Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Science Foundation-utmärkelsen MCB-2012074. Författarna tackar Dr. Craig W. Vander Kooi vid University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology för värdefulla diskussioner och stöd. Författarna tackar också Dr. Matthew S. Gentry vid University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology för hans stöd. Vi vill tacka Dr. Sara Lagalwar, ordförande för Skidmore College Neuroscience-programmet, för att vi fick använda LICOR C-siffrig fläckskanner för västerländsk blot-avbildning.

1. Beredning av ConA-Sepharose-pärlor
<ol><li>Gör 250 ml av en bindningsbuffert innehållande 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 och 0,2 mM CaCl2. Justera pH-värdet med 1 M NaOH-lösning.</li>
	<li>Pipettera 250 μL ConA-Sepharose pärlsuspension till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera innehållet vid 10 000 x g i 30 s vid 4 °C. Kassera supernatanten. OBS: 250 μL ConA-Sepharose-pärlor i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör behövs för varje amylopektinkoncent...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Denna studie visar den framgångsrika utvecklingen av en ny in vitro sedimenteringsanalys som möjliggör bestämning av bindningsaffiniteten för glukan-glukanfosfatasinteraktioner. Analysdesignen utnyttjar den specifika bindningen av lektin ConA till glukaner via hydroxylresterna av glukos för att indirekt fånga solubiliserade kolhydratsubstrat på Sepharose-pärlor. Detta möjliggör separation av bundna och obundna proteinfraktioner via centrifugering och bestämning av bindningsaffinitet...

Glukanfosfataser är medlemmar i en funktionellt varierad underfamilj av dubbla specificitetsfosfataser (DSP) inom proteinet tyrosinfosfatas (PTP) superfamilj1. De har hittats i de flesta livsformer, inklusive vitt skilda fotosyntetiska organismer, människor, ryggradsdjur och vissa ryggradslösa djur och protister 2,3,4. Växter innehåller tre kända glukanfosfataser: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) och Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Växter som saknar glukanfosfataser visar minskade hastigheter av övergående stärkelsenedbrytning och ackumulering av stärkelse i bladen 8,9. Laforin är grundaren av glukanfosfatasfamiljen som defosforylerar glykogen hos ryggradsdjur och människor 3,10. Mutationerna av laforin resulterar i neurodegenerativ Lafora sjukdom, en dödlig autosomal recessiv form av epilepsi11. Glukanfosfataser är nödvändiga för glykogen- och stärkelsemetabolism och har framträtt som viktiga enzymer för att modulera stärkelseinnehållet i växter och behandla neurodegenerativ Lafora sjukdom12,13. Nya röntgenkristallografistudier på glukanfosfataser med modellglukansubstrat har belyst substratbindning och den katalytiska mekanismen för glukandefosforylering14,15,16,17. Den nuvarande förståelsen för hur glukanfosfataser binder till deras fysiologiska substrat är emellertid ofullständig.
Stärkelse är en olöslig polymer av glukos tillverkad av 80% -90% amylopektin och 10% -20% amylos18. Substraten för växtglukanfosfataser är fosforylerade kolhydratmolekyler, såsom glykogen och stärkelsegranuler. De fosforylerade glukosylresterna är närvarande vid ett förhållande mellan fosfat och glukosylrester. Intressant är fosfaterna endast närvarande på amylopektinmolekylerna19. Huvudväxten glukanfosfatas SEX4 verkar på stärkelsegranulen för att defosforylera amylopektinmolekyler. Röntgenkristallstrukturen hos SEX4 i kombination med strukturstyrda mutagenesstudier har visat SEX4:s unika substratspecificiteter för olika positioner inom en glukanstruktur15. Vi visade nyligen att den biologiskt relevanta aktiviteten hos SEX4 endast kan observeras när den verkar på dess solubiliserade amylopektinsubstrat20. Att förstå glukan-SEX4-interaktioner har dock visat sig vara svårt på grund av substratets strukturella komplexitet, bredare bindningsspecificiteter och låga bindningsaffiniteter mellan proteinet och dess substrat. Dessa problem har hindrat möjligheten att använda metoder som vanligtvis används i protein-ligandinteraktioner, såsom isotermisk titreringskalorimetri (ITC), kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) -baserade analyser.
Intressant nog har mycket av vår förståelse av kolhydrat-proteininteraktioner kommit från att studera lektiner. Concanavalin A (ConA) är en baljväxtlektinfamilj av proteiner som ursprungligen extraherades från jackbönan. ConA binder kolhydrater med hög specificitet, vilket är fördelaktigt för dess användning i läkemedelsinriktning och leveransapplikationer. Bindningen av ConA till en mängd olika substrat innehållande icke-reducerande α-D-mannosyl och α-D-glukosyl har studerats utförligt19,20. Kommersiellt tillgängliga ConA-bundna sefarospärlor används ofta för att rena glykoproteiner och glykolipider21. ConA binder till dessa glukaner via C3-, C4- och C6-hydroxylgrupper av glukosresterna. ConA-Sepharose-pärlor har också framgångsrikt använts för att mäta bindningen av glykogen-protein och stärkelse-proteininteraktioner22,23. I denna studie använde vi ConA-Sepharose-pärlor för att utveckla en bindningsanalys för att mäta bindningsspecificiteterna för glukanfosfatas-amylopektininteraktioner.
Tidigare användes en ConA-baserad sedimentationsanalys för att bedöma glukanfosfatassubstratbindningsförmåga14,20,24. I denna studie användes samma strategi för att utveckla en ny metod för att bestämma bindningsaffiniteten hos glukan-glukanfosfatas och kolhydratinteraktioner. Denna metod har också en fördel för att undersöka olika solubiliserade kolhydrat-proteininteraktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Glukanfosfataser tillhör den större familjen av dubbla specificitetsfosfataser (DSP) som defosforylerar glukansubstrat, såsom glykogen hos djur och stärkelse i växter. Kristallstrukturerna av glukanfosfatas med modellglukansubstrat avslöjar distinkta glukanbindande gränssnitt gjorda av DSP och kolhydratbindande domäner. Kvantitativa mätningar av glukan-glukanfosfatasinteraktioner med fysiologiskt relevanta substrat är dock grundläggande för den biologiska förståelsen av glukanfosfatasfamiljen av enzymer och regleringen av energimetabolism. Detta manuskript rapporterar en Concanavalin A (ConA)-baserad in vitro-sedimenteringsanalys utformad för att detektera substratbindningsaffiniteten hos glukanfosfataser mot olika glukansubstrat. Som ett bevis på konceptet bestämdes dissociationskonstanten (KD) av glukanfosfatas Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) och amylopektin. Karakteriseringen av SEX4-mutanter och andra medlemmar av glukanfosfatasfamiljen av enzymer visar ytterligare användbarheten av denna analys för att bedöma differentialbindningen av protein-kolhydratinteraktioner. Dessa data visar lämpligheten av denna analys för att karakterisera ett brett spektrum av stärkelse- och glykogeninteragerande proteiner.

En av de viktigaste egenskaperna hos glukanfosfatasfamiljen av proteiner är deras förmåga att binda till glukansubstrat. Först analyserades bindningskapaciteten hos SEX4 till ConA-Sepharose: amylopektinpärlor med SDS-PAGE (figur 2A). Bovint serumalbumin (BSA) fungerade som en negativ kontroll för att detektera eventuell ospecifik bindning av proteiner till ConA-Sepharose: amylopektinpärlorna. SDS-PAGE-analysen av proteiner visade närvaron av SEX4-protein i pelletsfraktionen och BSA i...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Denna metod beskriver en lektinbaserad sedimentationsanalys in vitro för att kvantifiera bindningsaffiniteten för glukanfosfatas och amylopektin. Denna samsedimenteringsanalys är tillförlitlig för mätning av glukanfosfatassubstratbindning och kan appliceras på olika lösliga glukansubstrat.

Concanavalin A-baserad sedimentationsanalys för att mäta substratbindning av glukanfosfataser

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Denna concanavalin A-baserade in vitro sedimentationsanalys är utformad för att mäta bindningsaffinitet av glukanfosfataser mot olika STA-substrat. Informationen vi får från denna metod är grundläggande för vår förståelse av glukanfosfatasfamilj av enzymer. Kolhydratproteininteraktioner är relativt svaga, därför kan nuvarande metoder inte detektera glukanfosfatas och glukaninteraktioner.Vår lektinbaserade kosedimenteringsanalys kan detektera bindningsaffinitet i det millimolära området. Karakteriseringen av SEX4-mutanter såväl som andra medlemmar av glukanfosfatasfamiljen av enzymer visar förmågan hos denna analys att kvantifiera proteinkolhydratinteraktioner. En av de mest utmanande delarna av analysen är att optimera substratets koncentrationsområde.Vi rekommenderar att du börjar med ett bredare intervall för att få en uppfattning och sedan begränsar för ett specifikt intervall. För att börja, pipettera 250 mikroliter ConA-sefarospärlor suspension i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Centrifugera innehållet vid 10 000 G i 30 sekunder vid fyra grader Celsius.Efter kassering av supernatanten, tillsätt 750 mikroliter av bindningsbufferten till varje rör innehållande 250 mikroliter ConA-sefafarospärlor. Centrifugera rören vid 10 000 G i en minut vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten. Därefter förbereda tvåfaldiga utspädningar av den solubiliserade amylopektinlösningen för att göra en serie av två milliliter utspädda amylopektinlösningar.För att förbereda ConA-sefarose-amylopektinpärlorna, tillsätt 250 mikroliter av varje utspädd amylopektinlösning till rören innehållande 250 mikroliter ConA-sefarosepärlor preequilibrerade och bindande buffert. Blanda innehållet väl och märk rören med motsvarande amylopektinkoncentration. Inkubera rörinnehållet på ett roterande hjul vid fyra grader Celsius i 30 minuter och centrifugera rören vid 10 000 G i en minut.Blanda 250 mikroliter ConA-sefarose-amylopektinpärlor med 100 mikroliter av bindningsbufferten innehållande 10 mikrogram stärkelseöverskott fyra, eller SEX4-protein, 10 millimolar ditiotreitol och 10 mikromolar proteasinhibitorcocktail. Inkubera innehållet vid fyra grader Celsius i 45 minuter med försiktig rotation. Centrifugera sedan rören vid 10 000 G i en minut och pipettera försiktigt 50 mikroliter av supernatanten i ett nytt 1, 5 ml mikrocentrifugrör.Tillsätt 20 mikroliter 4X SDS-sidfärgämne och 10 mikroliter destillerat vatten till varje rör som innehåller 50 mikroliter av de uppsamlade supernatantfraktionerna och märk dem som S.På samma sätt tillsätt 20 mikroliter 4X SDS-sidfärg och 80 mikroliter destillerat vatten i rören som innehåller tvättade ConA-sefarose-amylopektin SEX4-pärlor. Efter tillsats av färgämne och vatten, värm alla prover vid 95 grader Celsius i 10 minuter. När ConA-sefarose-amylopektin SEX4-pärlorna centrifugeras vid 10 000 G i en minut, spara supernatanten och märk den som P.Ladda 40 mikroliter av de obundna proteinproverna märkta som S i 4 till 12% prefabricerade polyakrylamidgelbrunnar från den lägsta substratkoncentrationen till den högsta, reservera den första banan för en proteinmolekylviktmarkör.Använd en andra gel för att ladda de glukanbundna proteinproverna märkta P.Tillsätt nyberedd SDS-sida som kör buffert till båda kamrarna i apparaten och kör gelén vid 150 volt i 35 minuter eller tills färgämnesfronten når botten av gelén. Ta sedan gelkassetten från apparaten och ta bort distanserna och glasplattorna för att separera gelén för western blot-analys. Gör en liter överföringsbuffert innehållande 5,8 gram trisbas, 2,9 gram glycin, 0,37 gram SDS och 200 ml metanol.För att överföra de storleksseparerade proteinerna från polyakrylamidgelen till ett nitrocellulosamembran, montera svamparna, filterpapper, gel och nitrocellulosamembran enligt västerländskt överföringsprotokoll och kör vid 70 volt i en timme. Efter att ha kört gelén, inkubera nitrocellulosamembranet i en proteinlösning av 1 till 5% bovint serumalbumin eller mjölkprotein i 50 ml TBST-buffert i en timme för att förhindra icke-specifik proteinbindning. Tvätta membranet tre gånger med TBST-buffert för att avlägsna eventuell obunden blockeringslösning.Inkubera sedan membranet i en timme med den utspädda pepparrotperoxidasbundna antikroppen som är specifik för histidinmärkt protein. Tvätta sedan membranet tre gånger i TBST-buffert för att avlägsna eventuella obundna antikroppar. För digital avbildning, gör en lösning av lika delar kemiluminescerande substratlösningar, 750 mikroliter vardera i ett 1,5 ml rör och inkubera membranet i minst fem minuter i lösningen.Placera membranproteinsidan nedåt på blottningsskannern och kör insamlingsprogramvaran för att kvantifiera proteinet i både pellets- och supernatantfraktionerna. För att hämta data, starta de kvantitativa signalmätningarna med hjälp av insamlingsprogramvaran med blot-skannern. Normalisera alla kvantitativa mätningar i supernatant- och pelletsfraktionerna till det totala proteinet som laddas.I det mättande bindningsexperimentet plottar du procentandelen proteinbunden kontra amylopektinkoncentration och anpassar data med hjälp av dataanalysprogramvara för att beräkna dissociationskonstanten, Kd.Bindningskapaciteten för SEX4 till ConA-sefarose-amylopektinpärlor analyserades med SDS-sida. Närvaron av SEX4-protein i pelletfraktionen och bovint serumalbumin i supernatantfraktionen noterades. W278A, en känd SEX4-mutant med signifikant reducerad glukanbindningsförmåga, uppträdde i supernatantfraktionen, vilket indikerar användbarheten och specificiteten hos denna analys.Western blotting-analys avslöjade en signifikant ökning av detektionen av SEX4 och metoden är specifik för detektion av glukanfosfater med en ändterminal histidintagg. Cosedimentationsanalysen testades vid tre olika SEX4-koncentrationer. Medan två mikrogram SEX4 är tillräckligt för att visualisera genom kemiluminiscensdetektering, möjliggör användning av fem eller 10 mikrogram SEX4 mer exakt detektering.Dessutom noterades ökad SEX4-bindning med ökad amylopektinkoncentration. Bindningsaffiniteten för amylopektin och SEX4-vildtypsprotein vid olika koncentrationer bestämdes och procentandelen proteinbundna data till den specifika bindningsmodellen på en plats gav en Kd på cirka 1,03 milligram per milliliter. Tillämpligheten av denna metod för att mäta bindningen av laforin, LSF2, majs SEX4 och potatis SEX4 mot potatisamylopektin utvärderades.Resultaten visade att de testade proteinerna från agronomiskt viktiga grödor också är differentiellt bundna till amylopektin. Det är viktigt att komma ihåg normaliseringen av alla kvantitativa mätningar i pellets- och supernatantfraktionerna till det totala proteinet som laddas. För att säkerställa att allt amylopektin är bundet till pärlorna, spara supernatantfraktionerna för att utföra den djupa glukosanalysen senare.Glukanfosfatas används distinkta mekanismer för att binda, lokalisera, och defosforylat kolhydrater. Denna metod möjliggör utforskning av glukanfosfatas bindning till olika strukturella domäner inom stora polymerkomplex för positionsspecifik defosforylering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Mätning av proteinbindning till F-aktin genom sam-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativa immunofluorescens åtgärd globala lokaliserad Översättning

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analys för fosforylering och mikrotubuli bindande tillsammans med lokalisering av Tau-Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Nonradioactive Analys för att mäta Polynukleotid Fosforylering av små Nukleotid Substrat

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...