसादन परख की रिपोर्ट करती है जिसे विभिन्न ग्लूकेन सब्सट्रेट्स के खिलाफ ग्लूकेन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग संबंध का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, ग्लूकेन फॉस्फेट एराबिडोप्सिस थैलियाना स्टार्च एक्स्ट्रा 4 (सेक्स 4) और एमाइलोपेक्टिन के पृथक्करण स्थिरांक (केडी) को निर्धारित किया गया था। सेक्स 4 उत्परिवर्ती और एंजाइमों के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार के अन्य सदस्यों का लक्षण वर्णन प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन के अंतर बंधन का आकलन करने के लिए इस परख की उपयोगिता को दर्शाता है। ये डेटा स्टार्च और ग्लाइकोजन इंटरैक्शन प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला को चिह्नित करने के लिए इस परख की उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं।

प्रोटीन के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार की प्रमुख विशेषताओं में से एक ग्लूकन सब्सट्रेट्स को बांधने की उनकी क्षमता है। सबसे पहले, सेक्स 4 से कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन मोतियों की बाध्यकारी क्षमता का विश्ल?...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

यह विधि ग्लूकन फॉस्फेट और एमाइलोपेक्टिन के बाध्यकारी संबंध को निर्धारित करने के लिए एक लेक्टिन-आधारित इन विट्रो अवसादन परख का वर्णन करती है। यह सह-अवसादन परख ग्लूकन फॉस्फेट सब्सट्रेट बाइंडिंग को मापने के लिए विश्वसनीय है और इसे विभिन्न घुलनशील ग्लूकेन सब्सट्रेट्स पर लागू किया जा सकता है।

ग्लूकन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग को मापने के लिए कॉनकानावेलिन ए-आधारित अवसादन परख

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

यह कॉनकानावलिन ए-आधारित इन विट्रो अवसादन परख को विभिन्न एसटीए सब्सट्रेट्स के खिलाफ ग्लूकन फॉस्फेटेस के बाध्यकारी संबंध को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस विधि से हम जो जानकारी प्राप्त करते हैं, वह एंजाइमों के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार की हमारी समझ के लिए मौलिक है। कार्बोहाइड्रेट प्रोटीन इंटरैक्शन अपेक्षाकृत कमजोर हैं, इसलिए वर्तमान तरीके ग्लूकन फॉस्फेट और ग्लूकन इंटरैक्शन का पता नहीं लगा सकते हैं।हमारे लेक्टिन आधारित कोडिमेंटेशन परख मिलीमोलर रेंज में बाध्यकारी संबंध का पता लगा सकते हैं। सेक्स 4 उत्परिवर्ती के साथ-साथ एंजाइमों के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार के अन्य सदस्यों का लक्षण वर्णन प्रोटीन कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन को निर्धारित करने के लिए इस परख की क्षमता को दर्शाता है। परख के सबसे चुनौतीपूर्ण भागों में से एक सब्सट्रेट की एकाग्रता सीमा को अनुकूलित करना है।हम एक विचार प्राप्त करने के लिए एक व्यापक सीमा से शुरू करने और फिर एक विशिष्ट सीमा के लिए संकीर्ण करने की सलाह देते हैं। शुरू करने के लिए, कोना-सेफ्रासेस बीड्स के पिपेट 250 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निलंबित किया जाता है। सामग्री को चार डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।सतह पर तैरने वाले को छोड़ने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में बाइंडिंग बफर के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें 250 माइक्रोलीटर कोना-सेफ्रासेस मोती होते हैं। ट्यूबों को 10,000 जी पर चार डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। इसके बाद, दो मिलीलीटर पतला एमाइलोपेक्टिन समाधानों की एक श्रृंखला बनाने के लिए घुलनशील एमाइलोपेक्टिन समाधान के दो गुना कमजोर पड़ने की तैयारी करें।कोना-सेफ्राइस एमाइलोपेक्टिन मोती तैयार करने के लिए, प्रत्येक पतला एमाइलोपेक्टिन समाधान के 250 माइक्रोलीटर को 250 माइक्रोलीटर कोना-सेफ्रॉस मोती वाले ट्यूबों में जोड़ें। सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं और ट्यूबों को संबंधित एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता के साथ लेबल करें। 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर घूमने वाले पहिया पर ट्यूब सामग्री को इनक्यूबेट करें और एक मिनट के लिए ट्यूबों को 10,000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।250 माइक्रोलीटर कोना-सेफ्राइस एमाइलोपेक्टिन बीड्स को 100 माइक्रोलीटर बाइंडिंग बफर के साथ मिलाएं, जिसमें 10 माइक्रोग्राम स्टार्च अतिरिक्त चार, या सेक्स 4 प्रोटीन, 10 मिलीमोलर डिथियोथ्रेइटोल और 10 माइक्रोमोलर प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल शामिल हैं। सामग्री को चार डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें। फिर ट्यूबों को एक मिनट के लिए 10,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सावधानीपूर्वक सतह पर तैरने वाले के 50 माइक्रोलीटर को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें।एकत्रित सतह पर तैरने वाले अंशों के 50 माइक्रोलीटर वाले प्रत्येक ट्यूब में 20 माइक्रोलीटर 4एक्स एसडीएस पेज डाई और 10 माइक्रोलीटर आसुत जल जोड़ें और उन्हें एस के रूप में लेबल करें। डाई और पानी डालने के बाद, सभी नमूनों को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। एक बार जब कोना-सेफ्राइस एमाइलोपेक्टिन सेक्स 4 मोतियों को एक मिनट के लिए 10,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, तो सतह पर तैरने वाले को सहेजें और इसे एस के रूप में लेबल किए गए अनबाउंड प्रोटीन नमूनों के 40 माइक्रोलीटर के रूप में लेबल करें, जो सबसे कम सब्सट्रेट एकाग्रता से उच्चतम तक 4 से 12% प्रीकास्ट पॉलीक्रिलामाइड जेल कुओं में लेबल करते हैं, जो प्रोटीन आणविक भार मार्कर के लिए पहली लेन आरक्षित करते हैं।उपकरण के दोनों कक्षों में बफर चलाने वाले ताजा तैयार एसडीएस पेज जोड़ें और जेल को 35 मिनट के लिए 150 वोल्ट पर चलाएं या जब तक डाई फ्रंट जेल के नीचे तक न पहुंच जाए। फिर उपकरण से जेल कैसेट लें और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए जेल को अलग करने के लिए स्पेसर और ग्लास प्लेटों को हटा दें। एक लीटर ट्रांसफर बफर बनाएं जिसमें 5.8 ग्राम ट्रिस बेस, 2.9 ग्राम ग्लाइसिन, 0.37 ग्राम एसडीएस और 200 मिलीलीटर मेथनॉल हो।पॉलीक्रिलामाइड जेल से एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में आकार अलग प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए, पश्चिमी स्थानांतरण प्रोटोकॉल के अनुसार स्पंज, फिल्टर पेपर, जेल और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को इकट्ठा करें और एक घंटे के लिए 70 वोल्ट पर चलें। जेल चलाने के बाद, गैर-विशिष्ट प्रोटीन बाइंडिंग को रोकने के लिए 50 मिलीलीटर टीबीएसटी बफर में 1 से 5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन या दूध प्रोटीन के प्रोटीन समाधान में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। किसी भी अनबाउंड ब्लॉकिंग समाधान को हटाने के लिए टीबीएसटी बफर का उपयोग करके झिल्ली को तीन बार धोएं।इसके बाद, हिस्टिडाइन टैग किए गए प्रोटीन के लिए विशिष्ट पतला हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज लिंक्ड एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए टीबीएसटी बफर में झिल्ली को तीन बार धोएं। डिजिटल इमेजिंग के लिए, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक 750 माइक्रोलीटर, केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट समाधान के समान भागों का समाधान बनाएं, और समाधान में कम से कम पांच मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें।ब्लॉट स्कैनर पर झिल्ली प्रोटीन साइड को नीचे रखें और पेलेट और सुपरनैटेंट अंशों दोनों में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाएं। डेटा प्राप्त करने के लिए, ब्लॉट स्कैनर के साथ अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक सिग्नल माप शुरू करें। कुल प्रोटीन लोड किए गए सुपरनैटेंट और पेलेट अंशों में सभी मात्रात्मक मापों को सामान्य करें।संतृप्त बाइंडिंग प्रयोग में, प्रोटीन बाध्य बनाम एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता के प्रतिशत को प्लॉट करें और पृथक्करण स्थिरांक की गणना करने के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा फिट करें, केडी। पेलेट अंश में सेक्स 4 प्रोटीन और सुपरनैटेंट अंश में गोजातीय सीरम एल्बुमिन की उपस्थिति का उल्लेख किया गया था। W278A, एक ज्ञात SEX4 उत्परिवर्ती, जिसमें ग्लूकन बाइंडिंग क्षमता काफी कम हो गई है, सुपरनैटेंट अंश में दिखाई दिया, जो इस परख की उपयोगिता और विशिष्टता को दर्शाता है।पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण ने सेक्स 4 का पता लगाने में महत्वपूर्ण वृद्धि का खुलासा किया और विधि एक अंत टर्मिनल हिस्टिडाइन टैग के साथ ग्लूकन फॉस्फेट का पता लगाने के लिए विशिष्ट है। कोडिमेंटेशन परख का परीक्षण तीन अलग-अलग सेक्स 4 सांद्रता पर किया गया था। जबकि सेक्स 4 के दो माइक्रोग्राम केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन के माध्यम से कल्पना करने के लिए पर्याप्त हैं, सेक्स 4 के पांच या 10 माइक्रोग्राम का उपयोग अधिक सटीक पहचान के लिए अनुमति देता है।इसके अलावा, बढ़ी हुई एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता के साथ सेक्स 4 बाइंडिंग में वृद्धि देखी गई। विभिन्न सांद्रता में एमाइलोपेक्टिन और सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन का बाध्यकारी संबंध निर्धारित किया गया था और विशिष्ट एक साइट बाइंडिंग मॉडल के लिए प्रतिशत प्रोटीन बाध्य डेटा ने लगभग 1.03 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर का केडी दिया था। आलू एमाइलोपेक्टिन के खिलाफ लाफोरिन, एलएसएफ 2, कॉर्न सेक्स 4 और आलू सेक्स 4 के बंधन को मापने के लिए इस विधि की प्रयोज्यता का मूल्यांकन किया गया था।परिणामों से पता चला है कि कृषि संबंधी रूप से महत्वपूर्ण फसलों से परीक्षण किए गए प्रोटीन भी एमाइलोपेक्टिन से अलग-अलग बंधे होते हैं। कुल प्रोटीन लोड किए गए पेलेट और सुपरनैटेंट अंशों में सभी मात्रात्मक मापों के सामान्यीकरण को याद रखना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी एमाइलोपेक्टिन मोतियों से बंधे हैं, बाद में गहरी ग्लूकोज परख करने के लिए सतह पर तैरने वाले अंशों को सहेजें।ग्लूकन फॉस्फेट को कार्बोहाइड्रेट को बांधने, पता लगाने और डीफॉस्फोराइलेट करने के लिए अलग-अलग तंत्र नियोजित किया जाता है। यह विधि स्थिति विशिष्ट डीफॉस्फोराइलेशन के लिए बड़े बहुलक परिसरों के भीतर विभिन्न संरचनात्मक डोमेन के लिए ग्लूकन फॉस्फेट के बंधन की खोज की अनुमति देती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

कार्बोहाइड्रेट अपमानजनक एंजाइमों की उच्च throughput स्क्रीनिंग उपन्यास अघुलनशील chromogenic सब्सट्रेट परख किट का उपयोग

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

बैक्टीरियल Histidine Kinase Autophosphorylation की मात्रा एक nitrocellulose बाध्यकारी परख का उपयोग

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

सह-अवसादन द्वारा एफ-एक्टिन के लिए प्रोटीन बाध्यकारी मापना

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस वैश्विक स्थानीयकृत अनुवाद मापने के लिए

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

फास्फारिलीकरण के लिए परख और कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में ताऊ प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ बाध्यकारी Microtubule

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

छोटे GTPase Prenylation और GTP झिल्ली अंश और GTPase से जुड़े Immunosorbent परख का उपयोग बाध्यकारी का पता लगाने

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

छोटे न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के पॉलीन्यूक्लियोटाइड फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए गैर-रेड्रियक परख

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...