Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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Este estudo foi apoiado pelo prêmio da National Science Foundation MCB-2012074. Os autores agradecem ao Dr. Craig W. Vander Kooi, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade da Flórida, pelas valiosas discussões e apoio. Os autores também agradecem ao Dr. Matthew S. Gentry, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade da Flórida, por seu apoio. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sara Lagalwar, presidente do programa de neurociência do Skidmore College, por nos permitir usar o scanner de blot de dígitos C LICOR para imagens de western blot.

1. Preparação de contas de-Sepharose
<ol><li>Completar 250 mL de um tampão de ligação contendo 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 e 0,2 mM CaCl2. Ajustar o pH utilizando solução de NaOH 1 M.</li>
	<li>Pipetar 250 μL de suspensão de esferas de-Sepharose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar o conteúdo a 10.000 x g durante 30 s a 4 °C. Descarte o sobrenadante. NOTA: 250 μL de esferas de-Sepharose em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sã...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Este estudo demonstra o desenvolvimento bem-sucedido de um novo ensaio de sedimentação in vitro que permite determinar a afinidade de ligação das interações glucano-glucana fosfatase. O projeto do ensaio aproveita a ligação específica da lectina aos glucanos através dos resíduos hidroxila de glicose para capturar indiretamente substratos de carboidratos solubilizados em esferas de Sepharose. Isso permite a separação de frações proteicas ligadas e não ligadas via centrifugação ...

As fosfatases glucanas são membros de uma subfamília funcionalmente diversa de fosfatases de dupla especificidade (DSPs) dentro dasuperfamília 1 da proteína tirosina fosfatase (PTP). Eles têm sido encontrados na maioria das formas de vida, incluindo organismos fotossintéticos amplamente divergentes, humanos, vertebrados e alguns invertebrados e protistas 2,3,4. As plantas contêm três fosfatases glucanas conhecidas: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Plantas que não possuem fosfatases glucanas apresentam taxas reduzidas de degradação transitória do amido e acúmulo de amido nas folhas 8,9. A laforina é o membro fundador da família das fosfatases glucanas, que desfosforila glicogênio em vertebrados e humanos 3,10. As mutações da laforina resultam em doença de Lafora neurodegenerativa, uma forma autossômica recessiva fatal de epilepsia11. As fosfatases glucanas são necessárias para o metabolismo do glicogênio e amido e têm emergido como enzimas importantes para a modulação do conteúdo de amido em plantas e tratamento da doença neurodegenerativa deLafora12,13. Estudos recentes de cristalografia de raios X em fosfatases de glucanas com substratos modelo de glucanas têm lançado luz sobre a ligação de substratos e o mecanismo catalítico da desfosforilação de glucanos14,15,16,17. No entanto, a compreensão atual de como as fosfatases glucanas se ligam a seus substratos fisiológicos é incompleta.
O amido é um polímero insolúvel de glicose à base de amilopectina a 80%-90% e amilose a 10%-20%18. Os substratos para as fosfatases glucanas vegetais são moléculas de carboidratos fosforilados, como glicogênio e grânulos de amido. Os resíduos de glucosil fosforilados estão presentes a uma razão fosfato:resíduo de glucosil de 1:600. Curiosamente, os fosfatos estão presentes apenas nas moléculas de amilopectina19. A principal planta glucana fosfatase SEX4 atua no grânulo de amido para desfosforilar moléculas de amilopectina. A estrutura cristalina de raios X do SEX4 combinada com estudos de mutagênese guiada por estrutura demonstrou as especificidades únicas do substrato do SEX4 para diferentes posições dentro de uma estrutura glucana15. Recentemente, demonstramos que a atividade biologicamente relevante do SEX4 só pode ser observada quando atua sobre seus substratos de amilopectina solubilizados20. No entanto, o entendimento das interações glucano-SEX4 tem se mostrado difícil devido à complexidade estrutural do substrato, especificidades de ligação mais amplas e baixas afinidades de ligação entre a proteína e seus substratos. Essas questões têm dificultado a capacidade de utilizar métodos comumente usados em interações proteína-ligante, tais como calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e ensaios baseados em ensaio imunoenzimático (ELISA).
Curiosamente, muito da nossa compreensão das interações carboidrato-proteína veio do estudo de lectinas. Concanavalina A () é uma leguminosa da família de proteínas extraídas originalmente do feijão-de-porco. O liga carboidratos com alta especificidade, o que é vantajoso para seu uso em aplicações de direcionamento e liberação de medicamentos. A ligação do a uma variedade de substratos contendo α-D-manosil e α-D-glicosil não redutores tem sido extensivamente estudada19,20. Esferas de Sepharose ligadas a comercialmente disponíveis são comumente usadas para purificar glicoproteínas e glicolipídios21. O liga-se a essas glucanas via grupos hidroxila C3, C4 e C6 dos resíduos de glicose. As esferas de-Sepharose também têm sido usadas com sucesso para medir a ligação das interações glicogênio-proteína e amido-proteína22,23. Neste estudo, usamos esferas-Sepharose para desenvolver um ensaio de ligação para medir as especificidades de ligação das interações fosfatase-amilopectina glucana.
Anteriormente, um ensaio de sedimentação baseado em foi empregado para avaliar a capacidade de ligação ao substrato da fosfatase glucana14,20,24. Neste estudo, a mesma estratégia foi usada para desenvolver um novo método para determinar a afinidade de ligação das interações glucano-glucana fosfatase e carboidrato. Este método também tem uma vantagem para investigar várias interações carboidrato-proteína solubilizadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

As fosfatases glucanas pertencem à maior família de fosfatases de dupla especificidade (DSP) que desfosforilam substratos glucanos, como glicogênio em animais e amido em plantas. As estruturas cristalinas da fosfatase glucana com substratos modelo de glucana revelam distintas interfaces de ligação glucanas feitas de DSP e domínios de ligação a carboidratos. No entanto, medidas quantitativas das interações glucano-glucana fosfatase com substratos fisiologicamente relevantes são fundamentais para o entendimento biológico da família de enzimas glucanas fosfatases e para a regulação do metabolismo energético. Este manuscrito relata um ensaio de sedimentação in vitro baseado em Concanavalina A () projetado para detectar a afinidade de ligação ao substrato das fosfatases glucanas contra diferentes substratos glucanos. Como prova de conceito, determinou-se a constante de dissociação (KD) da fosfatase de glucana Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) e amilopectina. A caracterização dos mutantes SEX4 e de outros membros da família de enzimas glucanas fosfatases demonstra ainda mais a utilidade deste ensaio para avaliar a ligação diferencial das interações proteína-carboidrato. Estes dados demonstram a adequação deste ensaio para caracterizar uma ampla gama de proteínas interagindo amido e glicogênio.

Uma das principais características da família de proteínas glucanas fosfatases é a sua capacidade de se ligar a substratos glucanos. Primeiramente, a capacidade de ligação do SEX4 às esferas de-Sepharose:amilopectina foi analisada usando SDS-PAGE (Figura 2A). A albumina de soro bovino (BSA) serviu como controle negativo para detectar qualquer ligação inespecífica de proteínas às esferas de-Sepharose:amilopectina. A análise das proteínas em SDS-PAGE mostrou a presença da prote?...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Este método descreve um ensaio de sedimentação in vitro baseado em lectina para quantificar a afinidade de ligação da fosfatase glucana e amilopectina. Este ensaio de co-sedimentação é confiável para medir a ligação do substrato glucana fosfatase e pode ser aplicado a vários substratos glucanos solubilizados.

Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Este ensaio de sedimentação in vitro baseado em concanavalina A foi projetado para medir a afinidade de ligação das fosfatases glucanas contra diferentes substratos STA. As informações que obtemos deste método são fundamentais para o entendimento da família de enzimas glucanas fosfatases. As interações de proteínas de carboidratos são relativamente fracas, portanto, os métodos atuais não podem detectar interações glucana fosfatase e glucana.Nosso ensaio de cossedimentação baseado em lectina pode detectar afinidade de ligação na faixa milimolar. A caracterização dos mutantes SEX4, bem como de outros membros da família de enzimas glucanas fosfatases, demonstra a capacidade deste ensaio em quantificar interações proteína-carboidrato. Uma das partes mais desafiadoras do ensaio é otimizar a faixa de concentração do substrato.Recomendamos começar com um intervalo mais amplo para ter uma ideia e, em seguida, reduzir para um intervalo específico. Para começar, pipetar 250 microlitros de esferas de-sepharose em suspensão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar o conteúdo a 10.000 G durante 30 segundos a quatro graus Celsius.Após o descarte do sobrenadante, adicionar 750 microlitros do tampão de ligação a cada tubo contendo 250 microlitros de esferas de-sefarose. Centrifugar os tubos a 10.000 G durante um minuto a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante. Em seguida, prepare duas diluições da solução de amilopectina solubilizada para fazer uma série de soluções de amilopectina diluídas de dois mililitros.Para preparar as esferas de amilopectina-sepharose, adicionar 250 microlitros de cada solução diluída de amilopectina aos tubos contendo 250 microlitros de esferas de-sefarose pré-equilibradas e tampão de ligação. Misture bem o conteúdo e rotule os tubos com a concentração de amilopectina correspondente. Incubar o conteúdo do tubo numa roda giratória a quatro graus Celsius durante 30 minutos e centrifugar os tubos a 10 000 G durante um minuto.Misture 250 microlitros de esferas de amilopectina-sepharose com 100 microlitros do tampão de ligação contendo 10 microgramas de amido em excesso de quatro, ou proteína SEX4, 10 milimolares de ditiotreitol e 10 micromolares de coquetel inibidor de protease. Incubar o conteúdo a quatro graus Celsius durante 45 minutos com rotação suave. Em seguida, centrifugar os tubos a 10.000 G por um minuto e pipetar cuidadosamente 50 microlitros do sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Adicionar 20 microlitros de corante de página 4X SDS e 10 microlitros de água destilada a cada tubo contendo 50 microlitros das frações sobrenadantes coletadas e rotulá-los como S.Da mesma forma, adicione 20 microlitros de corante de página 4X SDS e 80 microlitros de água destilada nos tubos contendo esferas lavadas de amilopectina-sepharose SEX4. Depois de adicionar corante e água, aqueça todas as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. Uma vez que as esferas de amilopectina-sepharose SEX4 são centrifugadas a 10.000 G por um minuto, salve o sobrenadante e rotule-o como P.Load 40 microlitros das amostras de proteína não ligadas rotuladas como S em poços de gel de poliacrilamida pré-moldados de 4 a 12% da menor concentração de substrato para a mais alta, reservando a primeira faixa para um marcador de peso molecular de proteína.Use um segundo gel para carregar as amostras de proteína ligadas à glucana rotuladas P.Adicione o tampão de corrida de página SDS recém-preparado para ambas as câmaras do aparelho e passe o gel a 150 volts por 35 minutos ou até que a frente do corante atinja o fundo do gel. Em seguida, retire o de gel do aparelho e remova os espaçadores e placas de vidro para separar o gel para análise de western blot. Faça um litro de tampão de transferência contendo 5,8 gramas de tris base, 2,9 gramas de glicina, 0,37 gramas de SDS e 200 mililitros de metanol.Para transferir as proteínas separadas do tamanho do gel de poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose, monte as esponjas, papéis de filtro, gel e membrana de nitrocelulose de acordo com o protocolo de transferência Western e funcione a 70 volts por uma hora. Após a execução do gel, incubar a membrana de nitrocelulose em uma solução proteica de 1 a 5% de albumina de soro bovino ou proteína do leite em 50 mililitros de tampão TBST por uma hora para evitar a ligação proteica inespecífica. Lave a membrana três vezes usando o tampão TBST para remover qualquer solução de bloqueio não ligada.Em seguida, incubar a membrana por uma hora com o anticorpo diluído ligado à peroxidase de raiz forte específico para a proteína marcada com histidina. Em seguida, lave a membrana três vezes em tampão TBST para remover quaisquer anticorpos não ligados. Para imagens digitais, faça uma solução de partes iguais de soluções de substrato quimioluminescente, 750 microlitros cada em um tubo de 1,5 mililitros, e incube a membrana por pelo menos cinco minutos na solução.Coloque a proteína de membrana de lado para baixo no scanner de manchas e execute o software de aquisição para quantificar a proteína nas frações pellet e sobrenadante. Para adquirir os dados, inicie as medições quantitativas do sinal usando o software de aquisição com o blot scanner. Normalizar todas as medidas quantitativas nas frações sobrenadante e pellet para a proteína total carregada.No experimento de ligação de saturação, plotar a porcentagem de proteína ligada versus concentração de amilopectina e ajustar os dados usando software de análise de dados para calcular a constante de dissociação, Kd.A capacidade de ligação de SEX4 a esferas de amilopectina-sepharose foi analisada usando a página SDS. Observou-se a presença da proteína SEX4 na fração pellet e albumina do soro bovino na fração sobrenadante. W278A, um mutante SEX4 conhecido com capacidade de ligação glucana significativamente reduzida, apareceu na fração sobrenadante, indicando a utilidade e especificidade deste ensaio.A análise de Western blotting revelou um aumento significativo na detecção de SEX4 e o método é específico para detectar fosfatos de glucanos com uma etiqueta de histidina terminal terminal. O ensaio de cossedimentação foi testado em três diferentes concentrações de SEX4. Enquanto dois microgramas de SEX4 são suficientes para visualizar através da detecção por quimioluminescência, o uso de cinco ou 10 microgramas de SEX4 permite uma detecção mais precisa.Além disso, observou-se aumento da ligação de SEX4 com aumento da concentração de amilopectina. A afinidade de ligação da amilopectina e da proteína selvagem SEX4 em diferentes concentrações foi determinada e os dados de ligação da proteína percentual ao modelo específico de ligação de um sítio deram um Kd de aproximadamente 1,03 miligramas por mililitro. Avaliou-se a aplicabilidade deste método para medir a ligação de laforina, LSF2, milho SEX4 e batata SEX4 contra amilopectina de batata.Os resultados demonstraram que as proteínas testadas de culturas agronomicamente importantes também estão diferencialmente ligadas à amilopectina. É crucial lembrar a normalização de todas as medidas quantitativas nas frações pellet e sobrenadante para o total de proteína carregada. Para garantir que toda a amilopectina esteja ligada às contas, guarde as frações sobrenadantes para realizar o ensaio de glicose profunda mais tarde.A fosfatase glucana emprega mecanismos distintos para ligar, localizar e desfosforilar carboidratos. Este método permite a exploração da ligação da fosfatase glucana a diferentes domínios estruturais dentro de grandes complexos poliméricos para desfosforilação específica de posição.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Bioquímica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...