Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP 바이러스를 기증해 주신 University of Massachusetts Chan Medical School의 Miguel Sena-Esteves 박사님과 생쥐 두개골 스케치를 그려주신 University of Massachusetts Chan Medical School의 Debra Cameron 박사님께 감사드립니다. 또한 Bosco, Schafer 및 Henninger 연구소의 현재 및 이전 구성원의 제안과 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국방부(W81XWH202071/PRARP)에서 DAB, DS 및 NH에 자금을 지원했습니다.

모든 동물 관련 프로토콜은 미국 국립연구위원회(National Research Council) 위원회에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 매사추세츠 대학교 챈 의과대학(UMMS)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(허가 번호 202100057)의 승인을 받았습니다. 간단히 말해서, 연구 개략도(그림 1)에서 볼 수 있듯이 동물은 ?...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

이 연구에서는 AAV 주입, TBI 투여 및 두개골 창 이식이 있는 헤드포스트를 결합하여 쥐 뇌 피질(레이어 IV 및 V) 내 EGFP 표지 뉴런의 종단 이미징 분석을 통해 TBI가 피질 뉴런에 미치는 영향을 관찰했습니다. 이 연구는 여기에서 선택한 TBI 부위가 해마 위에 두개골 창 이식을 위한 비교적 평평하고 넓은 표면을 제공한다는 점에 주목합니다. 반대로, 두개골은 이 부위의 앞쪽이 상대적으로 좁기 때문에 ...

스포츠 부상, 차량 충돌 및 군사 전투로 인해 발생할 수 있는 외상성 뇌 손상(TBI)은 전 세계적으로 건강 문제입니다. TBI는 생리적, 인지적, 행동적 결핍과 평생 장애 또는 사망률로 이어질 수 있다 1,2. TBI 중증도는 경증, 중등도 및 중증으로 분류할 수 있으며, 대다수는 경증 TBI(75%-90%)3입니다. TBI, 특히 TBI의 반복적인 발생은 신경 퇴화를 촉진하고 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 위험 요인으로 작용할 수 있다는 사실이 점점 더 많이 인식되고 있습니다.4,5,6. 그러나 TBI 유발 신경 퇴행의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 불분명하므로 활발한 연구 분야입니다. 뉴런이 TBI에 반응하고 TBI로부터 회복하는 방법에 대한 통찰력을 얻기 위해, TBI 후 마우스에서 종방향 생체 내 이미징에 의해 특히 뉴런 내에서 관심 있는 형광 태그 단백질을 모니터링하는 방법이 본원에 설명되어 있습니다.
이를 위해 본 연구는 이전에 보고된 것과 유사한 폐쇄형 두개골 TBI 투여를 위한 외과적 절차(7,8)와 Goldey 등(9)이 기술한 바와 같이 다운스트림 생체 내 이미징을 위한 두개골 창 이식을 위한 외과적 절차를 결합하는 방법을 보여줍니다. 특히, TBI를 유도하는 체중 감소의 영향으로 창호가 손상되고 마우스에 돌이킬 수 없는 손상을 입힐 가능성이 높기 때문에 두개골 창을 먼저 이식한 후 동일한 부위에 TBI를 수행하는 것은 불가능합니다. 따라서 이 프로토콜은 TBI를 투여한 다음 동일한 수술 세션 내에서 충격 부위 바로 위에 두개골 창을 이식하도록 설계되었습니다. 한 번의 수술 세션에서 TBI와 두개골 창 이식을 결합하는 것의 장점은 마우스가 수술을 받는 횟수를 줄일 수 있다는 것입니다. 또한 TBI에 대한 즉각적인 반응(즉, 시간 척도)을 모니터링할 수 있으며, 이후 수술 세션(즉, TBI 후 며칠 동안 초기 이미징을 시작하는 것)에서 창을 이식하는 것과는 대조적입니다. 두개골 창 및 생체 내 이미징 플랫폼은 또한 고정 조직의 면역 염색과 같은 기존 방법으로 신경 단백질을 모니터링하는 것보다 이점을 제공합니다. 예를 들어, 개별 시점에 필요한 별도의 마우스 코호트와 달리 동일한 마우스를 여러 시점에서 연구할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 더 적은 수의 마우스가 필요합니다. 또한 시간이 지남에 따라 동일한 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 동일한 세포 내에서 특정 생물학적 또는 병리학적 사건을 추적할 수 있습니다.
개념 증명으로서, 시냅신 프로모터 하에서 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 뉴런 특이적 발현이 여기10에 입증되어 있다. 이 접근법은 1) 희소돌기아교세포에 대한 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터 및 성상교세포에 대한 신경교세포의 섬유산성 단백질(GFAP) 프로모터와 같은 다른 세포 유형 특이적 프로모터를 활용하여 다른 뇌세포 유형으로 확장할 수 있으며, 2) 유전자를 EGFP 유전자와 융합하여 관심 있는 다른 표적 단백질을 활용하고, 3) 서로 다른 형광단에 융합된 여러 단백질을 동시 발현할 수 있습니다. 여기서 EGFP는 두개내 주사를 통한 아데노 관련 바이러스(AAV) 전달을 통해 패키징되고 발현됩니다. 폐쇄형 두개골 TBI는 체중 감량 장치를 사용하여 투여된 후 두개골 창을 이식합니다. 신경 세포 EGFP의 시각화는 두개골 창을 통해 이루어지며, 생체 내에서 EGFP 형광을 검출하기 위해 이광자 현미경을 사용합니다. 2광자 레이저를 사용하면 광손상을 최소화하면서 피질 조직 깊숙이 침투할 수 있어 며칠 및 최대 12,13,14,15개월 동안 개별 마우스 내에서 동일한 피질 영역의 반복적인 세로 이미징이 가능합니다. 요컨대, TBI 수술과 생체 내 영상을 결합하는 이러한 접근법은 TBI 유발 질환 병리학에 기여하는 분자 사건에 대한 이해를 증진시키는 것을 목표로 한다16,17.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

이 프로토콜의 목표는 외인성 자극에 노출되었을 때 동물 뇌의 특정 세포 유형 내에서 관심 단백질의 발현 및 국소화를 종단적으로 시각화하는 방법을 보여주는 것입니다. 여기에서, 폐쇄된 두개골 외상성 뇌 손상(TBI)의 투여와 마우스의 후속 종방향 생체 내 이미징을 위한 두개골 창의 동시 이식을 보여줍니다. 마우스는 신경 세포 특이적 프로모터 하에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 두개내로 주입합니다. 2 내지 4주 후, 마우스는 AAV 주입 위치 위에 체중 감소 장치를 사용하여 반복적인 TBI를 실시한다. 동일한 수술 세션 내에서 마우스에 금속 헤드포스트를 이식한 다음 TBI 충격 부위 위에 유리 두개골 창을 이식합니다. EGFP의 발현 및 세포 국소화는 수개월 동안 외상에 노출된 동일한 뇌 영역에서 이광자 현미경을 사용하여 검사됩니다.

이 프로토콜에 대한 개념 증명으로, AAV-Syn1-EGFP를 발현하는 바이러스 입자를 생후 3개월에 수컷 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스(C57BL/6J 배경)19의 뇌 피질에 주입했습니다. 야생형 C57BL/6J 동물도 사용할 수 있지만, 이 연구는 실험실이 신경퇴행성 질환 연구에 중점을 두고 있기 때문에 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스에서 수행되었습니다. TBI 수술은 AAV 주사 후 4주 후에 시행되었습니다....

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Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

당사의 프로토콜은 살아있는 쥐의 기계적 스트레스에 대한 신경 반응을 시각화하는 방법을 제공하며, 이는 외상성 뇌 손상이 뇌에 미치는 영향에 대한 직접적인 증거를 제공할 수 있습니다. 이 기술은 외상성 뇌 손상 후 급성 및 만성 단계 모두에 대해 동일한 동물의 동일한 뇌 위치에서 표적 단백질을 모니터링할 수 있습니다. 관심 유전자와 바이러스 프로모터는 뇌의 특정 세포 유형에 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 그에 따라 변경될 수 있습니다.시작하려면 마취된 쥐의 눈에 안과 연고를 바르십시오. 일반 가위로 다듬어 머리 꼭대기의 머리카락을 제거하십시오. 12-15mm 길이의 정중선을 절개한 후 구부러진 팁 스프링 가위를 사용하여 두개골의 좌우 반구의 피부를 절제합니다.두개골이 노출되면 멸균 면 팁 어플리케이터로 부드럽게 문질러 골막을 제거하고 멸균 식염수로 씻어냅니다. 두개골 부위가 건조되면 외상성 뇌 손상(TBI) 충격 부위를 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 시상 봉합사에서 측면 2mm 좌표에 표시합니다. 입체 프레임 프레임에서 마우스를 빠르게 제거하고 TBI 장치 아래의 완충 쿠션에 헤드를 놓습니다.임팩터 팁을 표시된 충격 부위에 맞춥니다. 묶인 나일론 끈을 마우스 머리 위로 15cm 당겨 금속 기둥을 들어 올린 다음 풀어 TBI 부위의 두개골 상단과 접촉하는 변환기 막대에 무게가 자유롭게 떨어지도록 합니다. 마취된 쥐의 머리를 수술용 현미경 아래에 보관된 입체 프레임에 놓습니다.FG4 카바이드 비트를 사용하여 낮은 로터 속도로 두개골 표면을 부드럽고 천천히 뚫어 남아 있는 골막을 제거하고 치과용 시멘트가 두개골과 단단히 결합되도록 거친 두개골 표면을 만듭니다. 식염수를 사용하여 두개골 표면에서 뼛가루를 씻어내고 제거합니다. 두개골에서 외측 근육을 분리하려면 두정과 측두골을 연결하는 봉합사가 있는 눈 뒤쪽 약 5mm에서 미세한 닫힌 팁을 부드럽게 삽입하고 닫힌 팁을 양털 봉합사가 될 때까지 뒤쪽 방향으로 부드럽게 움직입니다.두개창 이식이 이루어지는 쪽의 측면 근육을 분리합니다. 식염수를 사용하여 수술 부위의 이물질을 씻어내고 거즈로 해당 부위를 말립니다. 헤드 포스트를 이식하려면 마커 펜과 수술용 캘리퍼스를 사용하여 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 반구의 시상 봉합사에서 1.5mm 떨어진 곳에 중심점을 표시합니다.그런 다음 깨끗하고 건조한 두개골의 개두술 둘레를 추적합니다. 이어 바를 풀고 머리를 돌려 개두면이 완벽하게 수평이 되도록 한 다음 이어 바를 다시 조입니다. 면봉 어플리케이터의 나무 막대기를 사용하여 헤드 포스트의 앞면과 뒷면 가장자리에 초강력 접착제 두 방울을 떨어뜨립니다.티타늄 헤드 포스트를 개두술의 중앙 위에 놓고 두개골 창이 이식될 동일한 평면 내에 놓이도록 빠르게 조정합니다. 초강력 접착제가 마를 때까지 가벼운 압력을 가하면 일반적으로 약 30초가 걸립니다. 예냉식 세라믹 접시에 시멘트 분말 300mg, QuickBase 액체 6방울, 촉매 1방울을 완전히 혼합하여 치과용 시멘트를 준비합니다.넉넉한 양의 치과용 시멘트 혼합물을 추적된 둘레의 바깥쪽 둘레에 빠르게 바르고 노출된 뼈 표면을 덮습니다. 그러나 개두술 부위를 덮지 마십시오. 이어 바를 풀고 헤드 포스트를 금속 프레임에 고정하여 헤드가 표시된 개두술 둘레를 따라 정밀한 드릴링을 위해 안정적인지 확인합니다.개두술을 수행하려면 수술용 캘리퍼스를 사용하여 앞에서 설명한 대로 표시된 원의 직경을 확인하고 필요에 따라 조정하여 두개골 창이 개두술 내부에 꼭 맞도록 합니다. 전기 치과 드릴을 사용하여 FG4 카바이드 비트를 사용하여 표시된 원의 바깥쪽을 따라 두개골을 에칭하고 얇게 하여 두개골을 얇게 할 트랙을 만듭니다. 뼛가루를 씻어내기 위해 식염수로 해당 부위를 관개하십시오.두개골이 종이처럼 얇고 투명해질 때까지 FG 1/4 카바이드 비트를 사용하여 두개골을 계속 얇게 만듭니다. 주기적으로 드릴링을 중지하고 전체 부위를 멸균 식염수로 다시 관개하여 드릴의 열을 줄이고 뼛가루를 씻어냅니다. EF4 카바이드 비트를 사용하여 두개골 얇게 만들기를 완료하고 트랙을 따라 나머지 두개골을 계속 얇게 하고 드릴링합니다.갈라진 부분에 0.5mm의 끝이 가는 집게를 삽입하고 밑에 있는 뇌를 움푹 들어가지 않고 뼈 피판을 부드럽게 위로 들어 올립니다. 뼈 피판을 제거한 후 개두술 부위를 식염수로 세척합니다. 끝이 구부러진 수술용 집게를 사용하여 눈에 보이는 지주막 물질을 부드럽게 제거합니다.끝이 직선인 수술용 집게를 사용하여 3mm 유리 커버 슬립이 아래를 향하도록 하여 멸균 유리창을 집습니다. 개두술 부위 위에 유리창을 놓고 조정하여 창이 개두술 가장자리에 꼭 맞도록 합니다. 5mm 유리 커버 슬립이 상단에 있습니다.앞서 설명한 대로 치과용 시멘트를 준비하고 시멘트가 반죽처럼 두꺼워질 때까지 약 6분 정도 기다립니다. 시멘트가 반죽되고 두꺼워질 때까지 기다리는 동안 입체 조작기를 통해 창에 적절한 양의 압력을 가하여 두개골이 유리창에 안전하고 단단히 접촉할 수 있는지 확인합니다. 조정 가능한 정밀 어플리케이터 브러시를 사용하여 창 가장자리를 따라 소량의 시멘트를 추가하여 유리창을 두개골로 밀봉합니다.시멘트가 완전히 마를 때까지 약 10분 정도 기다렸다가 창 위의 매니퓰레이터를 부드럽게 풀어 제거합니다. 과도한 시멘트가 창을 덮고 있는 경우 FG4 카바이드 비트가 있는 치과용 드릴을 사용하여 치과용 시멘트를 다듬어 완료합니다. 수술 후 약 4시간 후, 2광자 이미징을 수행했는데, 표면 수준의 혈관 조직에서는 검게 보였고, 약 400마이크로미터의 깊은 수준에서는 EGFP 단백질 발현이 세포체 전체에 확산적으로 분포되었습니다.TBI 후 1주일 4개월에 0일 시점에서 관찰된 혈관 구조 패턴을 동일한 이미징 영역을 찾기 위한 참조로 사용했습니다. 혈관 패턴은 0일차와 유사합니다. 유사하게, EGFP 발현은 세포체 전체에서 검출되었습니다.0일째와 4개월째의 형광 강도는 표재성 수준과 심층 수준 모두에서 비슷했습니다. 그러나 1주일의 형광 강도는 0일째 및 4개월의 형광 강도보다 낮았는데, 이는 다른 TBI 모델에서 보고된 병진 억제 때문일 수 있습니다. 개두술을 시행할 때 뇌 조직이 손상되지 않도록 최대한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.드릴 팁을 뇌에 삽입하지 마십시오. 이 기술을 사용하여 연구자들은 TBI 이후 여러 단계에 걸쳐 동일한 세포에서 서로 다른 관심 단백질을 종단으로 시각화하여 외상 후 포유류 뇌에서 해당 단백질의 국소화, 발현 및 용해도에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

연구

신경과학

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 방법<em&gt; 초파리</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

모델을 새로운 시험관에 폭발 외상 성 뇌 손상의

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...