Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

We danken Dr. Miguel Sena-Esteves van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het schenken van het AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-virus, en Debra Cameron van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het tekenen van de schedelschets van de muizen. We danken ook de huidige en voormalige leden van de Bosco-, Schafer- en Henninger-labs voor hun suggesties en steun. Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van Defensie (W81XWH202071/PRARP) aan DAB, DS en NH.

Alle diergerelateerde protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, gepubliceerd door de commissie van de National Research Council (VS). De protocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Chan Medical School (UMMS) van de Universiteit van Massachusetts (vergunningsnummer 202100057). In het kort, zoals te zien is in het schema van de studie (figuur 1), krijgt het dier een virusinjectie, ee...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

In deze studie werden AAV-injectie, TBI-toediening en een hoofdpost met schedelvensterimplantatie gecombineerd voor longitudinale beeldvormingsanalyse van EGFP-gelabelde neuronen in de hersenschors van muizen (lagen IV en V) om de effecten van TBI op corticale neuronen te observeren. Deze studie merkt op dat de TBI-locatie die hier is gekozen, boven de hippocampus, een relatief vlak en breed oppervlak biedt voor implantatie van het schedelvenster. Omgekeerd is de schedel relatief smal aan de voorkant van deze plaats, en ...

Traumatisch hersenletsel (TBI), dat het gevolg kan zijn van sportblessures, botsingen met voertuigen en militaire gevechten, is een wereldwijd gezondheidsprobleem. TBI kan leiden tot fysiologische, cognitieve en gedragsstoornissen en levenslange invaliditeit of mortaliteit 1,2. De ernst van TBI kan worden geclassificeerd als mild, matig en ernstig, waarbij de overgrote meerderheid milde TBI is (75%-90%)3. Het wordt steeds meer erkend dat TBI, met name herhaalde voorvallen van TBI, neuronale degeneratie kan bevorderen en als risicofactoren kan dienen voor verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en chronische traumatische encefalopathie (CTE)4,5,6. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan TBI-geïnduceerde neurodegeneratie blijven echter onduidelijk en vormen dus een actief studiegebied. Om inzicht te krijgen in hoe neuronen reageren op en herstellen van TBI, wordt hierin een methode beschreven voor het monitoren van fluorescerend gelabelde eiwitten die van belang zijn, met name in neuronen, door middel van longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen na TBI.
Daartoe laat deze studie zien hoe een chirurgische ingreep voor de toediening van gesloten schedel-TBI die vergelijkbaar is met wat eerder is gerapporteerd7,8 kan worden gecombineerd met een chirurgische ingreep voor implantatie van een schedelvenster voor stroomafwaartse intravitale beeldvorming, zoals beschreven door Goldey et al9. Het is met name niet haalbaar om eerst een schedelraam te implanteren en vervolgens een TBI in dezelfde regio uit te voeren, omdat de impact van de gewichtsval die de TBI induceert het venster waarschijnlijk zal beschadigen en onherstelbare schade aan de muis zal toebrengen. Daarom is dit protocol ontworpen om de TBI toe te dienen en vervolgens het schedelvenster direct boven de impactplaats te implanteren, allemaal binnen dezelfde chirurgische sessie. Een voordeel van het combineren van zowel de TBI als de schedelvensterimplantatie in één operatiesessie is een vermindering van het aantal keren dat een muis wordt geopereerd. Verder stelt het iemand in staat om de onmiddellijke respons (d.w.z. op de tijdschaal van uren) op TBI te volgen, in tegenstelling tot het implanteren van het venster bij een latere chirurgische sessie (d.w.z. de eerste beeldvorming die begint op een tijdschaal van dagen na TBI). Het craniale venster en het intravitale beeldvormingsplatform bieden ook voordelen ten opzichte van het monitoren van neuronale eiwitten met conventionele methoden, zoals immunokleuring van vaste weefsels. Er zijn bijvoorbeeld minder muizen nodig voor intravitale beeldvorming, omdat dezelfde muis op meerdere tijdstippen kan worden bestudeerd, in tegenstelling tot afzonderlijke cohorten muizen die nodig zijn voor discrete tijdstippen. Verder kunnen dezelfde neuronen in de loop van de tijd worden gevolgd, waardoor men specifieke biologische of pathologische gebeurtenissen binnen dezelfde cel kan volgen.
Als proof of concept wordt hier de neuronspecifieke expressie van versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) onder de synapsinepromotor gedemonstreerd10. Deze benadering kan worden uitgebreid tot 1) verschillende hersenceltypen door gebruik te maken van andere celtypespecifieke promotors, zoals myeline-basisproteïne (MBP)-promotor voor oligodendrocyten en glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP)-promotor voor astrocyten11, 2) verschillende doeleiwitten van belang door hun genen te fuseren met het EGFP-gen, en 3) meerdere eiwitten tot co-expressie te brengen die zijn gefuseerd met verschillende fluoroforen. Hier wordt EGFP verpakt en tot expressie gebracht via adeno-geassocieerd virus (AAV) toediening via een intracraniële injectie. Een TBI met gesloten schedel wordt toegediend met behulp van een apparaat voor gewichtsval, gevolgd door implantatie van een schedelvenster. Visualisatie van neuronale EGFP wordt bereikt door het craniale venster, met behulp van twee-fotonmicroscopie om EGFP-fluorescentie in vivo te detecteren. Met de twee-fotonlaser is het mogelijk om dieper in het corticale weefsel door te dringen met minimale fotoschade, waardoor herhaalde longitudinale beeldvorming van dezelfde corticale regio's binnen een individuele muis gedurende dagen en tot maanden mogelijk is12,13,14,15. Kortom, deze benadering van het combineren van een TBI-operatie met intravitale beeldvorming heeft tot doel het begrip van de moleculaire gebeurtenissen die bijdragen aan TBI-geïnduceerde ziektepathologie te vergroten16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe de expressie en lokalisatie van een eiwit van belang in specifieke celtypen van de hersenen van een dier longitudinaal kan worden gevisualiseerd, bij blootstelling aan exogene stimuli. Hier wordt de toediening van een traumatisch hersenletsel (TBI) met gesloten schedel en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen getoond. Muizen worden intracraniaal geïnjecteerd met een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een neuronale specifieke promotor. Na 2 tot 4 weken worden de muizen onderworpen aan een repetitieve TBI met behulp van een gewichtsdruppelapparaat boven de AAV-injectielocatie. Binnen dezelfde chirurgische sessie worden de muizen geïmplanteerd met een metalen hoofdpost en vervolgens een glazen schedelvenster over de TBI-impactplaats. De expressie en cellulaire lokalisatie van EGFP wordt onderzocht met behulp van een microscoop met twee fotonen in hetzelfde hersengebied dat in de loop van maanden aan trauma is blootgesteld.

Als proof of concept voor dit protocol werden virale deeltjes die AAV-Syn1-EGFP tot expressie brengen, geïnjecteerd in de hersenschors van mannelijke TDP-43 Q331K/Q331K-muizen (C57BL/6J-achtergrond)19 op de leeftijd van 3 maanden. Opgemerkt wordt dat wildtype C57BL/6J-dieren ook kunnen worden gebruikt, maar deze studie werd uitgevoerd bij TDP-43 Q331K/Q331K-muizen omdat het laboratorium zich richt op onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. 4 weken na de AAV-injectie werd ...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Ons protocol biedt een manier om de neuronale reactie op mechanische stress in een levende muis te visualiseren, wat direct bewijs kan leveren van hoe traumatisch hersenletsel de hersenen beïnvloedt. Deze techniek kan het doeleiwit op dezelfde hersenlocatie in hetzelfde dier monitoren voor zowel de acute als de chronische fase na traumatisch hersenletsel. Het gen van belang en de viruspromotor kunnen dienovereenkomstig worden gewijzigd om andere eiwitten in de specifieke celtypen in de hersenen te bestuderen.Breng om te beginnen oogzalf aan op de ogen van de verdoofde muis. Verwijder het haar van de bovenkant van het hoofd door te knippen met een gewone schaar. Na het maken van een incisie van 12 tot 15 millimeter lang, snijdt u de huid over de linker- en rechterhersenhelft van de schedel met behulp van een veerschaar met gebogen punt.Zodra de schedel zichtbaar is, verwijdert u het periosteum door er zachtjes over te wrijven met de steriele wattenstaafje en het te spoelen met steriele zoutoplossing. Zodra het schedelgebied is opgedroogd, markeert u de inslagplaats van het traumatisch hersenletsel, of TBI, op de coördinaten 2,5 millimeter achter het bregma en twee millimeter lateraal van de sagittale hechting aan de rechterkant. Haal de muis snel uit het stereotaxische frame en plaats de kop op het bufferkussen onder het TBI-apparaat.Lijn de punt van het botslichaam uit met de gemarkeerde inslagplaats. Til de metalen kolom op door het vastgebonden nylon touwtje 15 centimeter boven het hoofd van de muis te trekken en laat het vervolgens los, zodat het gewicht vrij op de transducerstaaf kan vallen, die in contact staat met de schedelbovenkant op de TBI-plaats. Plaats het hoofd van de verdoofde muis op het stereotaxische frame dat onder de chirurgische microscoop wordt bewaard.Boor voorzichtig en langzaam in het oppervlak van de schedel met een FG4-hardmetalen boor met een lage rotorsnelheid om het resterende periost te verwijderen en creëer een ruw schedeloppervlak zodat het tandcement stevig met de schedel bindt. Gebruik zoutoplossing om botstof van het schedeloppervlak te spoelen en te verwijderen. Om de laterale spieren van de schedel te scheiden, ongeveer vijf millimeter achter het oog, waar de hechting bevindt die de pariëtale en temporale schedel verbindt, brengt u voorzichtig de fijne gesloten uiteinden in en beweegt u de gesloten uiteinden voorzichtig in de achterste richting tot aan de lambdoïde hechting.Scheid de laterale spieren aan de kant waar de implantatie van het schedelvenster zal plaatsvinden. Spoel het vuil van de operatieplaats weg met zoutoplossing en droog het gebied af met gaas. Om de hoofdpaal te implanteren, markeert u het middelpunt 2,5 millimeter achter het bregma en 1,5 millimeter van de sagittale hechting op de rechterhersenhelft met behulp van een markeerstift en een chirurgische schuifmaat.Trek vervolgens de omtrek van de craniotomie over op de schone en droge schedel. Maak de oorbalk los en draai de kop, zodat het craniotomievlak perfect horizontaal is, en draai de oorbalk vervolgens weer vast. Gebruik het houten stokje van een applicator met wattenstaafje om twee kleine druppels secondelijm aan te brengen aan de voor- en achterkant van de hoofdpaal.Plaats de titanium hoofdpost over het midden van de craniotomie en pas deze snel aan om binnen hetzelfde vlak te rusten waar het schedelvenster zal worden geïmplanteerd. Oefen lichte druk uit totdat de secondelijm is opgedroogd, wat meestal ongeveer 30 seconden duurt. Bereid tandheelkundig cement in een voorgekoelde keramische schaal door 300 milligram cementpoeder, zes druppels QuickBase-vloeistof en één druppel katalysator grondig te mengen.Breng snel een ruime hoeveelheid tandheelkundig cementmengsel aan op de buitenomtrek van de getraceerde omtrek en bedek elk blootliggend botoppervlak. Bedek echter niet de plaats van de craniotomie. Maak de oorstang los en bevestig de hoofdpaal aan het metalen frame om ervoor te zorgen dat de kop stabiel staat voor nauwkeurig boren langs de gemarkeerde craniotomieomtrek.Om de craniotomie uit te voeren, gebruikt u een chirurgische schuifmaat om de diameter van de gemarkeerde cirkel te verifiëren zoals eerder gedemonstreerd, en past u deze indien nodig aan, zodat het schedelvenster precies in de craniotomie past. Gebruik een elektrische tandartsboor om de schedel langs de buitenkant van de gemarkeerde cirkel te etsen en te verdunnen met eerst een FG4-hardmetalen bit, waardoor een spoor ontstaat waarbinnen de schedel kan worden uitgedund. Irrigeer het gebied met zoutoplossing om het botstof weg te spoelen.Ga door met het verdunnen van de schedel met een FG 1/4 hardmetalen bit totdat de schedel flinterdun en transparant is. Stop regelmatig met boren en irrigeer het hele gebied opnieuw met steriele zoutoplossing om de opwarming van de boor te verminderen en het botstof weg te spoelen. Voltooi het uitdunnen van de schedel met een EF4-carbide bit en ga door met dunner worden en boren door de rest van de schedel langs het spoor.Steek een pincet van 0,5 millimeter met fijne punt door de gebarsten plaats en til de botflap voorzichtig omhoog zonder de onderliggende hersenen in te deuken. Na het verwijderen van de botflap, irrigeert u het craniotomiegebied met zoutoplossing. Gebruik de gebogen chirurgische pincet om voorzichtig de zichtbare spinachtige materie te verwijderen.Gebruik de chirurgische pincet met rechte punt om het steriele glazen venster op te pakken met de drie millimeter glazen afdekglaasje naar beneden gericht. Plaats en pas het glazen venster aan boven de craniotomieplaats om ervoor te zorgen dat het venster goed aansluit op de craniotomierand. De vijf millimeter glazen afdekglaasje zit bovenop.Bereid het tandcement voor zoals eerder gedemonstreerd en wacht ongeveer zes minuten tot het cement pasteus en dik wordt. Terwijl u wacht tot het cement pasteus en dik wordt, oefent u voldoende druk uit op het raam via een stereotaxische manipulator om te controleren of de schedel veilig en stevig contact kan maken met het glazen raam. Gebruik een verstelbare precisie-applicatorborstel om een kleine hoeveelheid cement langs de raamrand toe te voegen om het glazen raam met de schedel af te dichten.Wacht ongeveer 10 minuten om het cement volledig te laten drogen, laat dan voorzichtig los en verwijder de manipulator boven het raam. Voltooi door het tandcement bij te snijden met behulp van de tandartsboor met een FG4-carbide bit als overtollig cement het raam bedekt. Ongeveer vier uur na de operatie werd beeldvorming met twee fotonen uitgevoerd, waarbij op oppervlakkig niveau het vaatstelsel zwart leek, en op het diepe niveau van ongeveer 400 micrometer was de EGFP-eiwitexpressie diffuus verdeeld over het cellichaam.Een week en vier maanden na TBI werd het vasculatuurpatroon dat werd waargenomen op het tijdstip van dag nul gebruikt als referentie om hetzelfde beeldvormingsgebied te lokaliseren. Het vasculatuurpatroon is vergelijkbaar met dat op dag nul. Evenzo werd de EGFP-expressie in het hele cellichaam gedetecteerd.De fluorescentie-intensiteit op dag nul en vier maanden was vergelijkbaar op zowel het oppervlakkige als het diepere niveau. De fluorescentie-intensiteit na één week was echter lager dan die van dag nul en vier maanden, mogelijk als gevolg van de translationele repressie die werd gerapporteerd voor andere TBI-modellen. Het is van cruciaal belang om uiterst voorzichtig te zijn bij het uitvoeren van de craniotomiestap om beschadiging van het hersenweefsel te voorkomen.Zorg ervoor dat de boorpunt niet in de hersenen wordt ingebracht. Met behulp van deze techniek kunnen onderzoekers verschillende eiwitten van belang in dezelfde cel longitudinaal visualiseren in verschillende fasen na TBI, wat informatie oplevert over de lokalisatie, expressie en oplosbaarheid van dat eiwit in de hersenen van zoogdieren na trauma.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Laterale Fluid Percussie: Model van traumatisch hersenletsel bij muizen

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Een methode om Closed Head Traumatic Brain Injury Inflict in<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Een roman In Vitro Model van traumatische hersenenverwonding Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Gevolgen van Blast-geïnduceerde Neurotrauma voor hydrofoor knaagdier midden cerebrale bloedvaten

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...