Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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Questo studio è stato supportato dal premio della National Science Foundation MCB-2012074. Gli autori ringraziano il Dr. Craig W. Vander Kooi del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell'Università della Florida per le preziose discussioni e supporto. Gli autori ringraziano anche il Dr. Matthew S. Gentry del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell'Università della Florida per il suo supporto. Vorremmo ringraziare la dottoressa Sara Lagalwar, presidente del programma di neuroscienze dello Skidmore College, per averci permesso di utilizzare lo scanner LICOR C-digit blot per l'imaging western blot.

1. Preparazione delle perle ConA-Sepharose
<ol><li>Produrre 250 mL di un tampone legante contenente 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 e 0,2 mM CaCl2. Regolare il pH con una soluzione di NaOH 1 M.</li>
	<li>Pipettare 250 μL di sospensione di perline ConA-Sepharose in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare il contenuto a 10.000 x g per 30 s a 4 °C. Scartare il surnatante. NOTA: 250 μL di sfere di ConA-Sepharose in una provetta da microcentrifuga da ...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Questo studio dimostra il successo dello sviluppo di un nuovo saggio di sedimentazione in vitro che consente di determinare l'affinità di legame delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi. Il progetto del saggio sfrutta il legame specifico della lectina ConA ai glucani attraverso i residui idrossilici del glucosio per catturare indirettamente substrati di carboidrati solubilizzati su perle di salsorosio. Ciò consente la separazione delle frazioni proteiche legate e non legate tramite centrif...

Le fosfatasi glucane sono membri di una sottofamiglia funzionalmente diversificata di fosfatasi a doppia specificità (DSP) all'interno dellasuperfamiglia 1 della proteina tirosina fosfatasi (PTP). Sono stati trovati nella maggior parte delle forme di vita, inclusi organismi fotosintetici ampiamente divergenti, esseri umani, vertebrati e alcuni invertebrati e protisti 2,3,4. Le piante contengono tre fosfatasi glucane note: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Le piante che mancano di fosfatasi glucano mostrano tassi ridotti di degradazione transitoria dell'amido e accumulo di amido nelle foglie 8,9. Laforin è il membro fondatore della famiglia delle fosfatasi glucane che defosforila il glicogeno nei vertebrati e nell'uomo 3,10. Le mutazioni della laforina provocano la malattia neurodegenerativa di Lafora, una forma autosomica recessiva fatale di epilessia11. Le fosfatasi glucane sono necessarie per il metabolismo del glicogeno e dell'amido e sono emerse come enzimi importanti per modulare il contenuto di amido nelle piante e trattare la malattia neurodegenerativa di Lafora12,13. Recenti studi di cristallografia a raggi X sulle fosfatasi glucane con substrati di glucano modello hanno fatto luce sul legame del substrato e sul meccanismo catalitico della defosforilazione del glucano14,15,16,17. Tuttavia, l'attuale comprensione di come le fosfatasi glucane si leghino ai loro substrati fisiologici è incompleta.
L'amido è un polimero insolubile di glucosio composto da 80% -90% amilopectina e 10% -20% amilosio18. I substrati per le fosfatasi glucane delle piante sono molecole di carboidrati fosforilati, come glicogeno e granuli di amido. I residui glucosilici fosforilati sono presenti con un rapporto fosfato/residuo glucosilico di 1:600. È interessante notare che i fosfati sono presenti solo sulle molecole di amilopectina19. La principale glucanofosfatasi SEX4 agisce sul granulo di amido per defosforilare le molecole di amilopectina. La struttura cristallina a raggi X di SEX4 combinata con studi di mutagenesi guidati dalla struttura ha dimostrato le specificità uniche del substrato di SEX4 per diverse posizioni all'interno di una struttura glucana15. Abbiamo recentemente dimostrato che l'attività biologicamente rilevante di SEX4 può essere osservata solo quando agisce sui suoi substrati solubilizzati di amilopectina20. Tuttavia, la comprensione delle interazioni glucano-SEX4 si è dimostrata difficile a causa della complessità strutturale del substrato, delle più ampie specificità di legame e delle basse affinità di legame tra la proteina e i suoi substrati. Questi problemi hanno ostacolato la capacità di utilizzare metodi comunemente usati nelle interazioni proteina-ligando, come la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e i saggi basati su saggi basati su immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
È interessante notare che gran parte della nostra comprensione delle interazioni carboidrati-proteine proviene dallo studio delle lectine. La concanavalina A (ConA) è una famiglia di lectine leguminose originariamente estratte dal fagiolo. ConA lega i carboidrati con elevata specificità, il che è vantaggioso per il suo uso in applicazioni di targeting e somministrazione di farmaci. Il legame di ConA ad una varietà di substrati contenenti α-D-mannosil e α-D-glucosil non riducenti è stato ampiamente studiato19,20. Le perle di selosorosio legate al ConA disponibili in commercio sono comunemente usate per purificare glicoproteine e glicolipidi21. ConA si lega a questi glucani attraverso i gruppi ossidrilici C3, C4 e C6 dei residui di glucosio. Le perle di ConA-Sepharose sono state utilizzate con successo anche per misurare il legame delle interazioni glicogeno-proteina e amido-proteina22,23. In questo studio, abbiamo utilizzato perle di ConA-Sepharose per sviluppare un test di legame per misurare le specificità di legame delle interazioni glucano-fosfatasi-amilopectina.
In precedenza, è stato utilizzato un saggio di sedimentazione basato su ConA per valutare la capacità di legame del substrato di glucanofosfatasi14,20,24. In questo studio, la stessa strategia è stata utilizzata per sviluppare un nuovo metodo per determinare l'affinità di legame delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi e carboidrati. Questo metodo ha anche un vantaggio per studiare varie interazioni carboidrati-proteine solubilizzate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Le fosfatasi glucane appartengono alla più ampia famiglia delle fosfatasi a doppia specificità (DSP) che defosforilate substrati di glucano, come il glicogeno negli animali e l'amido nelle piante. Le strutture cristalline della fosfatasi glucano con substrati di glucano modello rivelano distinte interfacce di legame glucano fatte di DSP e domini di legame dei carboidrati. Tuttavia, le misurazioni quantitative delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi con substrati fisiologicamente rilevanti sono fondamentali per la comprensione biologica della famiglia di enzimi glucanofosfatasi e la regolazione del metabolismo energetico. Questo manoscritto riporta un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla Concanavalina A (ConA) progettato per rilevare l'affinità di legame del substrato delle fosfatasi glucane contro diversi substrati glucani. Come prova del concetto, è stata determinata la costante di dissociazione (KD) della glucanofosfatasi Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) e dell'amilopectina. La caratterizzazione dei mutanti SEX4 e di altri membri della famiglia degli enzimi glucanofosfatasi dimostra ulteriormente l'utilità di questo test per valutare il legame differenziale delle interazioni proteina-carboidrati. Questi dati dimostrano l'idoneità di questo test a caratterizzare un'ampia gamma di proteine che interagiscono tra amido e glicogeno.

Una delle caratteristiche chiave della famiglia di proteine della glucanofosfatasi è la loro capacità di legarsi ai substrati del glucano. In primo luogo, la capacità di legame di SEX4 a ConA-Sepharose:amylopectin beads è stata analizzata utilizzando SDS-PAGE (Figura 2A). L'albumina sierica bovina (BSA) è servita come controllo negativo per rilevare qualsiasi legame non specifico delle proteine alle perle ConA-Sepharose:amilopectina. L'analisi SDS-PAGE delle proteine ha mostrato la pres...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Questo metodo descrive un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla lectina per quantificare l'affinità di legame della fosfatasi glucana e dell'amilopectina. Questo saggio di co-sedimentazione è affidabile per misurare il legame del substrato della glucanofosfatasi e può essere applicato a vari substrati di glucano solubilizzati.

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Questo saggio di sedimentazione in vitro basato sulla concanavalina A è progettato per misurare l'affinità di legame delle fosfatasi glucane contro diversi substrati STA. Le informazioni che otteniamo da questo metodo sono fondamentali per la nostra comprensione della famiglia di enzimi glucanofosfatasi. Le interazioni delle proteine dei carboidrati sono relativamente deboli, quindi i metodi attuali non possono rilevare le interazioni tra glucanofosfatasi e glucano.Il nostro saggio di cosedimentazione basato sulla lectina è in grado di rilevare l'affinità di legame nell'intervallo millimolare. La caratterizzazione dei mutanti SEX4 e di altri membri della famiglia di enzimi glucanofosfatasi dimostra la capacità di questo test di quantificare le interazioni tra carboidrati proteici. Una delle parti più impegnative del test è ottimizzare l'intervallo di concentrazione del substrato.Ti consigliamo di iniziare con una gamma più ampia per avere un'idea e poi restringere il campo per una gamma specifica. Per iniziare, pipettare 250 microlitri di sospensione di perline di conA-sepharose in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare il contenuto a 10.000 G per 30 secondi a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 750 microlitri del tampone legante a ciascun tubo contenente 250 microlitri di perle di conA-salsorosio. Centrifugare i tubi a 10.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Quindi, preparare due diluizioni della soluzione di amilopectina solubilizzata per produrre una serie di soluzioni di amilopectina diluita da due millilitri.Per preparare le perle di amilopectina ConA-sinforosio, aggiungere 250 microlitri di ciascuna soluzione di amilopectina diluita ai tubi contenenti 250 microlitri di perle ConA-salsorosio preequilibrate e tampone legante. Mescolare bene il contenuto ed etichettare i tubi con la corrispondente concentrazione di amilopectina. Incubare il contenuto del tubo su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per 30 minuti e centrifugare i tubi a 10.000 G per un minuto.Mescolare 250 microlitri di perle di amilopectina ConA-sepharose con 100 microlitri del tampone legante contenente 10 microgrammi di amido in eccesso quattro, o proteina SEX4, 10 millimolari di ditiotreitolo e 10 micromolari di cocktail inibitore della proteasi. Incubare il contenuto a quattro gradi Celsius per 45 minuti con una leggera rotazione. Quindi centrifugare i tubi a 10.000 G per un minuto e pipettare accuratamente 50 microlitri di surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Aggiungere 20 microlitri di colorante per pagine 4X SDS e 10 microlitri di acqua distillata a ciascun tubo contenente 50 microlitri delle frazioni di surnatante raccolte ed etichettarle come S.Allo stesso modo, aggiungere 20 microlitri di colorante per pagine 4X SDS e 80 microlitri di acqua distillata nei tubi contenenti perle di amilopectina SEX4 di ConA-sepharose lavate. Dopo aver aggiunto colorante e acqua, riscaldare tutti i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta che le sfere di amilopectina SEX4 ConA-sepharose sono centrifugate a 10.000 G per un minuto, salvare il surnatante ed etichettarlo come P.Caricare 40 microlitri dei campioni proteici non legati etichettati come S in pozzetti di gel di poliacrilammide prefabbricati dal 4 al 12% dalla concentrazione di substrato più bassa alla più alta, riservando la prima corsia per un marcatore di peso molecolare proteico.Utilizzare un secondo gel per caricare i campioni di proteine legate al glucano etichettati P.Aggiungere il tampone SDS appena preparato in entrambe le camere dell'apparecchio e far scorrere il gel a 150 volt per 35 minuti o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. Quindi prendere la cassetta di gel dall'apparecchio e rimuovere i distanziatori e le lastre di vetro per separare il gel per l'analisi western blot. Fare un litro di tampone di trasferimento contenente 5,8 grammi di tris base, 2,9 grammi di glicina, 0,37 grammi di SDS e 200 millilitri di metanolo.Per trasferire le proteine separate dal gel di poliacrilammide a una membrana di nitrocellulosa, assemblare le spugne, le carte da filtro, il gel e la membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo di trasferimento occidentale e funzionare a 70 volt per un'ora. Dopo aver eseguito il gel, incubare la membrana di nitrocellulosa in una soluzione proteica dall'1 al 5% di albumina sierica bovina o proteine del latte in 50 millilitri di tampone TBST per un'ora per prevenire il legame proteico non specifico. Lavare la membrana tre volte utilizzando tampone TBST per rimuovere qualsiasi soluzione di blocco non legata.Quindi, incubare la membrana per un'ora con l'anticorpo diluito legato alla perossidasi di rafano specifico per la proteina marcata con istidina. Quindi lavare la membrana tre volte nel tampone TBST per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Per l'imaging digitale, fare una soluzione di parti uguali di soluzioni di substrato chemiluminescente, 750 microlitri ciascuna in un tubo da 1,5 millilitri, e incubare la membrana per almeno cinque minuti nella soluzione.Posizionare la proteina di membrana rivolta verso il basso sullo scanner blot ed eseguire il software di acquisizione per quantificare la proteina sia nella frazione pellet che in quella surnatante Per acquisire i dati, avviare le misurazioni quantitative del segnale utilizzando il software di acquisizione con lo scanner blot. Normalizzare tutte le misurazioni quantitative nelle frazioni di surnatante e pellet al totale delle proteine caricate.Nell'esperimento di legame saturante, tracciare la percentuale di proteine legate rispetto alla concentrazione di amilopectina e adattare i dati utilizzando il software di analisi dei dati per calcolare la costante di dissociazione, Kd.La capacità di legame di SEX4 alle perle di amilopectina ConA-sepharose è stata analizzata utilizzando la pagina SDS. È stata osservata la presenza della proteina SEX4 nella frazione pellet e dell'albumina sierica bovina nella frazione surnatante . W278A, un noto mutante SEX4 con capacità di legame glucano significativamente ridotta, è apparso nella frazione surnatante indicando l'utilità e la specificità di questo test.L'analisi Western blotting ha rivelato un aumento significativo nel rilevamento di SEX4 e il metodo è specifico per rilevare fosfati di glucano con un tag di istidina terminale terminale. Il saggio di cosedimentazione è stato testato a tre diverse concentrazioni di SEX4. Mentre due microgrammi di SEX4 sono sufficienti per visualizzare attraverso il rilevamento a chemiluminescenza, l'utilizzo di cinque o 10 microgrammi di SEX4 consente un rilevamento più accurato.Inoltre, è stato notato un aumento del legame SEX4 con un aumento della concentrazione di amilopectina. È stata determinata l'affinità di legame dell'amilopectina e della proteina wild type SEX4 a diverse concentrazioni e i dati relativi alla percentuale di proteine legate al modello specifico di legame di un sito hanno dato un Kd di circa 1,03 milligrammi per millilitro. È stata valutata l'applicabilità di questo metodo per misurare il legame di laforina, LSF2, mais SEX4 e patata SEX4 contro l'amilopectina di patata.I risultati hanno dimostrato che le proteine testate provenienti da colture agronomicamente importanti sono anche legate in modo differenziale all'amilopectina. È fondamentale ricordare la normalizzazione di tutte le misurazioni quantitative nelle frazioni pellet e surnatante al totale delle proteine caricate. Per garantire che tutta l'amilopectina sia legata alle perle, salvare le frazioni surnatanti per eseguire il test del glucosio profondo in un secondo momento.La fosfatasi glucana è impiegata meccanismi distinti per legare, localizzare e defosforilare i carboidrati. Questo metodo consente l'esplorazione del legame della glucanofosfatasi a diversi domini strutturali all'interno di grandi complessi polimerici per la defosforilazione specifica della posizione.

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