Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
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Este estudio fue apoyado por el premio MCB-2012074 de la National Science Foundation. Los autores agradecen al Dr. Craig W. Vander Kooi del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Florida por sus valiosas discusiones y apoyo. Los autores también agradecen al Dr. Matthew S. Gentry del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Florida por su apoyo. Sara Lagalwar, presidenta del programa de Neurociencia de Skidmore College, por permitirnos usar el escáner de borrones de dígitos C LICOR para imágenes de Western Blot.

1. Preparación de perlas de ConA-Sepharose
<ol><li>Hacer 250 ml de un tampón de unión que contenga 67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 y 0.2 mM CaCl2. Ajustar el pH con una solución de NaOH 1 M.</li>
	<li>Pipetear 250 μL de suspensión de perlas de ConA-Sepharose en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar el contenido a 10.000 x g durante 30 s a 4 °C. Deseche el sobrenadante. NOTA: Se necesitan 250 μL de perlas de ConA-Sepharose en un tubo de microcen...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Este estudio demuestra el desarrollo exitoso de un nuevo ensayo de sedimentación in vitro que permite determinar la afinidad de unión de las interacciones glucano-glucano fosfatasa. El diseño del ensayo aprovecha la unión específica de la lectina ConA a los glucanos a través de los residuos hidroxilo de glucosa para capturar indirectamente sustratos de carbohidratos solubilizados en perlas de Sepharose. Esto permite la separación de fracciones de proteínas unidas y no unidas mediante ce...

Las fosfatasas de glucano son miembros de una subfamilia funcionalmente diversa de fosfatasas de especificidad dual (DSP) dentro de la superfamilia1 de la proteína tirosina fosfatasa (PTP). Se han encontrado en la mayoría de las formas de vida, incluyendo organismos fotosintéticos ampliamente divergentes, humanos, vertebrados y algunos invertebrados y protistas 2,3,4. Las plantas contienen tres fosfatasas de glucano conocidas: Almidón Exceso4 (SEX4), Como Sexo Cuatro1 (LSF1) y Como Sexo Cuatro2 (LSF2)5,6,7. Las plantas que carecen de glucano fosfatasas muestran tasas disminuidas de degradación transitoria del almidón y acumulación de almidón en las hojas 8,9. Laforin es el miembro fundador de la familia glucano fosfatasa que desfosforila glucógeno en vertebrados y humanos 3,10. Las mutaciones de laforina resultan en la enfermedad neurodegenerativa de Lafora, una forma autosómica recesiva fatal de epilepsia11. Las glucano fosfatasas son necesarias para el metabolismo del glucógeno y del almidón y han surgido como enzimas importantes para modular el contenido de almidón en las plantas y tratar la enfermedad neurodegenerativa de Lafora12,13. Estudios recientes de cristalografía de rayos X sobre fosfatasas de glucano con sustratos de glucano modelo han arrojado luz sobre la unión al sustrato y el mecanismo catalítico de la desfosforilación de glucanos14,15,16,17. Sin embargo, la comprensión actual de cómo las fosfatasas de glucano se unen a sus sustratos fisiológicos es incompleta.
El almidón es un polímero insoluble de glucosa hecho de 80% -90% de amilopectina y 10% -20% de amilosa18. Los sustratos para las fosfatasas de glucano vegetal son moléculas de carbohidratos fosforilados, como el glucógeno y los gránulos de almidón. Los residuos de glucosilo fosforilados están presentes en una proporción de 1:600 fosfato:residuo de glucosil. Curiosamente, los fosfatos están presentes sólo en las moléculas de amilopectina19. La principal glucano fosfatasa de la planta SEX4 actúa sobre el gránulo de almidón para desfosforilar las moléculas de amilopectina. La estructura cristalina de rayos X de SEX4 combinada con estudios de mutagénesis guiada por estructura ha demostrado las especificidades únicas del sustrato de SEX4 para diferentes posiciones dentro de una estructura de glucano15. Recientemente hemos demostrado que la actividad biológicamente relevante de SEX4 sólo puede observarse cuando actúa sobre sus sustratos de amilopectina solubilizados20. Sin embargo, comprender las interacciones glucano-SEX4 ha demostrado ser difícil debido a la complejidad estructural del sustrato, las especificidades de unión más amplias y las bajas afinidades de unión entre la proteína y sus sustratos. Estos problemas han obstaculizado la capacidad de utilizar métodos comúnmente utilizados en las interacciones proteína-ligando, como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y los ensayos basados en ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA).
Curiosamente, gran parte de nuestra comprensión de las interacciones carbohidratos-proteínas proviene del estudio de las lectinas. La concanavalina A (ConA) es una familia de proteínas lectinas de leguminosas originalmente extraídas del frijol jack. ConA se une a los carbohidratos con alta especificidad, lo que es ventajoso para su uso en aplicaciones de administración y orientación de fármacos. La unión de ConA a una variedad de sustratos que contienen α-D-manosil y α-D-glucosilo no reductores ha sido ampliamente estudiada19,20. Las perlas de sefarosa unidas a ConA disponibles comercialmente se usan comúnmente para purificar glicoproteínas y glicolípidos21. ConA se une a estos glucanos a través de los grupos hidroxilo C3, C4 y C6 de los residuos de glucosa. Las perlas de ConA-Sepharose también se han utilizado con éxito para medir la unión de las interacciones glucógeno-proteína y almidón-proteína22,23. En este estudio, utilizamos perlas de ConA-Sepharose para desarrollar un ensayo de unión para medir las especificidades de unión de las interacciones glucano fosfatasa-amilopectina.
Anteriormente, se empleó un ensayo de sedimentación basado en ConA para evaluar la capacidad de unión al sustrato de glucano fosfatasa14,20,24. En este estudio, se utilizó la misma estrategia para desarrollar un método novedoso para determinar la afinidad de unión de las interacciones glucano-glucano fosfatasa y carbohidratos. Este método también tiene una ventaja para investigar varias interacciones carbohidratos-proteínas solubilizadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Las fosfatasas de glucano pertenecen a la familia más grande de fosfatasas de especificidad dual (DSP) que desfosforilan sustratos de glucano, como el glucógeno en animales y el almidón en plantas. Las estructuras cristalinas de la glucano fosfatasa con sustratos de glucano modelo revelan distintas interfaces de unión a glucanos hechas de DSP y dominios de unión a carbohidratos. Sin embargo, las mediciones cuantitativas de las interacciones glucano-glucano fosfatasa con sustratos fisiológicamente relevantes son fundamentales para la comprensión biológica de la familia de enzimas glucano fosfatasa y la regulación del metabolismo energético. Este manuscrito informa de un ensayo de sedimentación in vitro basado en Concanavalina A (ConA) diseñado para detectar la afinidad de unión al sustrato de las fosfatasas de glucano contra diferentes sustratos de glucano. Como prueba de concepto, se determinó la constante de disociación (KD) de la glucano fosfatasa Arabidopsis thaliana Almidón Exceso4 (SEX4) y amilopectina. La caracterización de los mutantes SEX4 y otros miembros de la familia de enzimas glucano fosfatasa demuestra aún más la utilidad de este ensayo para evaluar la unión diferencial de las interacciones proteína-carbohidrato. Estos datos demuestran la idoneidad de este ensayo para caracterizar una amplia gama de proteínas que interactúan con el almidón y el glucógeno.

Una de las características clave de la familia de proteínas glucano fosfatasa es su capacidad para unirse a sustratos de glucano. En primer lugar, se analizó la capacidad de unión de SEX4 a las perlas de ConA-Sepharose:amilopectina mediante SDS-PAGE (Figura 2A). La albúmina sérica bovina (BSA) sirvió como control negativo para detectar cualquier unión inespecífica de proteínas a las perlas de ConA-Sefarosa:amilopectina. El análisis SDS-PAGE de proteínas mostró la presencia de pr...

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Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Este método describe un ensayo de sedimentación in vitro basado en lectinas para cuantificar la afinidad de unión de la glucano fosfatasa y la amilopectina. Este ensayo de cosedimentación es confiable para medir la unión del sustrato de glucano fosfatasa y se puede aplicar a varios sustratos de glucano solubilizados.

Ensayo de sedimentación basado en concanavalina A para medir la unión al sustrato de las fosfatasas de glucano

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Este ensayo de sedimentación in vitro basado en concanavalina A está diseñado para medir la afinidad de unión de las fosfatasas de glucano contra diferentes sustratos de STA. La información que obtenemos de este método es fundamental para nuestra comprensión de la familia de enzimas glucano fosfatasa. Las interacciones de proteínas de carbohidratos son relativamente débiles, por lo tanto, los métodos actuales no pueden detectar las interacciones glucano fosfatasa y glucano.Nuestro ensayo de cosedimentación basado en lectinas puede detectar la afinidad de unión en el rango milimolar. La caracterización de los mutantes SEX4, así como otros miembros de la familia de enzimas glucano fosfatasa demuestra la capacidad de este ensayo para cuantificar las interacciones de carbohidratos proteicos. Una de las partes más desafiantes del ensayo es optimizar el rango de concentración del sustrato.Recomendamos comenzar con un rango más amplio para tener una idea y luego reducir para un rango específico. Para comenzar, pipetear 250 microlitros de suspensión de perlas de ConA-sepharose en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar el contenido a 10, 000 G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados.Después de desechar el sobrenadante, agregue 750 microlitros del tampón de unión a cada tubo que contenga 250 microlitros de perlas de ConA-sefarosa. Centrifugar los tubos a 10, 000 G durante un minuto a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. A continuación, prepare diluciones dobles de la solución de amilopectina solubilizada para hacer una serie de soluciones diluidas de amilopectina de dos mililitros.Para preparar las perlas de Amilopectina ConA-sepharosa, agregue 250 microlitros de cada solución diluida de amilopectina a los tubos que contienen 250 microlitros de perlas de ConA-sepharose preequilibradas y tampón de unión. Mezclar bien el contenido y etiquetar los tubos con la concentración de amilopectina correspondiente. Incubar el contenido del tubo en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados durante 30 minutos y centrifugar los tubos a 10, 000 G durante un minuto.Mezcle 250 microlitros de perlas de Amilodectina ConA-sefarosa con 100 microlitros del tampón de unión que contiene 10 microgramos de exceso de almidón cuatro, o proteína SEX4, 10 milimolares de ditiothreitol y 10 micromolares de cóctel inhibidor de proteasa. Incubar el contenido a cuatro grados centígrados durante 45 minutos con una rotación suave. Luego centrifugar los tubos a 10, 000 G durante un minuto y cuidadosamente pipetear 50 microlitros del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.Agregue 20 microlitros de colorante de página 4X SDS y 10 microlitros de agua destilada a cada tubo que contenga 50 microlitros de las fracciones sobrenadantes recolectadas y etiquételas como S.Del mismo modo, agregue 20 microlitros de colorante de página 4X SDS y 80 microlitros de agua destilada en los tubos que contienen perlas de ConA-sepharose amilopectina SEX4 lavadas. Después de agregar el tinte y el agua, caliente todas las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez que las perlas de ConA-sepharose amilopectina SEX4 se centrifugan a 10, 000 G durante un minuto, guarde el sobrenadante y etiquételo como P.Cargue 40 microlitros de las muestras de proteínas no unidas etiquetadas como S en pocillos de gel de poliacrilamida prefabricados de 4 a 12% desde la concentración de sustrato más baja hasta la más alta, reservando el primer carril para un marcador de peso molecular de proteína.Use un segundo gel para cargar las muestras de proteína unidas a glucano etiquetadas P.Agregue un tampón de ejecución de la página SDS recién preparada a ambas cámaras del aparato y ejecute el gel a 150 voltios durante 35 minutos o hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel. Luego tome el casete de gel del aparato y retire los espaciadores y las placas de vidrio para separar el gel para el análisis de Western blot. Haga un litro de tampón de transferencia que contenga 5.8 gramos de tris base, 2.9 gramos de glicina, 0.37 gramos de SDS y 200 mililitros de metanol.Para transferir las proteínas separadas por tamaño del gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa, ensamble las esponjas, los papeles de filtro, el gel y la membrana de nitrocelulosa de acuerdo con el protocolo de transferencia occidental y funcione a 70 voltios durante una hora. Después de ejecutar el gel, incubar la membrana de nitrocelulosa en una solución de proteína de albúmina sérica bovina al 1 a 5% o proteína de leche en 50 mililitros de tampón TBST durante una hora para evitar la unión de proteínas no específicas. Lave la membrana tres veces con tampón TBST para eliminar cualquier solución bloqueante no unida.A continuación, incubar la membrana durante una hora con el anticuerpo diluido ligado a la peroxidasa de rábano picante específico para la proteína marcada con histidina. Luego lave la membrana tres veces en tampón TBST para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Para imágenes digitales, haga una solución de partes iguales de soluciones de sustrato quimioluminiscente, 750 microlitros cada uno en un tubo de 1.5 mililitros, e incube la membrana durante al menos cinco minutos en la solución.Coloque la proteína de membrana hacia abajo en el escáner de borrones y ejecute el software de adquisición para cuantificar la proteína tanto en la fracción de pellet como en la de sobrenadante. Para adquirir los datos, inicie las mediciones cuantitativas de la señal utilizando el software de adquisición con el escáner de borrones. Normalizar todas las mediciones cuantitativas en las fracciones sobrenadante y pellet a la proteína total cargada.En el experimento de unión de saturación, trace el porcentaje de concentración de proteína unida frente a la amilopectina y ajuste los datos utilizando un software de análisis de datos para calcular la constante de disociación, Kd.La capacidad de unión de SEX4 a las perlas de amilopectina ConA-sefarosa se analizó utilizando la página SDS. Se observó la presencia de proteína SEX4 en la fracción de pellets y albúmina sérica bovina en la fracción sobrenadante. W278A, un mutante SEX4 conocido con una capacidad de unión de glucano significativamente reducida, apareció en la fracción sobrenadante, lo que indica la utilidad y especificidad de este ensayo.El análisis Western blotting reveló un aumento significativo en la detección de SEX4 y el método es específico para detectar fosfatos de glucano con una etiqueta de histidina terminal terminal. El ensayo de cosedimentación se probó a tres concentraciones diferentes de SEX4. Mientras que dos microgramos de SEX4 son suficientes para visualizar a través de la detección de quimioluminiscencia, el uso de cinco o 10 microgramos de SEX4 permite una detección más precisa.Además, se observó un aumento de la unión a SEX4 con un aumento de la concentración de amilopectina. Se determinó la afinidad de unión de la amilopectina y la proteína de tipo salvaje SEX4 a diferentes concentraciones y los datos de porcentaje de proteína unida al modelo específico de unión a un sitio dieron un Kd de aproximadamente 1,03 miligramos por mililitro. Se evaluó la aplicabilidad de este método para medir la unión de laforina, LSF2, SEX4 de maíz y SEX4 de papa contra amilopectina de papa.Los resultados demostraron que las proteínas probadas de cultivos agronómicamente importantes también se unen diferencialmente a la amilopectina. Es crucial recordar la normalización de todas las mediciones cuantitativas en las fracciones de pellet y sobrenadante a la proteína total cargada. Para asegurarse de que toda la amilopectina esté unida a las perlas, guarde las fracciones sobrenadantes para realizar el ensayo de glucosa profunda más tarde.La glucano fosfatasa emplea distintos mecanismos para unir, localizar y desfosforilar carbohidratos. Este método permite la exploración de la unión de la fosfatasa de glucano a diferentes dominios estructurales dentro de grandes complejos poliméricos para la desfosforilación específica de la posición.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Investigación

Bioquímica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

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Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

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Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

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Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

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