Name: concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı ödülü MCB-2012074 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Florida Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü'nden Dr. Craig W. Vander Kooi'ye değerli tartışmalar ve destekler için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Florida Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü'nden Dr. Matthew S. Gentry'ye desteği için teşekkür eder. Skidmore College Neuroscience programının başkanı Dr. Sara Lagalwar'a, batı leke görüntülemesi için LICOR C basamaklı leke tarayıcısını kullanmamıza izin verdiği için teşekkür ederiz.

1. ConA-Sefaroz boncuklarının hazırlanması
<ol><li>67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 ve0,2 mM CaCl2 içeren 250 mL'lik bir bağlayıcı tampon yapın. 1 M NaOH çözeltisi kullanarak pH'ı ayarlayın.</li>
	<li>Pipet, 250 μL ConA-Sefaroz boncuk süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. İçeriği 10.000 x g'de 4 °C'de 30 sn santrifüj edin. Supernatan'ı atın. NOT: Tahlil için kullanılan her amilopektin konsantrasyonu için 1,5 mL...

<ol>
	<li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism.">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li><li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease.">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li><li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin,+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates.">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li><li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism.">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).</li><li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals.">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana.">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li><li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+phosphatase,+LSF1,+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves.">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li><li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme.">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li><li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan,+water+dikinase.">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li><li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laforin+is+a+glycogen+phosphatase,+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo.">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li><li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism.">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li><li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion.">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li><li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications.">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li><li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease.">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity.">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li><li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4.">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation.">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li><li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch:+A+flexible,+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth.">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li><li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+in+rice+and+other+starches.">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li><li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4.">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+53,000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum.">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li><li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53,000+dalton+glycoprotein.">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li><li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction.">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li><li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates.">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li><li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+&#945;-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose.">Plant &#945;-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li><li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy.">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li><li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li></ol>

Bu çalışma, glukan-glukan fosfataz etkileşimlerinin bağlanma afinitesinin belirlenmesine izin veren yeni bir in vitro sedimantasyon testinin başarılı bir şekilde geliştirildiğini göstermektedir. Tahlil tasarımı, lektin ConA'nın glikozun hidroksil kalıntıları yoluyla glukanlara spesifik olarak bağlanmasından yararlanarak, çözünür karbonhidrat substratlarını Sefaroz boncuklarına dolaylı olarak yakalar. Bu, bağlı ve bağlanmamış protein fraksiyonlarının santrifüjleme ...

Glukan fosfatazlar, protein tirozin fosfataz (PTP) üst ailesi1 içindeki çift özgüllüklü fosfatazların (DSP'ler) fonksiyonel olarak farklı bir alt ailesinin üyeleridir. Geniş ölçüde farklı fotosentetik organizmalar, insanlar, omurgalılar ve bazı omurgasızlar ve protistler de dahil olmak üzere çoğu yaşam formunda bulunmuştur 2,3,4. Bitkiler bilinen üç glukan fosfataz içerir: Nişasta Fazlalığı4 (SEX4), Seks Dörtlüsü 1 (LSF1) ve Seks Dörtlüsü (LSF2) Gibi5,6,7. Glukan fosfatazları olmayan bitkiler, geçici nişasta bozunma ve yapraklarda nişasta birikimi oranlarının azaldığını göstermektedir 8,9. Laforin, omurgalılarda ve insanlarda glikojen defosforilleri defosforile eden glukan fosfataz ailesinin kurucu üyesidir 3,10. Laforinin mutasyonları, epilepsinin ölümcül otozomal resesif bir formu olan nörodejeneratif Lafora hastalığı ile sonuçlanır11. Glukan fosfatazlar glikojen ve nişasta metabolizması için gereklidir ve bitkilerde nişasta içeriğini modüle etmek ve nörodejeneratif Lafora hastalığının tedavisinde önemli enzimler olarak ortaya çıkmıştır12,13. Model glukan substratlı glukan fosfatazlar üzerine yapılan son X-ışını kristalografi çalışmaları, substrat bağlanmasına ve glukan defosforilasyonunun katalitik mekanizmasına ışık tutmuştur14,15,16,17. Bununla birlikte, glukan fosfatazların fizyolojik substratlarına nasıl bağlandığına dair mevcut anlayış eksiktir.
Nişasta,% 80-90 amilopektin ve% 10-20 amilozdan yapılmış çözünmez bir glikoz polimeridir18. Bitki glukan fosfatazları için substratlar, glikojen ve nişasta granülleri gibi fosforile karbonhidrat molekülleridir. Fosforile glukozil kalıntıları 1:600 fosfat:glukozil kalıntı oranında bulunur. İlginç bir şekilde, fosfatlar sadece amilopektin molekülleri19'da bulunur. Ana bitki glukan fosfataz SEX4, amilopektin moleküllerini defosforile etmek için nişasta granülü üzerinde hareket eder. SEX4'ün X-ışını kristal yapısı, yapı kılavuzlu mutajenez çalışmaları ile birleştiğinde, bir glukan yapısı15 içindeki farklı pozisyonlar için SEX4'ün benzersiz substrat özelliklerini göstermiştir. Son zamanlarda, SEX4'ün biyolojik olarak ilgili aktivitesinin sadece çözünür amilopektin substratları20 üzerinde hareket ederken gözlemlenebileceğini gösterdik. Bununla birlikte, glukan-SEX4 etkileşimlerini anlamanın, substratın yapısal karmaşıklığı, daha geniş bağlanma özgüllükleri ve protein ile substratları arasındaki düşük bağlanma afiniteleri nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu sorunlar, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tabanlı testler gibi protein-ligand etkileşimlerinde yaygın olarak kullanılan yöntemleri kullanma yeteneğini engellemiştir.
İlginçtir ki, karbonhidrat-protein etkileşimleri hakkındaki anlayışımızın çoğu, lektinleri incelemekten gelmiştir. Concanavalin A (ConA), orijinal olarak jack fasulyesinden ekstrakte edilen bir baklagil lektin protein ailesidir. ConA, karbonhidratları yüksek özgüllükle bağlar, bu da ilaç hedefleme ve dağıtım uygulamalarında kullanımı için avantajlıdır. ConA'nın indirgeyici olmayan α-D-mannosil ve α-D-glukozil içeren çeşitli substratlara bağlanması kapsamlı bir şekilde incelenmiştir19,20. Ticari olarak temin edilebilen ConA'ya bağlı Sefaroz boncukları, glikoproteinleri ve glikolipidleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılır21. ConA, glikoz kalıntılarının C3, C4 ve C6 hidroksil grupları aracılığıyla bu glukanlara bağlanır. ConA-Sefaroz boncukları ayrıca glikojen-protein ve nişasta-protein etkileşimlerinin bağlanmasını ölçmek için başarıyla kullanılmıştır22,23. Bu çalışmada, glukan fosfataz-amilopektin etkileşimlerinin bağlanma özelliklerini ölçmek için bağlayıcı bir tahlil geliştirmek için ConA-Sefaroz boncuklarını kullandık.
Daha önce, glukan fosfataz substrat bağlanma kabiliyetini 14,20,24 değerlendirmek için ConA bazlı bir sedimantasyon testi kullanılmıştır. Bu çalışmada, aynı strateji, glukan-glukan fosfataz ve karbonhidrat etkileşimlerinin bağlanma afinitesini belirlemek için yeni bir yöntem geliştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli çözünür karbonhidrat-protein etkileşimlerini araştırmak için bir avantaja sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP</td>
			<td>Therm Fisher Scientific</td>
			<td>MA1-21315-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad gel electrophoresis and Western blot kit</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Digit blot scanner</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-00</td>
			<td>Blot scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A-sepharose beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9017</td>
			<td>This product contains&#160; in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5425R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0 software</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 8.0</td>
			<td>Data analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>3600-501</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato amylopectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDSPAGE Gels</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M00653S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westernsure premium chemiluminescence substrate&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>&#160;926-95000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concanavalin a-based sedimentation assay to measure substrate binding of glucan phosphatases

Glukan fosfatazlar, hayvanlarda glikojen ve bitkilerde nişasta gibi glukan substratlarını defosforile eden daha büyük çift özgüllük fosfataz (DSP) ailesine aittir. Glukan fosfatazın model glukan substratları ile kristal yapıları, DSP ve karbonhidrat bağlama alanlarından yapılmış farklı glukan bağlayıcı arayüzler ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, fizyolojik olarak ilgili substratlarla glukan-glukan fosfataz etkileşimlerinin kantitatif ölçümleri, glukan fosfataz enzim ailesinin biyolojik olarak anlaşılması ve enerji metabolizmasının düzenlenmesi için temeldir. Bu makalede, glukan fosfatazların farklı glukan substratlarına karşı substrat bağlanma afinitesini tespit etmek için tasarlanmış bir Concanavalin A (ConA) bazlı in vitro sedimantasyon testi bildirilmiştir. Kavramın bir kanıtı olarak, glukan fosfataz Arabidopsis thaliana Nişasta Fazlalığı4 (SEX4) ve amilopektinin ayrışma sabiti (KD) belirlendi. SEX4 mutantlarının ve glukan fosfataz enzim ailesinin diğer üyelerinin karakterizasyonu, protein-karbonhidrat etkileşimlerinin diferansiyel bağlanmasını değerlendirmek için bu tahlilin yararlılığını göstermektedir. Bu veriler, bu tahlilin çok çeşitli nişasta ve glikojen etkileşen proteinleri karakterize etmeye uygunluğunu göstermektedir.

Glukan fosfataz protein ailesinin temel özelliklerinden biri, glukan substratlarına bağlanma yetenekleridir. İlk olarak, SEX4'ün ConA-Sepharose:amilopectin boncuklarına bağlanma kapasitesi SDS-PAGE kullanılarak analiz edildi (Şekil 2A). Sığır serum albümini (BSA), proteinlerin ConA-Sefaroz: amilopektin boncuklarına spesifik olmayan herhangi bir bağlanmasını tespit etmek için negatif bir kontrol görevi gördü. Proteinlerin SDS-PAGE analizi, pelet fraksiyonunda SEX4 protein...

Watch this Scientific Journal Video about Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases at JoVE.com

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Bu konkanavalin A bazlı in vitro sedimantasyon testi, glukan fosfatazların farklı STA substratlarına karşı bağlanma afinitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Bu yöntemden elde ettiğimiz bilgiler, glukan fosfataz enzim ailesini anlamamız için temeldir. Karbonhidrat protein etkileşimleri nispeten zayıftır, bu nedenle mevcut yöntemler glukan fosfataz ve glukan etkileşimlerini tespit edememektedir.Lektin bazlı kosedimantasyon testimiz, milimolar aralıktaki bağlanma afinitesini tespit edebilir. SEX4 mutantlarının ve glukan fosfataz enzim ailesinin diğer üyelerinin karakterizasyonu, bu tahlilin protein karbonhidrat etkileşimlerini ölçme yeteneğini göstermektedir. Tahlilin en zorlu kısımlarından biri, substratın konsantrasyon aralığını optimize etmektir.Bir fikir edinmek için daha geniş bir aralıkla başlamanızı ve ardından belirli bir aralık için daraltmanızı öneririz. Başlamak için, pipet 250 mikrolitre ConA-sefaroz boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne sıkıştırır. İçeriği 10.000 G'de dört santigrat derecede 30 saniye boyunca santrifüj edin.Süpernatanı attıktan sonra, 250 mikrolitre ConA-sefaroz boncuk içeren her tüpe 750 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin. Tüpleri 10.000 G'de dört santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, iki mililitre seyreltilmiş amilopektin çözeltisi serisi yapmak için çözünür amilopektin çözeltisinin iki kat seyreltilmesini hazırlayın.ConA-sefaroz amilopektin boncuklarını hazırlamak için, 250 mikrolitre ConA-sefaroz boncuk öndengelenmiş ve bağlayıcı tampon içeren tüplere her seyreltilmiş amilopektin çözeltisinden 250 mikrolitre ekleyin. İçeriği iyice karıştırın ve tüpleri karşılık gelen amilopektin konsantrasyonu ile etiketleyin. Tüp içeriğini 30 dakika boyunca dört santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin ve tüpleri bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edin.250 mikrolitre ConA-sefaroz amilopektin boncuğunu, 10 mikrogram nişasta fazla dört veya SEX4 proteini, 10 milimolar ditiyotreitol ve 10 mikromolar proteaz inhibitörü kokteyli içeren 100 mikrolitre bağlayıcı tamponla karıştırın. İçeriği yumuşak bir rotasyonla 45 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra tüpleri bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edin ve süpernatantın 50 mikrolitresini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin.Toplanan süpernatant fraksiyonların 50 mikrolitresini içeren her tüpe 20 mikrolitre 4X SDS sayfa boyası ve 10 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve bunları S olarak etiketleyin.Benzer şekilde, yıkanmış ConA-sefaroz amilopektin SEX4 boncukları içeren tüplere 20 mikrolitre 4X SDS sayfa boyası ve 80 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Boya ve su ekledikten sonra, tüm numuneleri 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. ConA-sefaroz amilopektin SEX4 boncukları bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edildikten sonra, süpernatantı kaydedin ve S olarak etiketlenmiş bağlanmamış protein numunelerinin 40 mikrolitresini, en düşük substrat konsantrasyonundan en yükseğe kadar% 4 ila% 12 prekast poliakrilamid jel kuyucuğuna P.Load olarak etiketleyin ve bir protein moleküler ağırlık belirteci için ilk şeridi ayırın.P.Add etiketli glukan bağlı protein numunelerini yüklemek için ikinci bir jel kullanın Cihazın her iki odasına taze hazırlanmış SDS sayfası çalışma tamponu ekleyin ve jeli 35 dakika boyunca veya boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar 150 voltta çalıştırın. Daha sonra jel kasetini cihazdan alın ve batı leke analizi için jeli ayırmak için ara parçaları ve cam plakaları çıkarın. 5.8 gram tris baz, 2.9 gram glisin, 0.37 gram SDS ve 200 mililitre metanol içeren bir litre transfer tamponu yapın.Boyuttan ayrılmış proteinleri poliakrilamid jelden bir nitroselüloz membranına aktarmak için, süngerleri, filtre kağıtlarını, jeli ve nitroselüloz membranını Batı transfer protokolüne göre birleştirin ve bir saat boyunca 70 voltta çalıştırın. Jeli çalıştırdıktan sonra, spesifik olmayan protein bağlanmasını önlemek için nitroselüloz zarını% 1 ila% 5 sığır serum albümini veya süt proteini protein çözeltisi içinde 50 mililitre TBST tamponunda bir saat boyunca inkübe edin. Herhangi bir bağlanmamış blokaj çözeltisini çıkarmak için TBST tamponunu kullanarak membranı üç kez yıkayın.Daha sonra, histidin etiketli proteine özgü seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz bağlı antikor ile zarı bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için zarı TBST tamponunda üç kez yıkayın. Dijital görüntüleme için, her biri 1.5 mililitrelik bir tüpte 750 mikrolitre olan kemilüminesan substrat çözeltilerinin eşit parçalarından oluşan bir çözelti yapın ve membranı çözelti içinde en az beş dakika boyunca inkübe edin.Membran proteinini leke tarayıcısına yan yana yerleştirin ve hem pelet hem de süpernatant fraksiyonlarındaki proteini ölçmek için edinme yazılımını çalıştırın. Verileri elde etmek için, leke tarayıcı ile edinme yazılımını kullanarak nicel sinyal ölçümlerini başlatın. Süpernatant ve pelet fraksiyonlarındaki tüm kantitatif ölçümleri yüklenen toplam proteine normalleştirin.Doygunlaştırıcı bağlanma deneyinde, amilopektin konsantrasyonuna karşı bağlı protein yüzdesini çizin ve ayrışma sabitini hesaplamak için veri analiz yazılımı kullanarak verileri sığdırın, Kd.SEX4'ün ConA-sefaroz amilopektin boncuklarına bağlanma kapasitesi SDS sayfası kullanılarak analiz edildi. Pelet fraksiyonunda SEX4 proteini ve süpernatant fraksiyonda sığır serum albümininin varlığı kaydedildi. Önemli ölçüde azaltılmış glukan bağlanma kabiliyetine sahip bilinen bir SEX4 mutantı olan W278A, süpernatant fraksiyonunda ortaya çıktı ve bu tahlilin yararlılığını ve özgüllüğünü gösterdi.Batı lekeleme analizi, SEX4'ün tespitinde önemli bir artış olduğunu ortaya koymuştur ve yöntem, bir uç terminal histidin etiketi ile glukan fosfatları tespit etmek için spesifiktir. Kosedimantasyon testi üç farklı SEX4 konsantrasyonunda test edildi. Kemilüminesans tespiti yoluyla görselleştirmek için iki mikrogram SEX4 yeterli olsa da, beş veya 10 mikrogram SEX4 kullanmak daha doğru algılamaya izin verir.Ayrıca, artmış amilopektin konsantrasyonu ile artmış SEX4 bağlanması kaydedildi. Amilopektin ve SEX4 vahşi tip proteinin farklı konsantrasyonlarda bağlanma afinitesi belirlendi ve spesifik bir bölge bağlama modeline bağlı protein yüzdesi verileri, mililitre başına yaklaşık 1.03 miligramlık bir Kd verdi. Laforin, LSF2, mısır SEX4 ve patates SEX4'ün patates amilopektinine karşı bağlanmasını ölçmek için bu yöntemin uygulanabilirliği değerlendirildi.Sonuçlar, tarımsal açıdan önemli mahsullerden elde edilen test edilen proteinlerin de amilopektin'e farklı şekilde bağlandığını göstermiştir. Pelet ve süpernatant fraksiyonlarındaki tüm kantitatif ölçümlerin yüklenen toplam proteine normalleşmesini hatırlamak çok önemlidir. Tüm amilopektinin boncuklara bağlandığından emin olmak için, daha sonra derin glikoz tahlilini gerçekleştirmek için süpernatant fraksiyonları kaydedin.Glukan fosfataz, karbonhidratları bağlamak, bulmak ve fosforilatmak için farklı mekanizmalar kullanır. Bu yöntem, glukan fosfatazın pozisyona özgü defosforilasyon için büyük polimerik kompleksler içindeki farklı yapısal alanlara bağlanmasının araştırılmasına izin verir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...