Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Ringraziamo il Dr. Miguel Sena-Esteves della Chan Medical School dell'Università del Massachusetts per aver donato il virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e Debra Cameron della University of Massachusetts Chan Medical School per aver disegnato lo schizzo del cranio dei topi. Ringraziamo anche i membri attuali e passati dei laboratori Bosco, Schafer e Henninger per i loro suggerimenti e il loro supporto. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa (W81XWH202071/PRARP) a DAB, DS e NH.

Tutti i protocolli relativi agli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal Comitato del Consiglio Nazionale delle Ricerche (USA). I protocolli sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Chan Medical School (UMMS) dell'Università del Massachusetts (numero di permesso 202100057). In breve, come mostrato nello schema di studio (Figura 1), l'animale riceve un'iniezione virale, un traum...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

In questo studio, l'iniezione di AAV, la somministrazione di TBI e un copricapo con impianto di finestra cranica sono stati combinati per l'analisi di imaging longitudinale dei neuroni marcati con EGFP all'interno della corteccia cerebrale del topo (strati IV e V) per osservare gli effetti del TBI sui neuroni corticali. Questo studio rileva che il sito del trauma cranico scelto qui, sopra l'ippocampo, fornisce una superficie relativamente piatta e ampia per l'impianto della finestra cranica. Al contrario, il cranio è re...

La lesione cerebrale traumatica (TBI), che può derivare da lesioni sportive, collisioni di veicoli e combattimenti militari, è un problema di salute in tutto il mondo. Il trauma cranico può portare a deficit fisiologici, cognitivi e comportamentali e disabilità o mortalità permanente 1,2. La gravità del trauma cranico può essere classificata come lieve, moderata e grave, la stragrande maggioranza dei quali è un trauma cranico lieve (75%-90%)3. È sempre più riconosciuto che il trauma cranico, in particolare le occorrenze ripetitive di trauma cranico, possono promuovere la degenerazione neuronale e fungere da fattori di rischio per diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e l'encefalopatia traumatica cronica (CTE)4,5,6. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della neurodegenerazione indotta da TBI rimangono poco chiari e rappresentano quindi un'area di studio attiva. Per ottenere informazioni su come i neuroni rispondono e si riprendono dal trauma cranico, viene descritto un metodo per il monitoraggio delle proteine di interesse marcate con fluorescenza, in particolare all'interno dei neuroni, mediante imaging intravitale longitudinale nei topi dopo trauma cranico.
A tal fine, questo studio mostra come combinare una procedura chirurgica per la somministrazione di un trauma cranico a cranio chiuso simile a quella precedentemente riportata7,8, insieme a una procedura chirurgica per l'impianto di una finestra cranica per l'imaging intravitale a valle, come descritto da Goldey et al9. In particolare, non è possibile impiantare prima una finestra cranica e successivamente eseguire un trauma cranico nella stessa regione, poiché l'impatto della caduta di peso che induce il trauma cranico rischia di danneggiare la finestra e causare danni irreparabili al topo. Pertanto, questo protocollo è stato progettato per somministrare il trauma cranico e quindi impiantare la finestra cranica direttamente sul sito di impatto, il tutto all'interno della stessa sessione chirurgica. Un vantaggio della combinazione del trauma cranico e dell'impianto della finestra cranica in un'unica sessione chirurgica è la riduzione del numero di volte in cui un topo viene sottoposto a intervento chirurgico. Inoltre, consente di monitorare la risposta immediata (cioè sulla scala temporale di ore) al trauma cranico, invece di impiantare la finestra in una sessione chirurgica successiva (cioè l'imaging iniziale che inizia su una scala temporale di giorni dopo il trauma cranico). La finestra cranica e la piattaforma di imaging intravitale offrono anche vantaggi rispetto al monitoraggio delle proteine neuronali con metodi convenzionali come l'immunocolorazione dei tessuti fissi. Ad esempio, sono necessari meno topi per l'imaging intravitale, poiché lo stesso topo può essere studiato in più punti temporali, al contrario di coorti separate di topi necessarie per punti temporali discreti. Inoltre, gli stessi neuroni possono essere monitorati nel tempo, consentendo di tracciare specifici eventi biologici o patologici all'interno della stessa cellula.
Come prova di concetto, l'espressione neurone-specifica della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto il promotore della sinapsina è dimostrata qui10. Questo approccio può essere esteso a 1) diversi tipi di cellule cerebrali utilizzando altri promotori specifici del tipo di cellula, come il promotore della proteina basica della mielina (MBP) per gli oligodendrociti e il promotore della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) per gli astrociti11, 2) diverse proteine bersaglio di interesse fondendo i loro geni con il gene EGFP e 3) co-esprimendo più proteine fuse a diversi fluorofori. In questo caso, l'EGFP viene confezionato ed espresso tramite la somministrazione di virus adeno-associati (AAV) attraverso un'iniezione intracranica. Un trauma cranico a cranio chiuso viene somministrato utilizzando un dispositivo per la riduzione del peso, seguito dall'impianto di una finestra cranica. La visualizzazione dell'EGFP neuronale si ottiene attraverso la finestra cranica, utilizzando la microscopia a due fotoni per rilevare la fluorescenza dell'EGFP in vivo. Con il laser a due fotoni, è possibile penetrare più in profondità nel tessuto corticale con un fotodanno minimo, consentendo l'imaging longitudinale ripetuto delle stesse regioni corticali all'interno di un singolo topo per giorni e fino a mesi12,13,14,15. In sintesi, questo approccio di combinazione di un intervento chirurgico per trauma cranico con l'imaging intravitale mira a far progredire la comprensione degli eventi molecolari che contribuiscono alla patologia della malattia indotta da trauma cranico16,17.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come visualizzare longitudinalmente l'espressione e la localizzazione di una proteina di interesse all'interno di specifici tipi di cellule del cervello di un animale, in seguito all'esposizione a stimoli esogeni. Qui, viene mostrata la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso (TBI) e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale longitudinale nei topi. Ai topi viene iniettato per via intracranica un virus adeno-associato (AAV) che esprime una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto un promotore neuronale specifico. Dopo 2-4 settimane, i topi vengono sottoposti a un trauma cranico ripetitivo utilizzando un dispositivo di caduta del peso sopra la posizione di iniezione dell'AAV. All'interno della stessa sessione chirurgica, ai topi viene impiantato un palo di metallo e quindi una finestra cranica di vetro sopra il sito di impatto del trauma cranico. L'espressione e la localizzazione cellulare dell'EGFP vengono esaminate utilizzando un microscopio a due fotoni nella stessa regione del cervello esposta a traumi nel corso di mesi.

Come prova di concetto per questo protocollo, particelle virali che esprimono AAV-Syn1-EGFP sono state iniettate nella corteccia cerebrale di topi maschi TDP-43 Q331K/Q331K (sfondo C57BL/6J)19 all'età di 3 mesi. Si noti che possono essere utilizzati anche animali wild-type C57BL/6J, tuttavia questo studio è stato condotto su topi TDP-43 Q331K/Q331K perché il laboratorio è focalizzato sulla ricerca sulle malattie neurodegenerative. Un intervento chirurgico per trauma crani...

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Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.

Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Il nostro protocollo fornisce un modo per visualizzare la risposta neuronale allo stress meccanico in un topo vivo, che può fornire prove dirette di come la lesione cerebrale traumatica influisca sul cervello. Questa tecnica è in grado di monitorare la proteina bersaglio nella stessa posizione cerebrale nello stesso animale sia per la fase acuta che per quella cronica dopo una lesione cerebrale traumatica. Il gene di interesse e il promotore del virus possono essere modificati di conseguenza per studiare altre proteine nei tipi di cellule specifiche del cervello.Per iniziare, applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo anestetizzato. Rimuovi i capelli dalla sommità della testa tagliandoli con le normali forbici. Dopo aver stabilito un'incisione della linea mediana lunga da 12 a 15 millimetri, asportare la pelle sugli emisferi sinistro e destro del cranio usando forbici a molla a punta curva.Una volta che il cranio è esposto, rimuovere il periostio strofinandolo delicatamente con l'applicatore sterile con punta in cotone e sciacquandolo con soluzione fisiologica sterile. Una volta che l'area del cranio è asciutta, segnare il sito di impatto della lesione cerebrale traumatica, o TBI, alle coordinate 2,5 millimetri posteriori al bregma e due millimetri laterali dalla sutura sagittale a destra. Rimuovere rapidamente il mouse dal telaio stereotassico e posizionare la testa sul cuscino tampone sotto il dispositivo TBI.Allineare la punta del dispositivo d'urto con il punto d'impatto contrassegnato. Sollevare la colonna metallica tirando la corda di nylon legata a 15 centimetri sopra la testa del topo, quindi rilasciarla, lasciando che il peso cada liberamente sull'asta del trasduttore, che è a contatto con la parte superiore del cranio nel sito del trauma cranico. Posizionare la testa del topo anestetizzato sul telaio stereotassico tenuto sotto il microscopio operatorio.Forare delicatamente e lentamente la superficie del cranio utilizzando una punta in metallo duro FG4 a bassa velocità del rotore per rimuovere il periostio rimanente e creare una superficie cranica ruvida in modo tale che il cemento dentale si leghi saldamente al cranio. Usa la soluzione salina per lavare e rimuovere la polvere ossea dalla superficie del cranio. Per separare i muscoli laterali dal cranio, a circa cinque millimetri posteriormente all'occhio, dove si trova la sutura che collega il cranio parietale e temporale, inserire delicatamente le punte fini chiuse e muovere delicatamente le punte chiuse in direzione posteriore fino alla sutura lambdoide.Separare i muscoli laterali sul lato in cui si verificherà l'impianto della finestra cranica. Lavare via i detriti dal sito chirurgico con soluzione fisiologica e asciugare l'area con una garza. Per impiantare il perno della testa, segnare il punto centrale 2,5 millimetri posteriormente al bregma e 1,5 millimetri dalla sutura sagittale sull'emisfero destro utilizzando un pennarello e un calibro chirurgico.Quindi traccia la circonferenza della craniotomia sul cranio pulito e asciutto. Allentare la barra auricolare e ruotare la testa, in modo che il piano della craniotomia sia perfettamente orizzontale, quindi serrare nuovamente la barra auricolare. Usa il bastoncino di legno di un applicatore con punta di cotone per aggiungere due piccole gocce di supercolla sul bordo anteriore e posteriore del montante della testa.Posizionare il perno della testa in titanio al centro della craniotomia e regolarlo rapidamente per farlo riposare all'interno dello stesso piano in cui verrà impiantata la finestra cranica. Applicare una leggera pressione fino a quando la supercolla non si è asciugata, il che di solito richiede circa 30 secondi. Preparare il cemento dentale in un piatto di ceramica preraffreddato mescolando accuratamente 300 milligrammi di polvere di cemento, sei gocce di liquido QuickBase e una goccia di catalizzatore.Applicare rapidamente una generosa quantità di miscela di cemento dentale sul perimetro esterno della circonferenza tracciata e coprire qualsiasi superficie ossea esposta. Tuttavia, non coprire il sito della craniotomia. Rilasciare la barra auricolare e fissare il montante della testa al telaio metallico per assicurarsi che la testa sia stabile per una perforazione precisa lungo la circonferenza della craniotomia contrassegnata.Per eseguire la craniotomia, utilizzare un calibro chirurgico per verificare il diametro del cerchio contrassegnato come dimostrato in precedenza e regolare se necessario, in modo che la finestra cranica si adatti perfettamente all'interno della craniotomia. Utilizzando un trapano dentale elettrico, incidere e assottigliare il cranio lungo l'esterno del cerchio contrassegnato utilizzando prima una punta in metallo duro FG4, che crea una traccia all'interno della quale assottigliare il cranio. Irrigare l'area con soluzione fisiologica per lavare via la polvere ossea.Continuare ad assottigliare il cranio usando una punta in metallo duro FG 1/4 fino a quando il cranio non è sottile come carta e trasparente. Periodicamente, interrompere la perforazione e irrigare nuovamente l'intera area con soluzione fisiologica sterile per ridurre il riscaldamento del trapano e per lavare via la polvere ossea. Completare l'assottigliamento del cranio utilizzando una punta in metallo duro EF4 e continuare ad assottigliare e perforare il resto del cranio lungo la pista.Inserire una pinza a punta fine da 0,5 millimetri attraverso il punto incrinato e sollevare delicatamente il lembo osseo verso l'alto senza intaccare il cervello sottostante. Dopo aver rimosso il lembo osseo, irrigare l'area craniotomica con soluzione fisiologica. Utilizzando la pinza chirurgica a punta curva, rimuovere delicatamente la materia aracnoidea visibile.Utilizzare la pinza chirurgica a punta diritta per sollevare la finestra di vetro sterile con il vetrino di copertura da tre millimetri rivolto verso il basso. Posizionare e regolare la finestra di vetro sopra il sito della craniotomia per assicurarsi che la finestra possa adattarsi perfettamente al bordo della craniotomia. Il vetrino coprioggetto da cinque millimetri è in alto.Preparare il cemento dentale come dimostrato in precedenza e attendere circa sei minuti fino a quando il cemento diventa pastoso e denso. In attesa che il cemento diventi pastoso e denso, applicare un'adeguata pressione alla finestra attraverso un manipolatore stereotassico per verificare che il cranio possa entrare in contatto sicuro e stretto con la finestra di vetro. Usa un pennello applicatore di precisione regolabile per aggiungere una piccola quantità di cemento lungo il bordo della finestra per sigillare la finestra di vetro con il cranio.Attendere circa 10 minuti per lasciare asciugare completamente il cemento, quindi rilasciare delicatamente e rimuovere il manipolatore sopra la finestra. Completare tagliando il cemento dentale utilizzando il trapano dentale con una punta in metallo duro FG4 se il cemento in eccesso copre la finestra. A circa quattro ore dall'intervento chirurgico, è stato eseguito l'imaging a due fotoni, dove a livello superficiale la vascolarizzazione appariva nera, e a livello profondo di circa 400 micrometri, l'espressione della proteina EGFP era diffusamente distribuita in tutto il corpo cellulare.A una settimana e quattro mesi dopo il trauma cranico, il modello vascolare osservato al punto del giorno zero è stato utilizzato come riferimento per localizzare la stessa regione di imaging. Il modello vascolare è simile a quello del giorno zero. Allo stesso modo, l'espressione di EGFP è stata rilevata in tutto il corpo cellulare.L'intensità della fluorescenza al giorno zero e a quattro mesi era simile sia a livello superficiale che a livello più profondo. Tuttavia, l'intensità della fluorescenza a una settimana era inferiore a quella del giorno zero e a quattro mesi, probabilmente a causa della repressione traslazionale riportata per altri modelli di trauma cranico. È fondamentale prestare la massima attenzione quando si esegue la fase di craniotomia per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.Non inserire la punta del trapano nel cervello. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori possono visualizzare diverse proteine di interesse nella stessa cellula longitudinalmente attraverso diverse fasi post-trauma cranico, fornendo informazioni sulla localizzazione, l'espressione e la solubilità di quella proteina nel cervello dei mammiferi dopo un trauma.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Ricerca

Neuroscienze

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Un metodo per infliggere Chiuso Testa trauma cranico in<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Un modello di romanzo In Vitro di ferita di cervello traumatica di scoppio

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Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effetti del Neurotrauma indotta da Blast il roditore pressurizzato Middle arterie cerebrali

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...