Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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이 연구는 국립 과학 재단 상 MCB-2012074의 지원을 받았습니다. 저자는 귀중한 토론과 지원을 해준 플로리다 대학교 생화학 및 분자 생물학과의 Craig W. Vander Kooi 박사에게 감사드립니다. 저자는 또한 플로리다 대학교 생화학 및 분자 생물학과의 Matthew S. Gentry 박사에게 그의 지원에 감사드립니다. 웨스턴 블롯 이미징을 위해 LICOR C-digit 블롯 스캐너를 사용할 수 있도록 허락해 주신 Skidmore College Neuroscience 프로그램의 의장인 Sara Lagalwar 박사에게 감사드립니다.

1. ConA-Sepharose 비드의 제조
<ol><li>67mM HEPES(pH 7.5), 10mM MgCl2 및 0.2mMCaCl2를 포함하는 결합 완충액 250mL를 만듭니다. 1 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조절한다.</li>
	<li>ConA-Sepharose 비드 현탁액 250μL를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 내용물을 10,000 x g 에서 4°C에서 30초 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 참고: 분석에 사용된 각 아밀로펙틴 농도에...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

이 연구는 글루칸-글루칸 포스파타제 상호작용의 결합 친화도를 측정할 수 있는 새로운 시험관 내 침강 분석의 성공적인 개발을 보여줍니다. 분석 설계는 포도당의 하이드록실 잔기를 통해 글루칸에 대한 렉틴 ConA의 특이적 결합을 활용하여 가용화된 탄수화물 기질을 세파로스 비드에 간접적으로 포획합니다. 이를 통해 원심분리를 통해 결합된 단백질 분획과 결합되지 않은 ?...

글루칸 포스파타제는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 슈퍼패밀리1 내에서 이중 특이성 포스파타제(DSP)의 기능적으로 다양한 서브패밀리의 구성원입니다. 그들은 광범위하게 발산하는 광합성 유기체, 인간, 척추 동물, 일부 무척추 동물 및 원생 생물을 포함한 대부분의 생명체에서 발견되었습니다 2,3,4. 식물에는 전분 과잉4 (SEX4), 성 4 (LSF1) 및 성 4 (LSF2) 5,6,7과 같은 세 가지 알려진 글루칸 포스파타제가 포함되어 있습니다. 글루칸 포스파타제가 결핍된 식물은 일시적인 전분 분해 및 잎의 전분 축적 비율이 감소합니다 8,9. Laforin은 척추 동물과 인간의 글리코겐을 탈인산화하는 글루칸 포스파타제 계열의 창립 멤버입니다 3,10. 라포린의 돌연변이는 신경퇴행성 라포라병을 유발하는데, 이는 치명적인 상염색체 열성 형태의 간질이다11. 글루칸 포스파타제는 글리코겐과 전분 대사에 필요하며 식물의 전분 함량을 조절하고 신경퇴행성 라포라병을 치료하는 중요한 효소로 부상했습니다12,13. 모델 글루칸 기질을 가진 글루칸 포스파타제에 대한 최근의 X선 결정학 연구는 기질 결합 및 글루칸 탈인산화의 촉매 메커니즘에 대해 밝혔습니다14,15,16,17. 그러나 글루칸 포스파타제가 생리학적 기질에 어떻게 결합하는지에 대한 현재의 이해는 불완전합니다.
전분은 80%-90% 아밀로펙틴과 10%-20% 아밀로오스로 만들어진 포도당의 불용성 중합체입니다18. 식물 글루칸 포스파타제의 기질은 글리코겐 및 전분 과립과 같은 인산화된 탄수화물 분자입니다. 인산화된 글루코실 잔기는 1:600 포스페이트:글루코실 잔기 비율로 존재한다. 흥미롭게도, 인산염은 아밀로펙틴 분자에만 존재한다19. 주요 식물 글루칸 포스파타제 SEX4는 전분 과립에 작용하여 아밀로펙틴 분자를 탈인산화합니다. 구조 유도 돌연변이 유발 연구와 결합된 SEX4의 X선 결정 구조는 글루칸 구조 내의 다양한 위치에 대한 SEX4의 고유한 기질 특이성을 입증했습니다15. 우리는 최근에 SEX4의 생물학적으로 관련된 활성이 가용화된 아밀로펙틴 기질에 작용할 때만 관찰될 수 있음을 보여주었습니다20. 그러나 글루칸-SEX4 상호작용을 이해하는 것은 기질의 구조적 복잡성, 더 넓은 결합 특이성, 단백질과 그 기질 사이의 낮은 결합 친화도로 인해 어려운 것으로 입증되었습니다. 이러한 문제는 등온 적정 열량측정법(ITC), 핵자기 공명(NMR) 분광법 및 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기반 분석과 같은 단백질-리간드 상호작용에 일반적으로 사용되는 방법을 활용하는 능력을 방해했습니다.
흥미롭게도 탄수화물-단백질 상호 작용에 대한 우리의 이해의 대부분은 렉틴을 연구하는 데서 비롯되었습니다. 콘카나발린 A(ConA)는 원래 잭빈에서 추출한 콩과 식물 렉틴 계열의 단백질입니다. ConA는 높은 특이성으로 탄수화물을 결합하므로 약물 표적화 및 전달 응용 분야에 사용하기에 유리합니다. 비환원성 α-D-만노실 및 α-D-글루코실을 함유하는 다양한 기질에 대한 ConA의 결합이 광범위하게 연구되었다19,20. 상업적으로 이용 가능한 ConA-결합 세파로스 비드는 일반적으로 당단백질과 당지질을 정제하는 데 사용된다21. ConA는 포도당 잔기의 C3, C4 및 C6 하이드록실 그룹을 통해 이러한 글루칸에 결합합니다. ConA-Sepharose 비드는 또한 글리코겐-단백질 및 전분-단백질 상호작용의 결합을 측정하는 데 성공적으로 사용되었습니다22,23. 이 연구에서 우리는 ConA-Sepharose 비드를 사용하여 글루칸 포스파타제-아밀로펙틴 상호작용의 결합 특이성을 측정하기 위한 결합 분석을 개발했습니다.
이전에는 글루칸 포스파타제 기질 결합 능력 14,20,24를 평가하기 위해 ConA 기반 침강 분석이 사용되었습니다. 이 연구에서는 글루칸-글루칸 포스파타제와 탄수화물 상호작용의 결합 친화도를 결정하는 새로운 방법을 개발하는 데 동일한 전략이 사용되었습니다. 이 방법은 또한 다양한 가용화 탄수화물-단백질 상호 작용을 조사하는 데 이점이 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

글루칸 포스파타제는 동물의 글리코겐 및 식물의 전분과 같은 글루칸 기질을 탈인산화하는 이중 특이성 포스파타제(DSP)의 더 큰 계열에 속합니다. 모델 글루칸 기질을 가진 글루칸 포스파타제의 결정 구조는 DSP와 탄수화물 결합 도메인으로 만들어진 뚜렷한 글루칸 결합 계면을 나타냅니다. 그러나 생리학적으로 관련된 기질과의 글루칸-글루칸 포스파타제 상호작용의 정량적 측정은 글루칸 포스파타제 효소 계열의 생물학적 이해와 에너지 대사 조절의 기본입니다. 이 원고는 다른 글루칸 기질에 대한 글루칸 포스파타제의 기질 결합 친화도를 검출하도록 설계된 Concanavalin A(ConA) 기반 시험관 내 침강 분석을 보고합니다. 개념 증명으로서, 글루칸 포스파타제 Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) 및 아밀로펙틴의 해리 상수(KD)를 측정하였다. SEX4 돌연변이 및 글루칸 포스파타제 효소 계열의 다른 구성원의 특성화는 단백질-탄수화물 상호 작용의 차등 결합을 평가하기 위한 이 분석의 유용성을 추가로 입증합니다. 이러한 데이터는 광범위한 전분 및 글리코겐 상호작용 단백질을 특성화하기 위한 이 분석의 적합성을 입증합니다.

글루칸 포스파타제 단백질 계열의 주요 특징 중 하나는 글루칸 기질에 결합하는 능력입니다. 먼저, ConA-Sepharose:amylopectin beads에 대한 SEX4의 결합능을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다(도 2A). 소 혈청 알부민(BSA)은 ConA-Sepharose:amylopectin 비드에 대한 단백질의 비특이적 결합을 검출하기 위한 음성 대조군 역할을 했습니다. 단백질의 SDS-PAGE 분석은 펠렛 분획에서 SEX4 단백질의 존재와 ...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

이 방법은 글루칸 포스파타제와 아밀로펙틴의 결합 친화도를 정량화하기 위한 렉틴 기반 시험관 내 침강 분석을 설명합니다. 이 공동 침강 분석은 글루칸 포스파타제 기질 결합을 측정하는 데 신뢰할 수 있으며 다양한 가용화된 글루칸 기질에 적용할 수 있습니다.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

이 concanavalin A 기반 시험관 내 침강 분석은 다양한 STA 기질에 대한 글루칸 포스파타제의 결합 친화도를 측정하도록 설계되었습니다. 이 방법에서 얻은 정보는 글루칸 포스파타제 효소 계열을 이해하는 데 기본입니다. 탄수화물 단백질 상호작용은 상대적으로 약하기 때문에 현재의 방법으로는 글루칸 포스파타제와 글루칸 상호작용을 검출할 수 없습니다.당사의 렉틴 기반 응고 분석은 밀리몰 범위의 결합 친화도를 감지할 수 있습니다. SEX4 돌연변이체와 글루칸 포스파타제 효소 계열의 다른 구성원의 특성화는 단백질 탄수화물 상호작용을 정량화하는 이 분석의 능력을 보여줍니다. 분석에서 가장 어려운 부분 중 하나는 기질의 농도 범위를 최적화하는 것입니다.아이디어를 얻기 위해 더 넓은 범위로 시작한 다음 특정 범위로 좁히는 것이 좋습니다. 시작하려면 250마이크로리터의 ConA-세파로스 비드 현탁액을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 섭씨 4도에서 30 초 동안 10, 000 G에서 내용물을 원심 분리합니다.상청액을 버린 후, 750 마이크로리터의 결합 완충액을 250 마이크로리터의 ConA-세파로스 비드를 함유하는 각 튜브에 첨가한다. 튜브를 섭씨 4도에서 1 분 동안 10, 000 G에서 원심 분리하고 상청액을 제거합니다. 다음으로, 가용화된 아밀로펙틴 용액의 2배 희석액을 제조하여 일련의 2밀리리터 희석된 아밀로펙틴 용액을 만든다.ConA-세파로스 아밀로펙틴 비드를 제조하기 위해, 250 마이크로리터의 ConA-세파로스 비드 사전 평형 및 결합 완충액을 함유하는 튜브에 각각의 희석된 아밀로펙틴 용액 250 마이크로리터를 첨가한다. 내용물을 잘 섞고 해당 아밀로펙틴 농도로 튜브에 라벨을 붙입니다. 튜브 내용물을 섭씨 4도에서 30 분 동안 회전하는 휠에서 배양하고 튜브를 10, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리합니다.250 마이크로리터의 ConA-세파로스 아밀로펙틴 비드를 10 마이크로그램의 전분 과잉 4 또는 SEX4 단백질, 10 밀리몰의 디티오트레이톨 및 10 마이크로몰의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 결합 완충액 100 마이크로리터와 혼합합니다. 내용물을 섭씨 4도에서 45분 동안 부드럽게 회전시키면서 배양합니다. 그런 다음 튜브를 10, 000G에서 1 분 동안 원심 분리하고 50 마이크로 리터의 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 조심스럽게 피펫합니다.수집 된 상청액 분획 50 마이크로 리터를 함유 한 각 튜브에 4X SDS 페이지 염료 20 마이크로 리터와 증류수 10 마이크로 리터를 추가하고 S.유사하게 20 마이크로 리터의 4X SDS 페이지 염료와 80 마이크로 리터의 증류수를 세척 된 ConA-sepharose amylopectin SEX4 비드가 들어있는 튜브에 첨가하십시오. 염료와 물을 첨가한 후 모든 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. ConA-sepharose amylopectin SEX4 비드가 10, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리되면 상청액을 저장하고 S로 표지 된 결합되지 않은 단백질 샘플의 P.Load 40 마이크로 리터를 가장 낮은 기질 농도에서 가장 높은 기질 농도에서 가장 높은 것까지 4-12 % 프리 캐스트 폴리 아크릴 아미드 젤 웰로 P.Load 라벨을 붙입니다.두 번째 젤을 사용하여 P.Add 새로 준비된 SDS 페이지 실행 버퍼를 장치의 두 챔버에 넣고 150 볼트에서 35 분 동안 또는 염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 젤을 실행합니다. 그런 다음 장치에서 겔 카세트를 꺼내 스페이서와 유리판을 제거하여 웨스턴 블롯 분석을 위해 겔을 분리합니다. 트리스 염기 5.8g, 글리신 2.9g, SDS 0.37g 및 메탄올 200ml를 포함하는 1리터의 전달 완충액을 만듭니다.폴리아크릴아미드 겔에서 니트로셀룰로오스 막으로 크기 분리된 단백질을 전달하기 위해 웨스턴 전달 프로토콜에 따라 스폰지, 여과지, 겔 및 니트로셀룰로오스 막을 조립하고 70볼트에서 1시간 동안 실행합니다. 겔을 실행한 후 니트로셀룰로오스 막을 1 내지 5%소 혈청 알부민 또는 우유 단백질의 단백질 용액에 50밀리리터의 TBST 완충액에 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질 결합을 방지한다. TBST 버퍼를 사용하여 멤브레인을 세 번 세척하여 결합되지 않은 차단 용액을 제거합니다.다음으로, 히스티딘 태그가 붙은 단백질에 특이적으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다아제 연결 항체와 함께 1시간 동안 멤브레인을 배양한다. 그런 다음 멤브레인을 TBST 완충액으로 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 디지털 이미징의 경우, 1.5 밀리리터 튜브에 각각 750 마이크로 리터의 화학 발광 기질 용액을 동일한 비율로 용액을 만들고 용액에서 최소 5 분 동안 멤브레인을 배양합니다.멤브레인 단백질 면이 아래로 향하도록 블롯 스캐너에 놓고 수집 소프트웨어를 실행하여 펠릿 및 상청액 분획 모두에서 단백질을 정량화합니다. 데이터를 수집하려면 블롯 스캐너와 함께 수집 소프트웨어를 사용하여 정량적 신호 측정을 시작하십시오. 상층액 및 펠릿 분획의 모든 정량적 측정을 로드된 총 단백질로 정규화합니다.포화 결합 실험에서, 결합 된 단백질 대 아밀로펙틴 농도의 백분율을 플롯하고 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 피팅하여 해리 상수를 계산하고, Kd.The SEX4의 결합 능력을 ConA-sepharose amylopectin beads에 SDS 페이지를 사용하여 분석했습니다. 펠렛 분획에서 SEX4 단백질의 존재와 상청액 분획에서 소 혈청 알부민의 존재가 주목되었다. 현저히 감소된 글루칸 결합 능력을 갖는 알려진 SEX4 돌연변이체인 W278A가 상청액 분획에 나타났으며, 이는 이 분석의 유용성과 특이성을 나타냅니다.웨스턴 블랏팅 분석에서 SEX4 검출이 크게 증가한 것으로 나타났으며, 이 방법은 말단 히스티딘 태그로 글루칸 포스페이트를 검출하는 데 특이적입니다. cosedimentation 분석은 세 가지 다른 SEX4 농도에서 테스트되었습니다. 2마이크로그램의 SEX4는 화학발광 검출을 통해 시각화하기에 충분하지만, 5마이크로그램 또는 10마이크로그램의 SEX4를 사용하면 보다 정확한 검출이 가능합니다.또한, 증가 된 아밀로펙틴 농도와 함께 증가 된 SEX4 결합이 주목되었다. 상이한 농도에서 아밀로펙틴 및 SEX4 야생형 단백질의 결합 친화도를 측정하고, 특정 부위 결합 모델에 결합된 단백질 퍼센트 데이터는 밀리리터당 대략 1.03 밀리그램의 Kd를 생성하였다. 감자 아밀로펙틴에 대한 라포린, LSF2, 옥수수 SEX4 및 감자 SEX4의 결합을 측정하기 위한 이 방법의 적용 가능성을 평가했습니다.결과는 농업학적으로 중요한 작물에서 테스트된 단백질도 아밀로펙틴에 차별적으로 결합되어 있음을 입증했습니다. 펠릿 및 상청액 분획의 모든 정량적 측정을 로드된 총 단백질로 정규화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 모든 아밀로펙틴이 비드에 결합되도록 하려면 상청액 분획을 저장하여 나중에 심포도당 분석을 수행합니다.글루칸 포스파타제는 탄수화물을 결합하고, 위치를 파악하고, 탈인산화하는 뚜렷한 메커니즘을 사용합니다. 이 방법을 사용하면 위치 특이적 탈인산화를 위해 대형 고분자 복합체 내의 다양한 구조 도메인에 대한 글루칸 포스파타제의 결합을 탐색할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...