Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

אנו מודים לד"ר מיגל סנה-אסטבס מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן על הענקת נגיף AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, ולדברה קמרון מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן על ציור שרטוט גולגולת העכברים. אנו מודים גם לחברים בהווה ובעבר במעבדות בוסקו, שפר והנינגר על הצעותיהם ותמיכתם. עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה (W81XWH202071/PRARP) ל-DAB, DS ו-NH.

כל הפרוטוקולים הקשורים לבעלי חיים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי ועדת המועצה הלאומית למחקר (ארה"ב). הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן (UMMS) (היתר מספר 202100057). בקצרה, כפי שניתן לראות בסכמת ...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

במחקר זה, הזרקת AAV, מתן TBI ועמוד ראש עם השתלת חלון גולגולתי שולבו לצורך ניתוח הדמיה אורכית של תאי עצב המסומנים בתווית EGFP בתוך קליפת המוח של העכבר (שכבות IV ו-V) כדי לבחון את ההשפעות של TBI על נוירונים בקליפת המוח. מחקר זה מציין כי אתר TBI שנבחר כאן, מעל ההיפוקמפוס, מספק משטח שטוח ורחב יחסית להשתלת חל...

פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיכולה לנבוע מפציעות ספורט, התנגשויות בכלי רכב ולחימה צבאית, היא דאגה בריאותית עולמית. פגיעה מוחית טראומטית יכולה להוביל לליקויים פיזיולוגיים, קוגניטיביים והתנהגותיים, ולנכות או תמותה לכל החיים 1,2. חומרת TBI יכולה להיות מסווגת כקלה, בינונית וחמורה, כאשר הרוב המכריע הוא TBI קל (75%-90%)3. יותר ויותר מכירים בכך שפגיעה מוחית טראומטית, במיוחד התרחשויות חוזרות ונשנות של TBI, יכולה לקדם ניוון עצבי ולשמש כגורמי סיכון למספר מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), דמנציה פרונטוטמפורלית (FTD) ואנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE)4,5,6. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ניוון עצבי הנגרם על-ידי TBI עדיין אינם ברורים, ולכן הם מייצגים תחום מחקר פעיל. כדי לקבל תובנה לגבי האופן שבו תאי עצב מגיבים לפגיעה מוחית טראומטית ומתאוששים ממנה, שיטה לניטור חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי של עניין, במיוחד בתוך תאי עצב, באמצעות הדמיה תוך-חיונית אורכית בעכברים לאחר TBI מתוארת כאן.
לשם כך, מחקר זה מראה כיצד לשלב הליך כירורגי למתן TBI בגולגולת סגורה הדומה למה שדווח בעבר7,8, יחד עם הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי לדימות תוך חיוני במורד הזרם, כפי שתואר על ידי Goldey et al9. יש לציין כי אין זה ריאלי להשתיל תחילה חלון גולגולתי ולאחר מכן לבצע TBI באותו אזור, שכן ההשפעה של ירידת המשקל שגורמת לפגיעה מוחית טראומטית עלולה לפגוע בחלון ולגרום נזק בלתי הפיך לעכבר. לכן, פרוטוקול זה תוכנן לנהל את הפגיעה המוחית טראומטית ולאחר מכן להשתיל את חלון הגולגולת ישירות מעל אתר הפגיעה, והכל באותו מפגש כירורגי. יתרון בשילוב של TBI והשתלת חלון גולגולתי בפגישה כירורגית אחת הוא הפחתה במספר הפעמים שעכבר נתון לניתוח. יתר על כן, היא מאפשרת לאדם לעקוב אחר התגובה המיידית (כלומר, על ציר הזמן של שעות) לפגיעה מוחית טראומטית, בניגוד להשתלת החלון בפגישה כירורגית מאוחרת יותר (כלומר, הדמיה ראשונית שמתחילה בסקאלת זמן של ימים לאחר TBI). חלון הגולגולת ופלטפורמת הדימות התוך חיונית מציעים גם יתרונות על פני ניטור חלבונים עצביים בשיטות קונבנציונליות כגון צביעה חיסונית של רקמות קבועות. לדוגמה, פחות עכברים נדרשים לדימות תוך-חיוני, מכיוון שניתן לחקור את אותו עכבר במספר נקודות זמן, בניגוד לקבוצות נפרדות של עכברים הדרושות לנקודות זמן נפרדות. יתר על כן, אותם נוירונים יכולים להיות מנוטרים לאורך זמן, המאפשר אחד לעקוב אחר אירועים ביולוגיים או פתולוגיים ספציפיים בתוך אותו תא.
כהוכחת היתכנות, הביטוי הספציפי לנוירון של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת מקדם הסינפסינים מודגם כאן10. גישה זו יכולה להיות מורחבת ל 1) סוגים שונים של תאי מוח על ידי שימוש במקדמים ספציפיים אחרים לסוג התא, כגון מקדם חלבון בסיסי מיאלין (MBP) עבור אוליגודנדרוציטים ומקדם חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) עבור אסטרוציטים11, 2) חלבוני מטרה שונים בעלי עניין על ידי מיזוג הגנים שלהם עם הגן EGFP, ו -3) ביטוי משותף של חלבונים מרובים המאוחים לפלואורופורים שונים. כאן, EGFP נארז ומתבטא באמצעות משלוח וירוס הקשור אדנו (AAV) באמצעות זריקה תוך גולגולתית. TBI בעל גולגולת סגורה מנוהל באמצעות מכשיר לירידה במשקל, ואחריו השתלה של חלון גולגולתי. הדמיה של EGFP עצבי מושגת דרך חלון הגולגולת, באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים כדי לזהות פלואורסצנטיות EGFP in vivo. עם לייזר שני פוטונים, ניתן לחדור עמוק יותר לתוך רקמת קליפת המוח עם נזק פוטוגרפי מינימלי, המאפשר הדמיה אורכית חוזרת ונשנית של אותם אזורים בקליפת המוח בתוך עכבר בודד במשך ימים ועד חודשים12,13,14,15. לסיכום, גישה זו של שילוב ניתוח TBI עם הדמיה תוך-חיונית שואפת לקדם את ההבנה של האירועים המולקולריים התורמים לפתולוגיה של מחלות המושרות על ידי TBI16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לדמיין לאורך זמן את הביטוי והלוקליזציה של חלבון מעניין בתוך סוגי תאים ספציפיים במוחו של בעל חיים, בעת חשיפה לגירויים אקסוגניים. כאן מוצג ניהול של פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה (TBI) והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית אורכית עוקבת בעכברים. עכברים מוזרקים תוך גולגולתית עם וירוס הקשור לאדנו (AAV) המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת מקדם ספציפי לנוירונים. לאחר 2 עד 4 שבועות, העכברים עוברים TBI חוזר ונשנה באמצעות מכשיר ירידה במשקל מעל מיקום הזרקת AAV. באותו ניתוח משתילים את העכברים עמוד ראש מתכתי ולאחר מכן חלון גולגולת זכוכית מעל אתר הפגיעה בפגיעה מוחית טראומטית. הביטוי והמיקום התאי של EGFP נבדקים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים באותו אזור במוח שנחשף לטראומה במשך חודשים.

כהוכחת היתכנות לפרוטוקול זה, חלקיקים נגיפיים המבטאים AAV-Syn1-EGFP הוזרקו לקליפת המוח של עכברי TDP-43Q331K/Q331K זכרים (רקע C57BL/6J)19 בגיל 3 חודשים. יצוין כי ניתן להשתמש גם בחיות בר מסוג C57BL/6J, אולם מחקר זה בוצע בעכברי TDP-43Q331K/Q331K מכיוון שהמעבדה מתמקדת במחקר מחלות נוירודגנרטיביות. נית?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

הפרוטוקול שלנו מספק דרך לדמיין את התגובה העצבית ללחץ מכני בעכבר חי, אשר יכולה לספק ראיות ישירות לאופן שבו פגיעה מוחית טראומטית משפיעה על המוח. טכניקה זו יכולה לנטר את חלבון המטרה באותו מיקום במוח באותה חיה הן בשלב החריף והן בשלב הכרוני לאחר פגיעה מוחית טראומטית. הגן המעניין ומקדם הנגיף יכולים להשתנות בהתאם כדי לחקור חלבונים אחרים בסוגי התאים הספציפיים במוח.כדי להתחיל, להחיל משחה אופתלמית על העיניים של העכבר מורדם. הסר את השיער מהחלק העליון של הראש על ידי חיתוך עם מספריים רגילים. לאחר קביעת חתך בקו האמצע באורך 12 עד 15 מילימטרים, יש לכרות את העור מעל האונה השמאלית והימנית של הגולגולת באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים.לאחר חשיפת הגולגולת, הסירו את הפריאוסטאום על ידי שפשוף עדין עם המוליך הסטרילי מכותנה, ושטיפתו במי מלח סטריליים. לאחר ייבוש אזור הגולגולת, סמנו את אזור הפגיעה המוחית הטראומטית, או TBI, בקואורדינטות 2.5 מילימטרים אחוריים לברגמה ושני מילימטרים רוחביים מתפר הקשת מימין. הסר במהירות את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את הראש על כרית החיץ מתחת להתקן TBI.ישר את קצה המשפיע לאתר ההשפעה המסומן. הרימו את עמוד המתכת על ידי משיכת חוט הניילון הקשור 15 סנטימטרים מעל ראש העכבר, ואז שחררו אותו, מה שמאפשר למשקל ליפול בחופשיות על מוט המתמר, שנמצא במגע עם ראש הגולגולת באתר TBI. הניחו את ראשו של העכבר המורדם על המסגרת הסטריאוטקסית שנשמרה מתחת למיקרוסקופ הכירורגי.קדח בעדינות ובאיטיות את פני השטח של הגולגולת באמצעות ביט קרביד FG4 במהירות רוטור נמוכה כדי להסיר את הפריאוסטאום שנותר, וצור משטח גולגולת מחוספס כך שהמלט הדנטלי נקשר היטב עם הגולגולת. השתמשו במי מלח כדי לשטוף ולנקות אבק עצמות מפני השטח של הגולגולת. כדי להפריד את השרירים הרוחביים מהגולגולת, בערך חמישה מילימטרים אחוריים לעין, שם ממוקם התפר המחבר בין הגולגולת הקודקודית והרקתית, הכניסו בעדינות את הקצוות הסגורים העדינים והזיזו בעדינות את הקצוות הסגורים בכיוון האחורי עד לתפר הלמבדואיד.הפרידו את השרירים הרוחביים בצד שבו תתרחש השתלת חלון גולגולתי. לשטוף את הפסולת מאתר הניתוח באמצעות מלוחים ולייבש את האזור עם גזה. כדי להשתיל את עמוד הראש, סמן את נקודת המרכז 2.5 מילימטרים אחורית לברגמה ו -1.5 מילימטרים מתפר הקשת בהמיספרה הימנית באמצעות עט סמן וקליפר כירורגי.לאחר מכן עקוב אחר היקף הקרניוטומיה על הגולגולת הנקייה והיבשה. שחררו את מוט האוזן וסובבו את הראש, כך שמישור הקרניוטומיה יהיה אופקי לחלוטין, ולאחר מכן הדקו שוב את מוט האוזן. השתמשו במקל העץ של אפליקטור עם קצוות כותנה כדי להוסיף שתי טיפות קטנות של דבק-על לקצה הקדמי והאחורי של עמוד הראש.מקמו את עמוד ראש הטיטניום מעל מרכז הקרניוטומיה, והתאימו אותו במהירות למנוחה באותו מישור שבו יושתל חלון הגולגולת. הפעילו לחץ קל עד לייבוש דבק העל, פעולה שנמשכת בדרך כלל כ-30 שניות. הכינו מלט דנטלי בכלי קרמי מקורר מראש על ידי ערבוב יסודי של 300 מיליגרם אבקת מלט, שש טיפות נוזל QuickBase וטיפה אחת של זרז.יש למרוח במהירות כמות נדיבה של תערובת צמנט דנטלי על ההיקף החיצוני ולכסות כל משטח עצם חשוף. עם זאת, אין לכסות את האתר של craniotomy. שחררו את מוט האוזן והצמידו את עמוד הראש למסגרת המתכת כדי להבטיח שהראש יציב לקידוח מדויק לאורך היקף הקרניוטומיה המסומן.כדי לבצע את הקרניוטומיה, השתמש בקליפר כירורגי כדי לוודא את קוטר העיגול המסומן כפי שהודגם קודם, והתאם לפי הצורך, כך שחלון הגולגולת יתאים היטב לתוך הקרניוטומיה. בעזרת מקדחה דנטלית חשמלית, חורטים ומדללים את הגולגולת לאורך החלק החיצוני של העיגול המסומן באמצעות ביט קרביד FG4 תחילה, היוצר מסילה שבתוכה ניתן לדלל את הגולגולת. השקו את האזור במי מלח כדי לשטוף את אבק העצמות.ממשיכים לדלל את הגולגולת באמצעות FG 1/4 carbide bit עד שהגולגולת דקה ושקופה. מעת לעת, להפסיק את הקידוח, ולהשקות את כל האזור עם מלוחים סטריליים שוב כדי להפחית את החימום מן המקדחה כדי לשטוף את אבק העצם. השלימו את דילול הגולגולת באמצעות ביט קרביד EF4, והמשיכו לדלל ולקדוח דרך שאר הגולגולת לאורך המסילה.הכניסו מלקחיים עדינים בקוטר 0.5 מ"מ דרך המקום הסדוק, והרימו את דש העצם בעדינות כלפי מעלה מבלי להסיט פנימה את המוח שמתחתיו. לאחר הסרת דש העצם, להשקות את אזור craniotomy עם מלוחים. בעזרת המלקחיים הכירורגיים בעלי הקצה המעוקל, הסר בעדינות את החומר הארכנואיד הנראה לעין.השתמש במלקחיים כירורגיים בעלי קצה ישר כדי להרים את חלון הזכוכית הסטרילית כאשר כיסוי הזכוכית בגודל שלושה מילימטר פונה כלפי מטה. מקמו וכווננו את חלון הזכוכית מעל אתר הקרניוטומיה כדי לוודא שהחלון יכול להתאים היטב לקצה הקרניוטומיה. משטח כיסוי הזכוכית בקוטר חמישה מ"מ נמצא למעלה.מכינים את המלט הדנטלי כפי שהודגם קודם לכן, וממתינים כשש דקות עד שהמלט הופך בצקי וסמיך. בזמן ההמתנה שהמלט יהפוך לבצקי ועבה, הפעילו כמות מספקת של לחץ על החלון באמצעות מניפולטור סטריאוטקסי כדי לבדוק שהגולגולת יכולה לבוא במגע בטוח והדוק עם חלון הזכוכית. השתמש במברשת אפליקטור מדויקת מתכווננת כדי להוסיף כמות קטנה של מלט לצד קצה החלון כדי לאטום את חלון הזכוכית עם הגולגולת.המתן כ -10 דקות כדי לתת למלט להתייבש לחלוטין, ואז שחרר בעדינות, והסר את המניפולטור מעל החלון. השלם על ידי חיתוך המלט הדנטלי באמצעות מקדחה דנטלית עם ביט קרביד FG4 אם עודפי מלט מכסים את החלון. כארבע שעות לאחר הניתוח בוצעה הדמיה של שני פוטונים, כאשר ברמה השטחית כלי הדם נראו שחורים, וברמה העמוקה של כ-400 מיקרומטר, ביטוי חלבון EGFP התפזר באופן מפוזר בכל גוף התא.שבוע וארבעה חודשים לאחר TBI, תבנית כלי הדם שנצפתה בנקודת זמן של יום אפס שימשה כנקודת התייחסות לאיתור אותו אזור הדמיה. דפוס כלי הדם דומה לזה שביום האפס. באופן דומה, ביטוי EGFP זוהה בכל גוף התא.עוצמת הפלואורסצנטיות ביום אפס ובארבעה חודשים הייתה דומה הן ברמה השטחית והן ברמה העמוקה יותר. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות בשבוע אחד הייתה נמוכה מזו של יום אפס וארבעה חודשים, אולי בגלל הדיכוי התרגומי שדווח עבור מודלים אחרים של TBI. חשוב לנקוט משנה זהירות בעת הפעלת שלב הקרניוטומיה כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח.אל תחדיר את קצה המקדחה למוח. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לדמיין חלבונים שונים בעלי עניין באותו תא לאורך שלבים שונים לאחר TBI, ולספק מידע על הלוקליזציה, הביטוי והמסיסות של חלבון זה במוח יונקים לאחר טראומה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...