Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Это исследование было поддержано премией Национального научного фонда MCB-2012074. Авторы благодарят доктора Крейга В. Вандера Кооя из Университета Флориды за ценные дискуссии и поддержку. Авторы также благодарят доктора Мэтью С. Джентри с факультета биохимии и молекулярной биологии Университета Флориды за его поддержку. Мы хотели бы поблагодарить доктора Сару Лагалвар, председателя программы неврологии колледжа Скидмор, за то, что она позволила нам использовать сканер блоттинга LICOR C-digit для визуализации вестерн-блоттинга.

1. Приготовление шариков ConA-Sepharose
<ol><li>Сделайте 250 мл связывающего буфера, содержащего 67 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl2 и0,2 мМ CaCl2. Отрегулируйте рН с помощью 1 М раствора NaOH.</li>
	<li>Пипетка 250 мкл суспензии шариков ConA-сефарозы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугир?...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Это исследование демонстрирует успешную разработку нового седиментационного анализа in vitro , который позволяет определить аффинность связывания взаимодействий глюкан-глюканфосфатазы. В дизайне анализа используется специфическое связывание лектина ConA с глюканами через гид?...

Глюканфосфатазы являются членами функционально разнообразного подсемейства фосфатаз двойной специфичности (DSP) в суперсемействе белковой тирозинфосфатазы (PTP)1. Они были обнаружены в большинстве форм жизни, включая широко расходящиеся фотосинтезирующие организмы, людей, позвоночных и некоторых беспозвоночных и простейших 2,3,4. Растения содержат три известные глюканфосфатазы: избыток крахмала4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) и Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Растения, в которых отсутствует глюканфосфатаза, демонстрируют пониженные скорости преходящей деградации крахмала и накопления крахмала в листьях 8,9. Лафорин является членом-основателем семейства глюканфосфатаз, которые дефосфорилируют гликоген у позвоночных и человека 3,10. Мутации лафорина приводят к нейродегенеративной болезни Лафора, фатальной аутосомно-рецессивной форме эпилепсии11. Глюканфосфатазы необходимы для метаболизма гликогена и крахмала и стали важными ферментами для модуляции содержания крахмала в растениях и лечения нейродегенеративной болезни Лафора12,13. Недавние рентгеновские кристаллографические исследования глюканфосфатаз с модельными глюкановыми субстратами пролили свет на связывание субстрата и каталитический механизм дефосфорилирования глюкана14,15,16,17. Однако нынешнее понимание того, как глюканфосфатазы связываются со своими физиологическими субстратами, является неполным.
Крахмал представляет собой нерастворимый полимер глюкозы, состоящий из 80-90% амилопектина и 10-20% амилозы18. Субстратами для растительных глюканфосфатаз являются фосфорилированные молекулы углеводов, такие как гранулы гликогена и крахмала. Фосфорилированные остатки глюкозила присутствуют в соотношении 1:600 фосфат к глюкозильному остатку. Интересно, что фосфаты присутствуют только на молекулах амилопектина19. Основная растительная глюканфосфатаза SEX4 действует на гранулы крахмала, дефосфорилируя молекулы амилопектина. Рентгеновская кристаллическая структура SEX4 в сочетании с структурно-ориентированными исследованиями мутагенеза продемонстрировала уникальную специфичность субстрата SEX4 для различных положений в структуре глюкана15. Недавно мы показали, что биологически значимая активность SEX4 может наблюдаться только при воздействии на его солюбилизированные амилопектиновые субстраты20. Однако понимание взаимодействий глюкан-SEX4 оказалось трудным из-за структурной сложности субстрата, более широкой специфики связывания и низкого сродства связывания между белком и его субстратами. Эти проблемы препятствовали возможности использования методов, обычно используемых в белково-лигандных взаимодействиях, таких как изотермическая титрационная калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и анализы на основе иммуноферментного анализа (ИФА).
Интересно, что большая часть нашего понимания углеводно-белковых взаимодействий пришла из изучения лектинов. Конканавалин А (ConA) представляет собой семейство белков лектина бобовых, первоначально извлеченных из бобов. ConA связывает углеводы с высокой специфичностью, что выгодно для его использования в нацеливании и доставке лекарств. Широко изучено связывание ConA с различными субстратами, содержащими невосстанавливающие α-D-маннозил и α-D-глюкозил19,20. Коммерчески доступные гранулы сефарозы, связанные с ConA, обычно используются для очистки гликопротеинов и гликолипидов21. ConA связывается с этими глюканами через гидроксильные группы C3, C4 и C6 остатков глюкозы. Шарики ConA-сефарозы также успешно использовались для измерения связывания взаимодействия гликоген-белок и крахмал-белок22,23. В этом исследовании мы использовали шарики ConA-сефарозы для разработки анализа связывания для измерения специфичности связывания взаимодействия глюканфосфатазы и амилопектина.
Ранее для оценки способности связывания субстрата глюканфосфатазы использовался седиментационный анализна основе ConA 14,20,24. В этом исследовании та же стратегия была использована для разработки нового метода определения аффинности связывания глюкан-глюканфосфатазы и углеводных взаимодействий. Этот метод также имеет преимущество для исследования различных солюбилизированных углеводно-белковых взаимодействий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Глюканфосфатазы принадлежат к более крупному семейству фосфатаз двойной специфичности (DSP), которые дефосфорилируют субстраты глюканов, такие как гликоген у животных и крахмал у растений. Кристаллические структуры глюканфосфатазы с модельными глюкановыми субстратами показывают отчетливые интерфейсы связывания глюканов, состоящие из DSP и углеводсвязывающих доменов. Однако количественные измерения взаимодействия глюкан-глюканфосфатазы с физиологически значимыми субстратами имеют основополагающее значение для биологического понимания семейства ферментов глюканфосфатазы и регуляции энергетического обмена. В этой рукописи сообщается об анализе седиментации in vitro на основе конканавалина А (ConA), предназначенном для определения аффинности связывания субстрата глюканфосфатаз с различными глюкановыми субстратами. В качестве доказательства концепции была определена константа диссоциации (KD) глюканфосфатазы Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) и амилопектина. Характеристика мутантов SEX4 и других членов семейства ферментов глюканфосфатазы еще раз демонстрирует полезность этого анализа для оценки дифференциального связывания белок-углеводных взаимодействий. Эти данные демонстрируют пригодность этого анализа для характеристики широкого спектра белков, взаимодействующих с крахмалом и гликогеном.

Одной из ключевых особенностей семейства белков глюканфосфатазы является их способность связываться с глюкановыми субстратами. Во-первых, связывающая способность SEX4 с шариками ConA-сефарозы: амилопектина была проанализирована с использованием SDS-PAGE (рис. 2A). Бычий сывор?...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Этот метод описывает анализ седиментации in vitro на основе лектина для количественной оценки сродства связывания глюканфосфатазы и амилопектина. Этот анализ совместного седиментации надежен для измерения связывания субстрата глюканфосфатазы и может применяться к различным солюбилизированным глюкановым субстратам.

Седиментационный анализ на основе конканавалина А для измерения связывания субстрата глюканфосфатаз

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Этот анализ седиментации in vitro на основе конканавалина А предназначен для измерения аффинности связывания глюканфосфатаз с различными субстратами STA. Информация, которую мы получаем с помощью этого метода, имеет основополагающее значение для нашего понимания семейства ферментов глюканфосфатазы. Углеводные белковые взаимодействия относительно слабы, поэтому современные методы не могут обнаружить взаимодействия глюканфосфатазы и глюканов.Наш анализ коседиментации на основе лектина может обнаруживать сродство связывания в миллимолярном диапазоне. Характеристика мутантов SEX4, а также других членов семейства ферментов глюканфосфатазы демонстрирует способность этого анализа количественно определять белково-углеводные взаимодействия. Одной из самых сложных частей анализа является оптимизация диапазона концентраций субстрата.Мы рекомендуем начать с более широкого диапазона, чтобы получить представление, а затем сузить его до определенного диапазона. Для начала наберите пипеткой 250 микролитров суспензии шариков ConA-сефарозы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте содержимое при 10 000 г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.После удаления надосадочной жидкости добавьте 750 микролитров связующего буфера в каждую пробирку, содержащую 250 микролитров шариков ConA-сефарозы. Центрифугируют пробирки при 10 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия и удаляют надосадочную жидкость. Затем приготовьте двукратные разведения раствора солюбилизированного амилопектина, чтобы сделать серию из двух миллилитров разбавленных растворов амилопектина.Чтобы приготовить шарики амилопектина ConA-сефарозы, добавьте 250 микролитров каждого разбавленного раствора амилопектина в пробирки, содержащие 250 микролитров шариков ConA-сефарозы, предварительно уравновешенных и связывающих буферов. Хорошо перемешайте содержимое и пометьте пробирки соответствующей концентрацией амилопектина. Инкубируйте содержимое пробирки на вращающемся колесе при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут и центрифугируйте пробирки при 10 000 г в течение одной минуты.Смешайте 250 микролитров шариков амилопектина ConA-сефарозы со 100 микролитрами связывающего буфера, содержащего 10 мкг крахмала с избытком четырех или белка SEX4, 10 миллимоляров дитиотреитола и 10 микромоляров коктейля ингибитора протеазы. Инкубируйте содержимое при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут при осторожном вращении. Затем центрифугируйте пробирки при 10 000 г в течение одной минуты и осторожно пипетируйте 50 микролитров надосадочной жидкости в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.Добавьте 20 микролитров 4-кратного красителя страницы SDS и 10 микролитров дистиллированной воды в каждую пробирку, содержащую 50 микролитров собранных надосадочных фракций, и пометьте их как S. Аналогичным образом, добавьте 20 микролитров 4-кратного красителя страницы SDS и 80 микролитров дистиллированной воды в пробирки, содержащие промытые шарики ConA-сефарозы амилопектина SEX4. После добавления красителя и воды нагрейте все образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. После того, как шарики ConA-сефарозы амилопектина SEX4 центрифугированы при 10 000 G в течение одной минуты, сохраните надосадочную жидкость и пометьте ее как P. Загрузите 40 микролитров несвязанных образцов белка, помеченных как S, в лунки из 4-12% сборного полиакриламидного геля от самой низкой концентрации субстрата до самой высокой, оставляя первую полосу для маркера молекулярной массы белка.Используйте второй гель для загрузки образцов белка, связанных с глюканом, помеченных P. Добавьте свежеприготовленный буфер SDS в обе камеры аппарата и запускайте гель при напряжении 150 вольт в течение 35 минут или до тех пор, пока передняя часть красителя не достигнет дна геля. Затем возьмите гелевую кассету из аппарата и снимите прокладки и стеклянные пластины, чтобы отделить гель для анализа вестерн-блоттинга. Сделайте один литр буфера для переноса, содержащего 5,8 грамма трис-основы, 2,9 грамма глицина, 0,37 грамма SDS и 200 миллилитров метанола.Чтобы перенести разделенные по размеру белки из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану, соберите губки, фильтровальную бумагу, гель и нитроцеллюлозную мембрану в соответствии с западным протоколом переноса и работайте при напряжении 70 вольт в течение одного часа. После запуска геля инкубируют нитроцеллюлозную мембрану в белковом растворе от 1 до 5% бычьего сывороточного альбумина или молочного белка в 50 миллилитрах буфера TBST в течение одного часа, чтобы предотвратить неспецифическое связывание белка. Промойте мембрану три раза, используя буфер TBST, чтобы удалить несвязанный блокирующий раствор.Затем инкубируйте мембрану в течение одного часа с разбавленным антителом, связанным с пероксидазой хрена, специфичным для белка, меченного гистидином. Затем трижды промойте мембрану в буфере TBST, чтобы удалить несвязанные антитела. Для цифровой визуализации сделайте раствор из равных частей хемилюминесцентных субстратных растворов, по 750 микролитров каждый в 1,5-миллилитровой пробирке, и инкубируйте мембрану в течение не менее пяти минут в растворе.Поместите мембранный белок стороной вниз на сканер блоттинга и запустите программное обеспечение для сбора данных для количественного определения белка как в гранулированной, так и в надосадочной фракциях. Чтобы получить данные, начните количественные измерения сигнала с помощью программного обеспечения для сбора данных с помощью сканера блоттинга. Нормализуйте все количественные измерения в надосадочной и гранулированной фракциях к общему белковому нагруженному.В эксперименте по насыщенному связыванию построите график зависимости процента связанного белка от концентрации амилопектина и сопоставьте данные с помощью программного обеспечения для анализа данных для расчета константы диссоциации Kd. Способность связывания SEX4 с шариками амилопектина ConA-сефарозы была проанализирована с использованием страницы SDS. Отмечено наличие белка SEX4 в гранулированной фракции и бычьего сывороточного альбумина в надосадочной фракции. W278A, известный мутант SEX4 со значительно сниженной способностью связывания глюканов, появился в надосадочной фракции, что указывает на полезность и специфичность этого анализа.Вестерн-блоттинг-анализ выявил значительное увеличение обнаружения SEX4, и метод специфичен для обнаружения глюкановых фосфатов с концевой концевой гистидиновой меткой. Анализ коседиментации был протестирован при трех различных концентрациях SEX4. В то время как двух микрограммов SEX4 достаточно для визуализации с помощью хемилюминесцентного обнаружения, использование пяти или 10 микрограммов SEX4 позволяет более точно обнаружить.Также было отмечено повышенное связывание SEX4 с повышенной концентрацией амилопектина. Было определено сродство связывания амилопектина и белка дикого типа SEX4 в разных концентрациях, а данные о процентном связывании белка с конкретной моделью связывания с одним сайтом дали Kd приблизительно 1,03 миллиграмма на миллилитр. Оценена применимость этого метода для измерения связывания лафорина, LSF2, кукурузного SEX4 и картофельного SEX4 с амилопектином картофеля.Результаты показали, что испытуемые белки из агрономически важных культур также дифференциально связаны с амилопектином. Важно помнить о нормализации всех количественных измерений в гранулированных и надосадочных фракциях к общей белковой нагрузке. Чтобы убедиться, что весь амилопектин связан с шариками, сохраните надосадочные фракции для последующего глубокого анализа глюкозы.Глюканфосфатаза использует различные механизмы для связывания, локализации и дефосфорилирования углеводов. Этот метод позволяет исследовать связывание глюканфосфатазы с различными структурными доменами в больших полимерных комплексах для позиционно-специфического дефосфорилирования.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...