Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Wir danken Dr. Miguel Sena-Esteves von der University of Massachusetts Chan Medical School für das Geschenk des AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-Virus und Debra Cameron von der University of Massachusetts Chan Medical School für das Zeichnen der Mausschädelskizze. Wir danken auch aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Labore Bosco, Schäfer und Henninger für ihre Vorschläge und Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium (W81XWH202071/PRARP) für DAB, DS und NH finanziert.

Alle tierbezogenen Protokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der vom Ausschuss des National Research Council (US) veröffentlicht wurde. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) genehmigt (Genehmigungsnummer 202100057). Kurz gesagt, wie im Schema der Studie (Abbildung 1) dargestellt, erhält das Tier eine Virusinjektion, ein SHT, ...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

In dieser Studie wurden AAV-Injektion, SHT-Verabreichung und ein Headpost mit kranialer Fensterimplantation für die longitudinale Bildgebungsanalyse von EGFP-markierten Neuronen innerhalb des Hirnkortex der Maus (Schichten IV und V) kombiniert, um die Auswirkungen von SHT auf kortikale Neuronen zu beobachten. Diese Studie stellt fest, dass die hier gewählte SHT-Stelle, oberhalb des Hippocampus, eine relativ flache und breite Oberfläche für die Implantation des Schädelfensters bietet. Umgekehrt ist der Schädel vor d...

Schädel-Hirn-Traumata (SHT), die durch Sportverletzungen, Fahrzeugkollisionen und militärische Kämpfe entstehen können, sind ein weltweites Gesundheitsproblem. SHT kann zu physiologischen, kognitiven und Verhaltensdefiziten sowie zu lebenslanger Behinderung oder Mortalität führen 1,2. Der Schweregrad des Schädel-Hirn-Traumas kann als leicht, mittelschwer und schwer klassifiziert werden, wobei die überwiegende Mehrheit ein leichtes SHT ist (75 %-90 %)3. Es wird zunehmend anerkannt, dass SHT, insbesondere das wiederholte Auftreten von SHT, die neuronale Degeneration fördern und als Risikofaktoren für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen dienen kann, darunter Alzheimer (AD), amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und chronische traumatische Enzephalopathie (CTE)4,5,6. Die molekularen Mechanismen, die der SHT-induzierten Neurodegeneration zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar und stellen daher ein aktives Forschungsgebiet dar. Um einen Einblick in die Art und Weise zu gewinnen, wie Neuronen auf SHT reagieren und sich davon erholen, wird hierin ein Verfahren zur Überwachung fluoreszenzmarkierter Proteine von Interesse, insbesondere innerhalb von Neuronen, durch longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen nach einem SHT beschrieben.
Zu diesem Zweck wird in dieser Studie gezeigt, wie ein chirurgisches Verfahren zur Verabreichung eines Schädel-Hirn-SHT kombiniert werden kann, das dem ähnelt, was zuvor berichtet wurde7,8, zusammen mit einem chirurgischen Verfahren zur Implantation eines kranialen Fensters für die nachgeschaltete intravitale Bildgebung, wie von Goldey et al.beschrieben 9. Insbesondere ist es nicht möglich, zuerst ein Schädelfenster zu implantieren und anschließend ein Schädel-Hirn-Trauma in derselben Region durchzuführen, da der Aufprall des Gewichtsverlusts, der das Schädel-Hirn-Trauma auslöst, wahrscheinlich das Fenster beschädigt und der Maus irreparable Schäden zufügt. Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um das SHT zu verabreichen und dann das Schädelfenster direkt über der Aufprallstelle zu implantieren, und das alles innerhalb derselben chirurgischen Sitzung. Ein Vorteil der Kombination von SHT und Schädelfensterimplantation in einer einzigen chirurgischen Sitzung ist die Verringerung der Anzahl der Operationen, mit denen eine Maus operiert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die unmittelbare Reaktion (d. h. auf der Zeitskala von Stunden) auf ein SHT, im Gegensatz zur Implantation des Fensters bei einer späteren chirurgischen Sitzung (d. h. die erste Bildgebung beginnt auf einer Zeitskala von Tagen nach dem SHT). Das kraniale Fenster und die intravitale Bildgebungsplattform bieten auch Vorteile gegenüber der Überwachung neuronaler Proteine mit herkömmlichen Methoden wie der Immunfärbung von fixiertem Gewebe. Zum Beispiel werden weniger Mäuse für die intravitale Bildgebung benötigt, da dieselbe Maus zu mehreren Zeitpunkten untersucht werden kann, im Gegensatz zu separaten Kohorten von Mäusen, die für diskrete Zeitpunkte benötigt werden. Darüber hinaus können dieselben Neuronen im Laufe der Zeit überwacht werden, so dass bestimmte biologische oder pathologische Ereignisse innerhalb derselben Zelle verfolgt werden können.
Als Proof of Concept wird hier die neuronenspezifische Expression des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) unter dem Synapsin-Promotor demonstriert10. Dieser Ansatz kann auf 1) verschiedene Gehirnzelltypen ausgeweitet werden, indem andere zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, wie z. B. Myelin-Basisprotein (MBP)-Promotor für Oligodendrozyten und Gliafibrillen-Säureprotein (GFAP)-Promotor für Astrozyten11, 2) verschiedene Zielproteine von Interesse, indem ihre Gene mit dem EGFP-Gen fusioniert werden, und 3) mehrere Proteine co-exprimieren, die mit verschiedenen Fluorophoren fusioniert sind. Hier wird EGFP verpackt und über das Adeno-assoziierte Virus (AAV) durch eine intrakranielle Injektion exprimiert. Ein Schädel-Hirn-Trauma wird mit einem Gewichtsabfallgerät verabreicht, gefolgt von der Implantation eines Schädelfensters. Die Visualisierung der neuronalen EGFP erfolgt durch das kraniale Fenster, wobei die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, um die EGFP-Fluoreszenz in vivo zu detektieren. Mit dem Zwei-Photonen-Laser ist es möglich, mit minimaler Photoschädigung tiefer in das kortikale Gewebe einzudringen, was eine wiederholte Längsbildgebung derselben kortikalen Regionen innerhalb einer einzelnen Maus über Tage und bis zu Monate ermöglicht12,13,14,15. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz, eine SHT-Operation mit intravitaler Bildgebung zu kombinieren, darauf abzielt, das Verständnis der molekularen Ereignisse zu verbessern, die zur SHT-induzierten Krankheitspathologie beitragen16,17.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Expression und Lokalisierung eines interessierenden Proteins in bestimmten Zelltypen des Gehirns eines Tieres bei Exposition gegenüber exogenen Stimuli longitudinal visualisiert werden kann. Hier wird die Verabreichung eines Schädel-Hirn-Traumas (SHT) und die gleichzeitige Implantation eines Schädelfensters für die anschließende longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen gezeigt. Mäusen wird intrakranial ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) injiziert, das ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) unter einem neuronalen spezifischen Promotor exprimiert. Nach 2 bis 4 Wochen werden die Mäuse einem wiederholten Schädel-Hirn-Trauma mit einem Gewichtsabwurfgerät über der AAV-Injektionsstelle unterzogen. In derselben chirurgischen Sitzung werden den Mäusen ein Kopfpfosten aus Metall und dann ein Schädelfenster aus Glas über der SHT-Aufprallstelle implantiert. Die Expression und zelluläre Lokalisation von EGFP wird mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in derselben Hirnregion untersucht, die über Monate hinweg traumatisiert wurde.

Als Proof of Concept für dieses Protokoll wurden Viruspartikel, die AAV-Syn1-EGFP exprimieren, im Alter von 3 Monaten in die Hirnrinde von männlichen TDP-43 Q331K/Q331K-Mäusen (C57BL/6J-Hintergrund)19 injiziert. Es wird darauf hingewiesen, dass auch Wildtyp-C57BL/6J-Tiere verwendet werden können, diese Studie wurde jedoch an TDP-43Q331K/Q331K-Mäusen durchgeführt, da sich das Labor auf die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen konzentriert. Eine SHT-Operation wurde...

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Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Unser Protokoll bietet eine Möglichkeit, die neuronale Reaktion auf mechanischen Stress in einer lebenden Maus zu visualisieren, was einen direkten Beweis dafür liefern kann, wie sich ein Schädel-Hirn-Trauma auf das Gehirn auswirkt. Mit dieser Technik kann das Zielprotein an der gleichen Stelle im Gehirn desselben Tieres sowohl für die akute als auch für die chronische Phase nach einem Schädel-Hirn-Trauma überwacht werden. Das interessierende Gen und der Viruspromotor können entsprechend verändert werden, um andere Proteine in den spezifischen Zelltypen im Gehirn zu untersuchen.Tragen Sie zunächst eine Augensalbe auf die Augen der betäubten Maus auf. Entferne die Haare vom Oberkopf, indem du sie mit einer normalen Schere schneidest. Nach dem Anlegen eines 12 bis 15 Millimeter langen Mittellinienschnitts wird die Haut über der linken und rechten Schädelhälfte mit einer gebogenen Federschere herausgeschnitten.Sobald der Schädel freigelegt ist, entfernen Sie die Knochenhaut, indem Sie sie vorsichtig mit dem sterilen Applikator mit Baumwollspitze reiben und mit steriler Kochsalzlösung spülen. Sobald der Schädelbereich getrocknet ist, markieren Sie die Einschlagstelle des Schädel-Hirn-Traumas (SHT) an den Koordinaten 2,5 Millimeter hinter dem Bregma und zwei Millimeter lateral von der sagittalen Naht nach rechts. Nehmen Sie die Maus schnell aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie den Kopf auf das Pufferkissen unter dem TBI-Gerät.Richten Sie die Impaktorspitze an der markierten Aufprallstelle aus. Heben Sie die Metallsäule an, indem Sie die angebundene Nylonschnur 15 Zentimeter über den Mauskopf ziehen, und lassen Sie sie dann los, so dass das Gewicht frei auf die Schallkopfstange fallen kann, die an der Schädelstelle in Kontakt mit der Schädeldecke steht. Legen Sie den Kopf der anästhesierten Maus auf den stereotaktischen Rahmen, der unter dem Operationsmikroskop gehalten wird.Bohren Sie die Schädeloberfläche vorsichtig und langsam mit einem FG4-Hartmetallbohrer bei niedriger Rotordrehzahl, um die verbleibende Knochenhaut zu entfernen, und schaffen Sie eine raue Schädeloberfläche, so dass sich der Zahnzement sicher mit dem Schädel verbindet. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um Knochenstaub von der Schädeloberfläche zu spülen und zu entfernen. Um die seitlichen Muskeln vom Schädel zu trennen, etwa fünf Millimeter hinter dem Auge, wo sich die Naht zwischen Scheitel- und Schläfenschädel befindet, führen Sie die feinen geschlossenen Spitzen vorsichtig ein und bewegen Sie die geschlossenen Spitzen vorsichtig in die hintere Richtung bis zur Lambdoid-Naht.Trennen Sie die seitlichen Muskeln auf der Seite, auf der die Implantation des Schädelfensters stattfinden wird. Waschen Sie die Ablagerungen mit Kochsalzlösung von der Operationsstelle ab und trocknen Sie den Bereich mit Gaze. Um den Kopfpfosten zu implantieren, markieren Sie den Mittelpunkt 2,5 Millimeter hinter dem Bregma und 1,5 Millimeter von der sagittalen Naht auf der rechten Hemisphäre entfernt mit einem Markerstift und einem chirurgischen Messschieber.Zeichnen Sie dann den Umfang der Kraniotomie auf dem sauberen und trockenen Schädel nach. Lockern Sie die Ohrstange und drehen Sie den Kopf, so dass die Kraniotomieebene perfekt horizontal ist, und ziehen Sie dann die Ohrstange wieder fest. Verwende das Holzstäbchen eines Applikators mit Baumwollspitze, um zwei kleine Tropfen Sekundenkleber auf die vordere und hintere Kante des Kopfpfostens zu geben.Positionieren Sie den Kopfpfosten aus Titan über der Mitte der Kraniotomie und stellen Sie ihn schnell so ein, dass er in derselben Ebene liegt, in der das Schädelfenster implantiert wird. Übe leichten Druck aus, bis der Sekundenkleber getrocknet ist, was in der Regel etwa 30 Sekunden dauert. Bereiten Sie Zahnzement in einer vorgekühlten Keramikschale vor, indem Sie 300 Milligramm Zementpulver, sechs Tropfen QuickBase-Flüssigkeit und einen Tropfen Katalysator gründlich mischen.Tragen Sie schnell eine großzügige Menge Zahnzementmischung auf den äußeren Umfang des nachgezeichneten Umfangs auf und decken Sie die freiliegende Knochenoberfläche ab. Decken Sie jedoch nicht die Stelle der Kraniotomie ab. Lassen Sie die Ohrstange los und befestigen Sie den Kopfbügel am Metallrahmen, um sicherzustellen, dass der Kopf für ein präzises Bohren entlang des markierten Kraniotomieumfangs stabil ist.Um die Kraniotomie durchzuführen, verwenden Sie einen chirurgischen Messschieber, um den Durchmesser des markierten Kreises wie zuvor gezeigt zu überprüfen, und stellen Sie ihn bei Bedarf so ein, dass das Schädelfenster genau in die Kraniotomie passt. Ätzen und verdünnen Sie den Schädel mit einem elektrischen Zahnbohrer entlang der Außenseite des markierten Kreises mit einem FG4-Hartmetallbohrer, wodurch eine Spur entsteht, innerhalb derer der Schädel ausgedünnt werden kann. Bewässern Sie den Bereich mit Kochsalzlösung, um den Knochenstaub wegzuspülen.Fahren Sie mit der Verdünnung des Schädels mit einem FG 1/4 Hartmetallbohrer fort, bis der Schädel hauchdünn und durchsichtig ist. Beenden Sie regelmäßig das Bohren und spülen Sie den gesamten Bereich erneut mit steriler Kochsalzlösung, um die Erwärmung durch den Bohrer zu verringern und den Knochenstaub abzuwaschen. Beenden Sie die Schädelausdünnung mit einem EF4-Hartmetallbohrer und fahren Sie mit dem Ausdünnen und Bohren des restlichen Schädels entlang der Spur fort.Führen Sie eine 0,5 Millimeter große Pinzette mit feiner Spitze durch die gerissene Stelle und heben Sie den Knochenlappen vorsichtig nach oben, ohne das darunter liegende Gehirn einzudrücken. Nach Entfernung des Knochenlappens wird der Kraniotomiebereich mit Kochsalzlösung gespült. Entfernen Sie mit der gebogenen chirurgischen Pinzette vorsichtig die sichtbare Arachnoidalsubstanz.Nehmen Sie das sterile Glasfenster mit der geraden Spitze mit dem drei Millimeter dicken Glasdeckglas nach unten auf. Platzieren Sie das Glasfenster über der Kraniotomiekorte, um sicherzustellen, dass das Fenster genau an den Kraniotomiekand anpasst. Das fünf Millimeter große Deckglas befindet sich oben.Bereiten Sie den Zahnzement wie zuvor gezeigt vor und warten Sie etwa sechs Minuten, bis der Zement pastös und dickflüssig wird. Während Sie darauf warten, dass der Zement pastös und dickflüssig wird, üben Sie mit einem stereotaktischen Manipulator einen ausreichenden Druck auf das Fenster aus, um zu überprüfen, ob der Schädel das Glasfenster sicher und dicht berühren kann. Verwenden Sie einen verstellbaren Präzisionsapplikatorpinsel, um eine kleine Menge Zement entlang der Fensterkante hinzuzufügen, um das Glasfenster mit dem Schädel zu versiegeln.Warten Sie etwa 10 Minuten, bis der Zement vollständig getrocknet ist, lassen Sie ihn dann vorsichtig los und entfernen Sie den Manipulator über dem Fenster. Beenden Sie den Zahnzement mit dem Dentalbohrer mit einem FG4-Hartmetallbohrer, wenn überschüssiger Zement das Fenster bedeckt. Etwa vier Stunden nach der Operation wurde eine Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt, bei der das Gefäßsystem auf oberflächlicher Ebene schwarz und in der Tiefe von etwa 400 Mikrometern die EGFP-Proteinexpression diffus im gesamten Zellkörper verteilt war.Eine Woche und vier Monate nach dem SHT wurde das Gefäßmuster, das am Nullpunkt des Tages beobachtet wurde, als Referenz verwendet, um dieselbe Bildgebungsregion zu lokalisieren. Das Gefäßmuster ähnelt dem am Tag Null. In ähnlicher Weise wurde die EGFP-Expression im gesamten Zellkörper nachgewiesen.Die Fluoreszenzintensität am Tag Null und nach vier Monaten war sowohl auf der oberflächlichen als auch auf der tieferen Ebene ähnlich. Die Fluoreszenzintensität nach einer Woche war jedoch geringer als die von Tag Null und vier Monaten, was möglicherweise auf die translationale Repression zurückzuführen ist, die für andere SHT-Modelle berichtet wurde. Es ist wichtig, bei der Durchführung des Kraniotomieschritts äußerste Vorsicht walten zu lassen, um eine Schädigung des Hirngewebes zu vermeiden.Lassen Sie die Bohrspitze nicht in das Gehirn einführen. Mit dieser Technik können Forscher verschiedene Proteine von Interesse in derselben Zelle longitudinal über verschiedene Phasen nach dem Schädel-Hirn-Trauma hinweg visualisieren und so Informationen über die Lokalisation, Expression und Löslichkeit dieses Proteins im Säugetiergehirn nach einem Trauma liefern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Eine neuartige In-vitro- Modell von traumatischen Hirnverletzungen Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...