Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Science Foundation-prisen MCB-2012074. Forfatterne takker Dr. Craig W. Vander Kooi fra University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology for verdifulle diskusjoner og støtte. Forfatterne takker også Dr. Matthew S. Gentry fra University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology for hans støtte. Vi vil gjerne takke Dr. Sara Lagalwar, leder av Skidmore College Neuroscience-programmet, for å tillate oss å bruke LICOR C-digit blot-skanneren for western blot-bildebehandling.

1. Fremstilling av ConA-Sepharose perler
<ol><li>Lag 250 ml av en bindingsbuffer som inneholder 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 og 0,2 mM CaCl2. Juster pH med 1 M NaOH-løsning.</li>
	<li>Pipette 250 μL ConA-Sepharose perle suspensjon i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger innholdet ved 10 000 x g i 30 s ved 4 °C. Kast supernatanten. MERK: 250 μL ConA-Sepharose-perler i et 1,5 ml mikrosentrifugerør er nødvendig for hver amylopektinkonsentrasjon som bruke...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Denne studien demonstrerer den vellykkede utviklingen av en ny in vitro sedimenteringsanalyse som tillater bestemmelse av bindingsaffiniteten til glukan-glukanfosfatase-interaksjoner. Analysedesignet utnytter den spesifikke bindingen av lektin ConA til glukaner via hydroksylrester av glukose for indirekte å fange oppløselige karbohydratsubstrater på sefaroseperler. Dette tillater separasjon av bundne og ubundne proteinfraksjoner via sentrifugering og bestemmelse av bindingsaffiniteten til so...

Glukanfosfataser er medlemmer av en funksjonelt mangfoldig underfamilie av fosfataser med dobbel spesifisitet (DSP) innenfor proteintyrosinfosfatase (PTP) superfamilien1. De har blitt funnet i de fleste livsformer, inkludert vidt forskjellige fotosyntetiske organismer, mennesker, virveldyr og noen virvelløse dyr og protister 2,3,4. Planter inneholder tre kjente glukanfosfataser: Stivelsesoverskudd4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) og Like Sex Four2 (LSF2) 5,6,7. Planter som mangler glukanfosfataser viser reduserte mengder forbigående stivelsesnedbrytning og akkumulering av stivelse i bladene 8,9. Laforin er grunnleggeren av glukanfosfatasefamilien som defosforylerer glykogen hos virveldyr og mennesker 3,10. Mutasjonene av laforin resulterer i nevrodegenerativ Lafora sykdom, en dødelig autosomal recessiv form for epilepsi11. Glukanfosfataser er nødvendige for glykogen- og stivelsesmetabolisme og har dukket opp som viktige enzymer for modulering av stivelsesinnhold i planter og behandling av nevrodegenerativ Lafora sykdom12,13. Nylige røntgenkrystallografistudier på glukanfosfataser med modellglukansubstrater har kastet lys over substratbinding og den katalytiske mekanismen for glukandefosforylering14,15,16,17. Imidlertid er den nåværende forståelsen av hvordan glukanfosfataser binder seg til deres fysiologiske substrater ufullstendig.
Stivelse er en uoppløselig polymer av glukose laget av 80% -90% amylopektin og 10% -20% amylose18. Substratene for planteglukanfosfataser er fosforylerte karbohydratmolekyler, slik som glykogen og stivelsesgranulat. De fosforylerte glukosylrestene er tilstede ved et fosfat: glukosylrestforhold på 1:600. Interessant nok er fosfatene bare tilstede på amylopektinmolekylene19. Hovedanlegget glukanfosfatase SEX4 virker på stivelsesgranulatet for å defosforylat amylopektinmolekyler. Røntgenkrystallstrukturen til SEX4 kombinert med strukturstyrte mutagenesestudier har vist de unike substratspesifisitetene til SEX4 for forskjellige posisjoner i en glukanstruktur15. Vi har nylig vist at den biologisk relevante aktiviteten til SEX4 kun kan observeres når den virker på dets oppløselige amylopektinsubstrater20. Imidlertid har forståelse av glukan-SEX4-interaksjoner vist seg å være vanskelig på grunn av substratets strukturelle kompleksitet, bredere bindingsspesifisiteter og lave bindingsaffiniteter mellom proteinet og dets substrater. Disse problemene har hindret muligheten til å utnytte metoder som vanligvis brukes i protein-ligand-interaksjoner, for eksempel isotermisk titreringskalorimetri (ITC), kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) -baserte analyser.
Interessant nok har mye av vår forståelse av karbohydrat-protein-interaksjoner kommet fra å studere lektiner. Concanavalin A (ConA) er en legume lektin familie av proteiner opprinnelig ekstrahert fra jack bean. ConA binder karbohydrater med høy spesifisitet, noe som er fordelaktig for bruk i legemiddelmålretting og leveringsapplikasjoner. Bindingen av ConA til en rekke substrater som inneholder ikke-reduserende α-D-mannosyl og α-D-glukosyl har blitt grundig studert19,20. Kommersielt tilgjengelige ConA-bundne sefaroseperler brukes ofte til å rense glykoproteiner og glykolipider21. ConA binder seg til disse glukanene via C3-, C4- og C6-hydroksylgruppene i glukoserestene. ConA-Sepharose perler har også blitt brukt til å måle bindingen av glykogen-protein og stivelse-protein interaksjoner22,23. I denne studien brukte vi ConA-Sepharose-perler til å utvikle en bindingsanalyse for å måle bindingsspesifisitetene til glukanfosfatase-amylopektin-interaksjoner.
Tidligere ble en ConA-basert sedimenteringsanalyse brukt for å vurdere glukanfosfatase-substratbindingsevne14,20,24. I denne studien ble den samme strategien brukt til å utvikle en ny metode for å bestemme bindingsaffiniteten til glukan-glukanfosfatase og karbohydratinteraksjoner. Denne metoden har også en fordel for å undersøke ulike løselige karbohydrat-protein-interaksjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Glukanfosfataser tilhører den større familien av fosfataser med dobbel spesifisitet (DSP) som defosforylerer glukansubstrater, slik som glykogen i dyr og stivelse i planter. Krystallstrukturene til glukanfosfatase med modellglukansubstrater avslører distinkte glukanbindende grensesnitt laget av DSP- og karbohydratbindende domener. Imidlertid er kvantitative målinger av glukan-glukanfosfatase-interaksjoner med fysiologisk relevante substrater grunnleggende for den biologiske forståelsen av glukanfosfatasefamilien av enzymer og regulering av energimetabolisme. Dette manuskriptet rapporterer en Concanavalin A (ConA)-basert in vitro sedimenteringsanalyse designet for å påvise substratbindingsaffiniteten til glukanfosfataser mot forskjellige glukansubstrater. Som et bevis på konseptet ble dissosiasjonskonstanten (KD) av glukanfosfatase Arabidopsis thaliana Stivelsesoverskudd4 (SEX4) og amylopektin bestemt. Karakteriseringen av SEX4-mutanter og andre medlemmer av glukanfosfatasefamilien av enzymer demonstrerer ytterligere nytten av denne analysen for å vurdere differensialbindingen av protein-karbohydratinteraksjoner. Disse dataene viser egnetheten til denne analysen til å karakterisere et bredt spekter av stivelses- og glykogen-interagerende proteiner.

En av nøkkelfunksjonene i glukanfosfatasefamilien av proteiner er deres evne til å binde seg til glukansubstrater. Først ble bindingskapasiteten til SEX4 til ConA-Sepharose: amylopektinperler analysert ved hjelp av SDS-PAGE (figur 2A). Bovint serumalbumin (BSA) fungerte som en negativ kontroll for å oppdage enhver uspesifikk binding av proteiner til ConA-Sepharose: amylopektinperlene. SDS-PAGE-analysen av proteiner viste tilstedeværelsen av SEX4-protein i pelletsfraksjonen og BSA i supe...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Denne metoden beskriver en lektinbasert in vitro sedimenteringsanalyse for å kvantifisere bindingsaffiniteten til glukanfosfatase og amylopektin. Denne samsedimenteringsanalysen er pålitelig for måling av glukanfosfatasesubstratbinding og kan påføres forskjellige løselige glukansubstrater.

Concanavalin A-basert sedimenteringsanalyse for å måle substratbinding av glukanfosfataser

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Denne concanavalin A-baserte in vitro sedimenteringsanalysen er designet for å måle bindingsaffiniteten til glukanfosfataser mot forskjellige STA-substrater. Informasjonen vi får fra denne metoden er grunnleggende for vår forståelse av glukanfosfatasefamilien av enzymer. Karbohydratproteininteraksjoner er relativt svake, derfor kan dagens metoder ikke oppdage glukanfosfatase og glukaninteraksjoner.Vår lektinbaserte kosedimenteringsanalyse kan påvise bindingsaffinitet i millimolarområdet. Karakteriseringen av SEX4-mutanter, så vel som andre medlemmer av glukanfosfatasefamilien av enzymer, demonstrerer evnen til denne analysen til å kvantifisere proteinkarbohydratinteraksjoner. En av de mest utfordrende delene av analysen er å optimalisere konsentrasjonsområdet til substratet.Vi anbefaler at du starter med et bredere utvalg for å få en idé og deretter begrenser deg til et bestemt område. For å begynne, pipett 250 mikroliter ConA-sepharose perler suspensjon i et 1,5 milliliter mikrosentrifuge rør. Sentrifuge innholdet ved 10.000 g i 30 sekunder ved fire grader Celsius.Etter å ha kastet supernatanten, tilsett 750 mikroliter av bindingsbufferen til hvert rør som inneholder 250 mikroliter ConA-sepharose-perler. Sentrifuge rørene ved 10.000 G i ett minutt ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Deretter tilberedes todelte fortynninger av den oppløselige amylopektinoppløsningen for å lage en serie på to milliliter fortynnede amylopektinoppløsninger.For å forberede ConA-sepharose amylopektinperlene, tilsett 250 mikroliter av hver fortynnet amylopektinoppløsning til rørene som inneholder 250 mikroliter ConA-sepharose-perler preequilibrert og bindende buffer. Bland innholdet godt og merk rørene med tilsvarende amylopektinkonsentrasjon. Inkuber rørinnholdet på et roterende hjul ved fire grader Celsius i 30 minutter og sentrifuge rørene ved 10.000 G i ett minutt.Bland 250 mikroliter ConA-sepharose amylopektinperler med 100 mikroliter av bindingsbufferen som inneholder 10 mikrogram stivelsesoverskudd fire, eller SEX4 protein, 10 millimolar dithiothreitol og 10 mikromolar proteaseinhibitorcocktail. Inkuber innholdet ved fire grader Celsius i 45 minutter med forsiktig rotasjon. Sentrifuge deretter rørene ved 10.000 G i ett minutt og forsiktig pipette 50 mikroliter av supernatanten inn i et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør.Tilsett 20 mikroliter 4X SDS-sidefargestoff og 10 mikroliter destillert vann til hvert rør som inneholder 50 mikroliter av de oppsamlede supernatantfraksjonene og merk dem som S.På samme måte tilsettes 20 mikroliter 4X SDS-sidefargestoff og 80 mikroliter destillert vann i rørene som inneholder vasket ConA-sepharose-amylopektin SEX4-perler. Etter tilsetning av fargestoff og vann, varme alle prøvene ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Når ConA-sepharose amylopektin SEX4-perlene er sentrifugert ved 10 000 G i ett minutt, lagre supernatanten og merk den som P.Last 40 mikroliter av de ubundne proteinprøvene merket som S i 4 til 12% prefabrikkerte polyakrylamidgelbrønner fra den laveste substratkonsentrasjonen til den høyeste, og reserverer den første banen for en proteinmolekylvektmarkør.Bruk en annen gel til å legge de glukanbundne proteinprøvene merket P.Legg til nylaget SDS-sidebuffer til begge kamrene i apparatet og kjør gelen på 150 volt i 35 minutter eller til fargestofffronten når bunnen av gelen. Ta deretter gelkassetten fra apparatet og fjern avstandsstykkene og glassplatene for å skille gelen for western blot-analyse. Lag en liter overføringsbuffer som inneholder 5,8 gram trisbase, 2,9 gram glycin, 0,37 gram SDS og 200 ml metanol.For å overføre størrelseseparerte proteiner fra polyakrylamidgelen til en nitrocellulosemembran, monter svampene, filterpapirene, gelen og nitrocellulosemembranen i henhold til vestlig overføringsprotokoll og kjør ved 70 volt i en time. Etter å ha kjørt gelen, inkuber nitrocellulosemembranen i en proteinløsning av 1 til 5% bovint serumalbumin eller melkeprotein i 50 ml TBST-buffer i en time for å forhindre uspesifikk proteinbinding. Vask membranen tre ganger med TBST-buffer for å fjerne ubundet blokkeringsløsning.Deretter inkuberer membranen i en time med det fortynnede pepperrotperoksidasekoblede antistoffet spesifikt for histidinmerket protein. Vask deretter membranen tre ganger i TBST-buffer for å fjerne eventuelle ubundne antistoffer. For digital bildebehandling, lag en løsning av like deler av kjemiluminescerende substratløsninger, 750 mikroliter hver i et 1, 5 milliliter rør, og inkuber membranen i minst fem minutter i løsningen.Plasser membranproteinsiden ned på blot-skanneren og kjør innsamlingsprogramvaren for å kvantifisere proteinet i både pellets- og supernatantfraksjonene. For å skaffe dataene, start de kvantitative signalmålingene ved hjelp av innsamlingsprogramvaren med blot-skanneren. Normaliser alle kvantitative målinger i supernatant- og pelletsfraksjonene til det totale proteinet som er lastet.I metningsbindingseksperimentet, plott prosentandelen proteinbundet versus amylopektinkonsentrasjon og pass på dataene ved hjelp av dataanalyseprogramvare for å beregne dissosiasjonskonstanten, Kd.Bindingskapasiteten til SEX4 til ConA-sepharose amylopektinperler ble analysert ved hjelp av SDS-side. Tilstedeværelsen av SEX4-protein i pelletsfraksjonen og bovint serumalbumin i supernatantfraksjonen ble notert. W278A, en kjent SEX4-mutant med signifikant redusert glukanbindingsevne, dukket opp i supernatantfraksjonen, noe som indikerer nytten og spesifisiteten av denne analysen.Vestlig blottingsanalyse viste en signifikant økning i påvisning av SEX4, og metoden er spesifikk for påvisning av glukanfosfater med en endeterminal histidinmerke. Kosedimentasjonsanalysen ble testet ved tre forskjellige SEX4-konsentrasjoner. Mens to mikrogram SEX4 er tilstrekkelig til å visualisere gjennom kjemiluminescensdeteksjon, tillater bruk av fem eller 10 mikrogram SEX4 mer nøyaktig deteksjon.Også økt SEX4-binding med økt amylopektinkonsentrasjon ble notert. Bindingsaffiniteten til amylopektin og SEX4 vilt type protein ved forskjellige konsentrasjoner ble bestemt, og prosentandelen proteinbundne data til den spesifikke bindingsmodellen på ett sted ga en Kd på ca. 1,03 milligram per milliliter. Anvendbarheten av denne metoden for å måle bindingen av laforin, LSF2, mais SEX4 og potet SEX4 mot potetamylopektin ble vurdert.Resultatene viste at de testede proteinene fra agronomisk viktige avlinger også er differensielt bundet til amylopektin. Det er avgjørende å huske normaliseringen av alle kvantitative målinger i pellets- og supernatantfraksjonene til det totale proteinbelastede. For å sikre at alt amylopektin er bundet til perlene, lagre supernatantfraksjonene for å utføre den dype glukoseanalysen senere.Glukanfosfatase brukes forskjellige mekanismer for å binde, lokalisere og defosforylere karbohydrater. Denne metoden tillater utforskning av glukanfosfatases binding til forskjellige strukturelle domener i store polymere komplekser for posisjonsspesifikk defosforylering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling av proteinbinding til F-aktin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...