Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Vi takker Dr. Miguel Sena-Esteves ved University of Massachusetts Chan Medical School for at give AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP-virus og Debra Cameron ved University of Massachusetts Chan Medical School for at tegne musens kranieskits. Vi takker også nuværende og tidligere medlemmer af Bosco-, Schafer- og Henninger-laboratorierne for deres forslag og støtte. Dette arbejde blev finansieret af forsvarsministeriet (W81XWH202071/PRARP) til DAB, DS og NH.

Alle dyrerelaterede protokoller blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr udgivet af National Research Council (US) Committee. Protokollerne blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (tilladelsesnummer 202100057). Kort sagt, som vist i undersøgelsesskemaet (figur 1), modtager dyret en virusinjektion, en TBI, en vinduesimplantation og derefter intravital billeddannelse i en t...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

I denne undersøgelse blev AAV-injektion, TBI-administration og en hovedpost med kranial vinduesimplantation kombineret til langsgående billeddannelsesanalyse af EGFP-mærkede neuroner i musehjernebarken (lag IV og V) for at observere virkningerne af TBI på kortikale neuroner. Denne undersøgelse bemærker, at TBI-stedet valgt her, over hippocampus, giver en relativt flad og bred overflade til implantation af kranievinduet. Omvendt er kraniet relativt smalt foran dette sted, og derfor er det svært at sikre, at hovedst...

Traumatisk hjerneskade (TBI), som kan skyldes sportsskader, køretøjskollisioner og militær kamp, er et verdensomspændende sundhedsproblem. TBI kan føre til fysiologiske, kognitive og adfærdsmæssige underskud og livslang handicap eller dødelighed 1,2. TBI-sværhedsgraden kan klassificeres som mild, moderat og svær, langt størstedelen er mild TBI (75% -90%)3. Det anerkendes i stigende grad, at TBI, især gentagne forekomster af TBI, kan fremme neuronal degeneration og tjene som risikofaktorer for flere neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og kronisk traumatisk encefalopati (CTE) 4,5,6. Imidlertid forbliver de molekylære mekanismer, der ligger til grund for TBI-induceret neurodegeneration, uklare og repræsenterer således et aktivt studieområde. For at få indsigt i, hvordan neuroner reagerer på og kommer sig efter TBI, er en metode til overvågning af fluorescerende mærkede proteiner af interesse, specifikt inden for neuroner, ved langsgående intravital billeddannelse hos mus efter TBI beskrevet heri.
Til dette formål viser denne undersøgelse, hvordan man kombinerer en kirurgisk procedure til administration af TBI med lukket kranium, der ligner det, der tidligere er rapporteret7,8, sammen med en kirurgisk procedure til implantation af et kranievindue til nedstrøms intravital billeddannelse, som beskrevet af Goldey et al9. Især er det ikke muligt at implantere et kranievindue først og derefter udføre en TBI i samme region, da virkningen af vægtfaldet, der inducerer TBI, sandsynligvis vil beskadige vinduet og forårsage uoprettelig skade på musen. Derfor blev denne protokol designet til at administrere TBI og derefter implantere kranievinduet direkte over slagstedet, alt sammen inden for samme kirurgiske session. En fordel ved at kombinere både TBI og kranial vinduesimplantation i en enkelt kirurgisk session er en reduktion i antallet af gange, en mus udsættes for kirurgi. Desuden giver det mulighed for at overvåge den øjeblikkelige reaktion (dvs. på timeskalaen) på TBI, i modsætning til at implantere vinduet ved en senere kirurgisk session (dvs. indledende billeddannelse, der starter på en tidsskala på dage efter TBI). Kranievinduet og den intravitale billeddannelsesplatform giver også fordele i forhold til overvågning af neuronale proteiner ved konventionelle metoder såsom immunfarvning af fast væv. For eksempel kræves færre mus til intravital billeddannelse, da den samme mus kan studeres på flere tidspunkter, i modsætning til separate kohorter af mus, der er nødvendige for diskrete tidspunkter. Endvidere kan de samme neuroner overvåges over tid, så man kan spore specifikke biologiske eller patologiske hændelser i samme celle.
Som et bevis på konceptet demonstreres det neuronspecifikke udtryk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under synapsinpromotoren her10. Denne tilgang kan udvides til 1) forskellige hjernecelletyper ved at anvende andre celletypespecifikke promotorer, såsom myelinbasisk protein (MBP) promotor til oligodendrocytter og glialfibrillært surt protein (GFAP) promotor til astrocytter11, 2) forskellige målproteiner af interesse ved at fusionere deres gener med EGFP-genet og 3) co-ekspression af flere proteiner fusioneret til forskellige fluoroforer. Her pakkes EGFP og udtrykkes via adeno-associeret virus (AAV) levering gennem en intrakraniel injektion. En TBI med lukket kranium administreres ved hjælp af en vægtfaldsanordning efterfulgt af implantation af et kranievindue. Visualisering af neuronal EGFP opnås gennem kranievinduet ved hjælp af to-fotonmikroskopi til påvisning af EGFP-fluorescens in vivo. Med to-fotonlaseren er det muligt at trænge dybere ind i det kortikale væv med minimal fotoskade, hvilket muliggør gentagen langsgående billeddannelse af de samme kortikale regioner inden for en individuel mus i dage og op til måneder12,13,14,15. Alt i alt har denne tilgang til at kombinere en TBI-operation med intravital billeddannelse til formål at fremme forståelsen af de molekylære begivenheder, der bidrager til TBI-induceret sygdomspatologi16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan man i længderetningen visualiserer ekspression og lokalisering af et protein af interesse inden for specifikke celletyper i et dyrs hjerne ved udsættelse for eksogene stimuli. Her vises administrationen af en lukket kranietraumatisk hjerneskade (TBI) og samtidig implantation af et kranievindue til efterfølgende langsgående intravital billeddannelse hos mus. Mus injiceres intrakranielt med en adenoassocieret virus (AAV), der udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en neuronal specifik promotor. Efter 2 til 4 uger udsættes musene for en gentagen TBI ved hjælp af en vægttabsenhed over AAV-injektionsstedet. Inden for samme kirurgiske session implanteres musene med en metalhovedstolpe og derefter et kranievindue af glas over TBI-påvirkningsstedet. Ekspression og cellulær lokalisering af EGFP undersøges ved hjælp af et to-fotonmikroskop i samme hjerneområde udsat for traumer i løbet af måneder.

Som bevis på konceptet for denne protokol blev virale partikler, der udtrykte AAV-Syn1-EGFP, injiceret i hjernebarken hos mandlige TDP-43 Q331K /Q331K mus (C57BL / 6J baggrund)19 i en alder af 3 måneder. Det bemærkes, at vildtype C57BL/6J dyr også kan anvendes, men denne undersøgelse blev udført i TDP-43 Q331K/Q331K mus, fordi laboratoriet er fokuseret på neurodegenerativ sygdomsforskning. En TBI-operation blev udført 4 uger efter AAV-injektion. Inden for samme kirurg...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Denne undersøgelse viser levering af en gentagen traumatisk hjerneskade på mus og samtidig implantation af et kranievindue til efterfølgende intravital billeddannelse af en neuron-udtrykt EGFP ved hjælp af to-fotonmikroskopi.

Intravital billeddannelse af fluorescerende proteinekspression hos mus med en lukket kranium traumatisk hjerneskade og kranievindue ved hjælp af et to-fotonmikroskop

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Vores protokol giver en måde at visualisere neuronal respons på mekanisk stress i en levende mus, hvilket kan give direkte bevis for, hvordan traumatisk hjerneskade påvirker hjernen. Denne teknik kan overvåge målproteinet på samme hjerneplacering i det samme dyr i både de akutte og kroniske faser efter traumatisk hjerneskade. Genet af interesse og viruspromotoren kan ændres i overensstemmelse hermed for at studere andre proteiner i de specifikke celletyper i hjernen.Til at begynde med skal du anvende oftalmisk salve på den bedøvede musens øjne. Fjern håret fra toppen af hovedet ved at trimme med almindelig saks. Efter etablering af et 12 til 15 millimeter langt midterlinjesnit skal du skære huden over venstre og højre halvkugle af kraniet ved hjælp af buet spidsfjedersaks.Når kraniet er udsat, skal du fjerne periosteum ved forsigtigt at gnide det med den sterile applikator med bomuldsspids og skylle det med sterilt saltvand. Når kranieområdet er tørret, skal du markere den traumatiske hjerneskade eller TBI, slagsted ved koordinaterne 2,5 millimeter bagved bregma og to millimeter lateralt fra sagittal sutur til højre. Fjern hurtigt musen fra den stereotaksiske ramme og læg hovedet på bufferpuden under TBI-enheden.Juster slaglegemets spids med det markerede anslagssted. Løft metalsøjlen ved at trække den tøjrede nylonstreng 15 centimeter over musehovedet, og slip den derefter, så vægten falder frit på transducerstangen, som er i kontakt med kranietoppe på TBI-stedet. Placer den bedøvede musens hoved på den stereotaksiske ramme, der holdes under det kirurgiske mikroskop.Bor forsigtigt og langsomt overfladen af kraniet ved hjælp af en FG4-hårdmetalbit ved lav rotorhastighed for at fjerne det resterende periosteum og skabe en ru kranieoverflade, så tandcementen binder sikkert med kraniet. Brug saltvand til at skylle og fjerne knoglestøv fra kraniets overflade. For at adskille sidemusklerne fra kraniet, cirka fem millimeter bagud for øjet, hvor suturen, der forbinder parietal og tidsmæssig kraniet, er placeret, skal du forsigtigt indsætte de fine lukkede spidser og forsigtigt flytte de lukkede spidser i bageste retning indtil lambdoid sutur.Adskil sidemusklerne på den side, hvor kranial vinduesimplantation vil forekomme. Vask snavs fra det kirurgiske sted ved hjælp af saltvand og tør området med gasbind. For at implantere hovedstolpen skal du markere midtpunktet 2,5 millimeter bagud til bregma og 1,5 millimeter fra sagittal sutur på højre halvkugle ved hjælp af en markørpen og en kirurgisk tykkelse.Spor derefter omkredsen af kraniotomien på den rene og tørre kraniet. Løsn ørestangen og drej hovedet, så kraniotomiplanet er perfekt vandret, og stram derefter ørestangen igen. Brug træpinden på en applikator med bomuldsspids til at tilføje to små dråber superlim til for- og bagkanten af hovedstolpen.Placer titaniumhovedstolpen over midten af kraniotomien, og juster den hurtigt til at hvile inden for det samme plan, hvor kranievinduet vil blive implanteret. Påfør let tryk, indtil superlimen er tørret, hvilket normalt tager cirka 30 sekunder. Forbered tandcement i en forkølet keramisk skål ved grundigt at blande 300 mg cementpulver, seks dråber QuickBase-væske og en dråbe katalysator.Påfør hurtigt en generøs mængde tandcementblanding på ydersiden af den sporede omkreds og dæk enhver udsat knogleoverflade. Dæk dog ikke stedet for kraniotomien. Slip ørestangen, og fastgør hovedstolpen til metalrammen for at sikre, at hovedet er stabilt til præcis boring langs den markerede kraniotomikreds.For at udføre kraniotomien skal du bruge en kirurgisk tykkelse til at verificere diameteren af den markerede cirkel som vist før og justere efter behov, så kranievinduet passer tæt inde i kraniotomien. Brug en elektrisk tandboremaskine til at ætse og tynde kraniet langs ydersiden af den markerede cirkel ved hjælp af en FG4-hårdmetalbit først, hvilket skaber et spor, inden for hvilket kraniet kan tyndes. Skyl området med saltvand for at vaske knoglestøvet væk.Fortsæt med at tynde kraniet ved hjælp af en FG 1/4 hårdmetalbit, indtil kraniet er papirtyndt og gennemsigtigt. Stop regelmæssigt boringen, og skyl hele området med sterilt saltvand igen for at reducere opvarmningen fra boret og vaske knoglestøvet væk. Afslut kranieudtyndingen ved hjælp af en EF4-hårdmetalbit, og fortsæt udtynding og boring gennem resten af kraniet langs sporet.Indsæt en 0,5 millimeter finspidset tang gennem det revnede sted, og løft knogleklappen forsigtigt opad uden at indrykke den underliggende hjerne. Efter fjernelse af knogleklappen skylles kraniotomiområdet med saltvand. Brug den buede spidsede kirurgiske tang til forsigtigt at fjerne det synlige arachnoide stof.Brug den lige spidsede kirurgiske tang til at samle det sterile glasvindue op med det tre millimeter lange glasdæksel nedad. Placer og juster glasvinduet over kraniotomistedet for at sikre, at vinduet kan passe tæt til kraniotomikanten. Den fem millimeter lange glasdæksel er på toppen.Forbered tandcementen som vist tidligere, og vent ca. seks minutter, indtil cementen bliver pastaagtig og tyk. Mens du venter på, at cementen bliver pastaagtig og tyk, skal du lægge et passende tryk på vinduet gennem en stereotaksisk manipulator for at kontrollere, at kraniet sikkert og tæt kan kontakte glasvinduet. Brug en justerbar præcisionsapplikatorbørste til at tilføje en lille mængde cement langs vindueskanten for at forsegle glasvinduet med kraniet.Vent ca. 10 minutter for at lade cementen tørre helt, slip derefter forsigtigt, og fjern manipulatoren over vinduet. Afslut ved at trimme tandcementen ved hjælp af tandboret med et FG4-hårdmetalbit, hvis overskydende cement dækker vinduet. Ca. fire timer efter operationen blev der udført to-fotonbilleddannelse, hvor vaskulaturen på det overfladiske niveau syntes sort, og på det dybe niveau på ca. 400 mikrometer blev EGFP-proteinekspression diffust fordelt i hele cellekroppen.En uge og fire måneder efter TBI blev vaskulaturmønsteret observeret på tidspunktet for dag nul brugt som reference til at lokalisere det samme billeddannelsesområde. Vaskulaturmønsteret svarer til det på dag nul. Tilsvarende blev EGFP-ekspressionen påvist i hele cellekroppen.Fluorescensintensiteten på dag nul og fire måneder var ens på både det overfladiske og dybere niveau. Imidlertid var fluorescensintensiteten efter en uge lavere end dag nul og fire måneder, muligvis på grund af den translationelle undertrykkelse, der blev rapporteret for andre TBI-modeller. Det er afgørende at være yderst forsigtig, når du betjener kraniotomi-trinnet for at undgå at beskadige hjernevævet.Få ikke borespidsen indsat i hjernen. Ved hjælp af denne teknik kan forskere visualisere forskellige proteiner af interesse i den samme celle i længderetningen på tværs af forskellige faser efter TBI, hvilket giver information om lokalisering, ekspression og opløselighed af proteinet i pattedyrhjernen efter traumer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Intravital Imaging af axonale Interaktioner med Mikroglia og makrofager i en mus Dorsal kolonne knusningsskade

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

En metode til at påføre lukket hoved traumatisk hjerneskade i<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale aktivitet i den primære somatosensoriske Cortex ved hjælp af Thy1-GCaMP6s Transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

En roman In Vitro Model af Blast traumatisk hjerneskade

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Virkningerne af Blast-induceret Neurotrauma på trykisoleret gnaver midt cerebrale arterier

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...