Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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この研究は、国立科学財団賞MCB-2012074によってサポートされました。著者らは、貴重な議論と支援を提供してくれたフロリダ大学生化学分子生物学部のクレイグW.ヴァンダークーイ博士に感謝します。著者らはまた、フロリダ大学生化学・分子生物学部のマシュー・S・ジェントリー博士の支援に感謝している。スキッドモア大学神経科学プログラムの議長であるサラ・ラガルワー博士に、ウェスタンブロットイメージングにLICORC桁ブロットスキャナーの使用を許可してくださったことに感謝します。

1. ConA-セファロースビーズの調製
<ol><li>67 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl 2、および 0.2 mM CaCl2 を含む結合バッファー 250 mL を作製します。1 M NaOH溶液を使用してpHを調整します。</li>
	<li>250 μLのConA-セファロースビーズ懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。内容物を10,000 x g で4°Cで30秒間遠心分離します。 上清を捨てる。 注:アッセイに使?...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

この研究は、グルカン-グルカンホスファターゼ相互作用の結合親和性の決定を可能にする新しい in vitro 沈降アッセイの開発に成功したことを示しています。アッセイデザインでは、グルコースのヒドロキシル残基 を介した グルカンへのレクチンConAの特異的結合を利用して、可溶化された炭水化物基質をセファロースビーズ上に間接的に捕捉します。これにより、遠心分離 ...

グルカンホスファターゼは、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)スーパーファミリー1内の二重特異性ホスファターゼ(DSP)の機能的に多様なサブファミリーのメンバーです。それらは、広く異なる光合成生物、人間、脊椎動物、および一部の無脊椎動物や原生生物を含むほとんどの生命体で発見されています2,3,4。植物には、デンプン過剰4(SEX4)、ライクセックスフォー1(LSF1)、およびライクセックスフォー2(LSF2)5,6,7の3つの既知のグルカンホスファターゼが含まれています。グルカンホスファターゼを欠く植物は、一時的なデンプンの分解と葉のデンプンの蓄積の速度が低下します8,9。ラフォリンは、脊椎動物およびヒトのグリコーゲンを脱リン酸化するグルカンホスファターゼファミリーの創設メンバーです3,10。ラフォリンの変異は、てんかんの致命的な常染色体劣性形態である神経変性ラフォラ病をもたらします11。グルカンホスファターゼはグリコーゲンとデンプンの代謝に必要であり、植物のデンプン含有量を調節し、神経変性ラフォラ病を治療するための重要な酵素として浮上しています12,13。モデルグルカン基質を用いたグルカンホスファターゼに関する最近のX線結晶構造解析研究は、基質結合とグルカン脱リン酸化の触媒機構を明らかにしています14,15,16,17。しかし、グルカンホスファターゼがそれらの生理学的基質にどのように結合するかについての現在の理解は不完全である。
デンプンは、80%〜90%のアミロペクチンと10%〜20%のアミロースからなるグルコースの不溶性ポリマーです18。植物グルカンホスファターゼの基質は、グリコーゲンやデンプン顆粒などのリン酸化炭水化物分子です。リン酸化グルコシル残基は、1:600のリン酸:グルコシル残基比で存在します。興味深いことに、リン酸塩はアミロペクチン分子19上にのみ存在する。主な植物グルカンホスファターゼSEX4は、デンプン顆粒に作用してアミロペクチン分子を脱リン酸化します。構造誘導突然変異誘発研究と組み合わせたSEX4のX線結晶構造は、グルカン構造内のさまざまな位置に対するSEX4のユニークな基質特異性を実証しました15。我々は最近、SEX4の生物学的に関連する活性は、その可溶化アミロペクチン基質20に作用するときにのみ観察できることを示した。しかし、グルカン-SEX4相互作用を理解することは、基質の構造の複雑さ、より広い結合特異性、およびタンパク質とその基質間の結合親和性が低いため、困難であることが証明されています。これらの問題により、等温滴定熱量測定(ITC)、核磁気共鳴(NMR)分光法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースのアッセイなど、タンパク質-リガンド相互作用で一般的に使用される方法を利用する能力が妨げられてきました。
興味深いことに、炭水化物とタンパク質の相互作用に関する私たちの理解の多くは、レクチンの研究から来ています。コンカナバリンA(ConA)は、もともとジャックビーンから抽出されたタンパク質のマメ科レクチンファミリーです。ConAは炭水化物に高い特異性で結合するため、薬物の標的化および送達用途での使用に有利です。非還元性α-D-マンノシルおよびα-D-グルコシルを含む様々な基質へのConAの結合は、広く研究されている19,20。市販のConA結合セファロースビーズは、糖タンパク質および糖脂質を精製するために一般的に使用されている21。ConAは、グルコース残基のC3、C4、およびC6ヒドロキシル基を介してこれらのグルカンに結合します。ConA-セファロースビーズは、グリコーゲン-タンパク質およびデンプン-タンパク質相互作用の結合を測定するためにも成功裏に使用されています22,23。本研究では、ConA-Sepharoseビーズを用いて、グルカンホスファターゼ-アミロペクチン相互作用の結合特異性を測定するための結合アッセイを開発しました。
以前は、グルカンホスファターゼ基質結合能を評価するためにConAベースの沈降アッセイが使用されていました14、20、24。この研究では、同じ戦略を使用して、グルカン-グルカンホスファターゼと炭水化物相互作用の結合親和性を決定するための新しい方法を開発しました。この方法は、様々な可溶化糖質-タンパク質相互作用を調べるための利点もある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

グルカンホスファターゼは、動物のグリコーゲンや植物のデンプンなどのグルカン基質を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼ(DSP)のより大きなファミリーに属します。モデルグルカン基質を有するグルカンホスファターゼの結晶構造は、DSPと糖鎖結合ドメインからなる明確なグルカン結合界面を明らかにする。しかし、グルカン-グルカンホスファターゼと生理学的に関連する基質との相互作用の定量的測定は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素の生物学的理解とエネルギー代謝の調節にとって基本的なものです。この原稿は、異なるグルカン基質に対するグルカンホスファターゼの基質結合親和性を検出するために設計されたConcanavalin A(ConA)ベースのin vitro沈降アッセイを報告しています。概念実証として、グルカンホスファターゼシロイヌナズナデンプン過剰4(SEX4)とアミロペクチンの解離定数(KD)を測定しました。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質-炭水化物相互作用の差次的結合を評価するためのこのアッセイの有用性をさらに実証しています。これらのデータは、広範囲のデンプンおよびグリコーゲン相互作用タンパク質の特性評価に対するこのアッセイの適合性を実証する。

グルカンホスファターゼファミリーのタンパク質の重要な特徴の1つは、グルカン基質に結合する能力です。まず、SEX4のConA-セファロース:アミロペクチンビーズへの結合能をSDS-PAGEを用いて分析した(図2A)。ウシ血清アルブミン(BSA)は、ConA-Sepharose:アミロペクチンビーズへのタンパク質の非特異的結合を検出するためのネガティブコントロールとして機能しました。タンパ...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

この方法は、グルカンホスファターゼとアミロペクチンの結合親和性を定量化するためのレクチンベースの in vitro 沈降アッセイを記載する。この共沈降アッセイは、グルカンホスファターゼ基質結合の測定に信頼性が高く、さまざまな可溶化グルカン基質に適用できます。

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

このコンカナバリンAベースのin vitro沈降アッセイは、異なるSTA基質に対するグルカンホスファターゼの結合親和性を測定するように設計されています。このメソッドから得られる情報は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素を理解するための基本です。炭水化物タンパク質の相互作用は比較的弱いため、現在の方法ではグルカンホスファターゼとグルカン相互作用を検出できません。当社のレクチンベースの沈降アッセイは、ミリモル範囲の結合親和性を検出できます。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質の糖鎖相互作用を定量化するこのアッセイの能力を実証しています。アッセイの最も困難な部分の1つは、基質の濃度範囲を最適化することです。アイデアを得るためにより広い範囲から始めて、次に特定の範囲に絞り込むことをお勧めします。まず、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。内容物を10, 000 Gで4°Cで30秒間遠心分離します。上清を廃棄した後、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズを含む各チューブに750マイクロリットルの結合バッファーを追加します。チューブを10, 000 Gで4°Cで1分間遠心分離し、上清を取り除きます。次に、可溶化アミロペクチン溶液の2倍希釈液を調製して、一連の2ミリリットルの希釈アミロペクチン溶液を作る。ConA-セファロースアミロペクチンビーズを調製するには、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズを事前に平衡化し結合バッファーを含むチューブに、希釈した各アミロペクチン溶液250マイクロリットルを加えます。内容物をよく混合し、対応するアミロペクチン濃度でチューブにラベルを付けます。.チューブの内容物を回転ホイール上で4°Cで30分間インキュベートし、チューブを10, 000 Gで1分間遠心分離します。250マイクロリットルのConA-セファロースアミロペクチンビーズを、10マイクログラムのデンプン過剰の4個またはSEX4タンパク質、10ミリモルのジチオスレイトール、および10マイクロモルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む100マイクロリットルの結合バッファーと混合します。内容物を摂氏4度で45分間、穏やかな回転でインキュベートします。次に、チューブを10, 000 Gで1分間遠心分離し、50マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに慎重にピペットで入れます。回収した上清画分50マイクロリットルを含む各チューブに20マイクロリットルの4X SDSページ染料と10マイクロリットルの蒸留水を加え、Sとラベル付けします。染料と水を加えた後、すべてのサンプルを摂氏95度で10分間加熱します。ConA-セファロースアミロペクチンSEX4ビーズを10, 000Gで1分間遠心分離したら、上清を保存し、P.Loadとして標識しますSとラベル付けされた40マイクロリットルの未結合タンパク質サンプルを、最低基質濃度から最高濃度まで4〜12%のプレキャストポリアクリルアミドゲルウェルに入れ、タンパク質分子量マーカー用の最初のレーンを確保します。2番目のゲルを使用して、P.Addとラベル付けされたグルカン結合タンパク質サンプルを装置の両チャンバーにロードし、ゲルを150ボルトで35分間、または色素前面がゲルの底に達するまで流します。次に、装置からゲルカセットを取り出し、スペーサーとガラスプレートを取り外して、ウェスタンブロット分析用のゲルを分離します。5.8グラムのトリス塩基、2.9グラムのグリシン、0.37グラムのSDS、および200ミリリットルのメタノールを含む1リットルの転写バッファーを作ります。サイズ分離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に移すには、ウエスタン転写プロトコルに従ってスポンジ、ろ紙、ゲル、ニトロセルロース膜を組み立て、70ボルトで1時間実行します。ゲルを実行した後、ニトロセルロース膜を50ミリリットルのTBSTバッファー中の1〜5%ウシ血清アルブミンまたは乳タンパク質のタンパク質溶液中で1時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合を防ぎます。TBSTバッファーを使用してメンブレンを3回洗浄し、結合していないブロッキング溶液を除去します。次に、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体をヒスチジンタグ付きタンパク質に特異的にインキュベートし、メンブレンを1時間インキュベートします。その後、メンブレンをTBSTバッファーで3回洗浄し、未結合の抗体を除去しました。デジタルイメージングの場合は、等量の化学発光基質溶液(1.5ミリリットルのチューブにそれぞれ750マイクロリットル)の溶液を作り、その溶液中でメンブレンを少なくとも5分間インキュベートします。膜タンパク質側を下にしてブロットスキャナーに置き、取得ソフトウェアを実行して、ペレット画分と上清画分の両方のタンパク質を定量します。データを取得するには、ブロットスキャナーで取得ソフトウェアを使用して定量信号測定を開始します。上清およびペレット画分中のすべての定量的測定値を、負荷された総タンパク質に正規化します。飽和結合実験では、アミロペクチン濃度に対する結合タンパク質の割合をプロットし、データ解析ソフトウェアを使用してデータを適合させ、解離定数Kd.ConA-セファロースアミロペクチンビーズへのSEX4の結合能をSDSページを用いて分析した。ペレット画分中のSEX4タンパク質および上清画分中のウシ血清アルブミンの存在が注目された。グルカン結合能が有意に低下した既知のSEX4変異体であるW278Aが上清画分に出現し、このアッセイの有用性と特異性を示しています。ウェスタンブロッティング分析により、SEX4の検出が大幅に増加し、この方法は末端にヒスチジンタグを持つグルカンリン酸の検出に特異的です。共沈降アッセイを3つの異なるSEX4濃度で試験した。化学発光検出で可視化するには2マイクログラムのSEX4で十分ですが、5マイクログラムまたは10マイクログラムのSEX4を使用すると、より正確な検出が可能になります。また、アミロペクチン濃度の増加に伴うSEX4結合の増加が認められた。異なる濃度でのアミロペクチンとSEX4野生型タンパク質の結合親和性を決定し、特定の1部位結合モデルに結合したタンパク質データの割合は、ミリリットルあたり約1.03ミリグラムのKdを与えた。ジャガイモアミロペクチンに対するラフォリン、LSF2、トウモロコシSEX4、およびジャガイモSEX4の結合を測定するためのこの方法の適用性を評価しました。結果は、農学的に重要な作物からの試験されたタンパク質もアミロペクチンに差動的に結合していることを実証した。ペレットおよび上清画分におけるすべての定量的測定値の、負荷された総タンパク質に対する正規化を覚えておくことが重要です。すべてのアミロペクチンがビーズに結合していることを確認するには、上清画分を保存して、後でディープグルコースアッセイを実行します。グルカンホスファターゼは、炭水化物に結合、位置特定、および脱リン酸化するために異なるメカニズムを採用しています。この方法では、位置特異的な脱リン酸化のために、大きなポリマー複合体内の異なる構造ドメインへのグルカンホスファターゼの結合を探索することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...