Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Vi takker Dr. Miguel Sena-Esteves ved University of Massachusetts Chan Medical School for å gi bort AAV (PHP.eB)-Syn1-EGFP-viruset, og Debra Cameron ved University of Massachusetts Chan Medical School for å tegne mushodeskalleskissen. Vi takker også nåværende og tidligere medlemmer av Bosco, Schafer og Henninger laboratorier for deres forslag og støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Department of Defense (W81XWH202071/PRARP) til DAB, DS og NH.

Alle dyrerelaterte protokoller ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals utgitt av National Research Council (US) Committee. Protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (tillatelsesnummer 202100057). Kort sagt, som vist i skjematisk studie (figur 1), mottar dyret en virusinjeksjon, en TBI, en vindusimplantasjon og deretter intravital avbildning i en tidssekvens.
<p cla...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

I denne studien ble AAV-injeksjon, TBI-administrasjon og en hodepost med kranialvinduimplantasjon kombinert for langsgående bildeanalyse av EGFP-merkede nevroner i musehjernebarken (lag IV og V) for å observere effekten av TBI på kortikale nevroner. Denne studien bemerker at TBI-stedet som er valgt her, over hippocampus, gir en relativt flat og bred overflate for implantasjon av kranialvinduet. Omvendt er skallen relativt smal foran dette stedet, og derfor er det vanskelig å sikre at hodepinnen effektivt kommer i kon...

Traumatisk hjerneskade (TBI), som kan skyldes sportsskader, kjøretøykollisjoner og militærkamp, er et verdensomspennende helseproblem. TBI kan føre til fysiologiske, kognitive og atferdsmessige underskudd, og livslang funksjonshemming eller dødelighet 1,2. TBI-alvorlighetsgraden kan klassifiseres som mild, moderat og alvorlig, de aller fleste er mild TBI (75%-90%)3. Det blir stadig mer anerkjent at TBI, spesielt repeterende forekomster av TBI, kan fremme nevronal degenerasjon og tjene som risikofaktorer for flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og kronisk traumatisk encefalopati (CTE)4,5,6. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene som ligger til grunn for TBI-indusert nevrodegenerasjon uklare, og representerer dermed et aktivt studieområde. For å få innsikt i hvordan nevroner reagerer på og gjenoppretter fra TBI, er en metode for overvåking av fluorescerende merkede proteiner av interesse, spesielt i nevroner, ved langsgående intravital avbildning i mus etter TBI beskrevet her.
For dette formål viser denne studien hvordan man kombinerer en kirurgisk prosedyre for administrering av lukket skalle TBI som ligner på det som tidligere er rapportert7,8, sammen med en kirurgisk prosedyre for implantasjon av et kranialvindu for nedstrøms intravital avbildning, som beskrevet av Goldey et al9. Spesielt er det ikke mulig å implantere et kranialvindu først og deretter utføre en TBI i samme region, da virkningen av vektfallet som induserer TBI sannsynligvis vil skade vinduet og forårsake uopprettelig skade på musen. Derfor ble denne protokollen designet for å administrere TBI og deretter implantere kranialvinduet direkte over slagstedet, alt innenfor samme kirurgiske økt. En fordel med å kombinere både TBI og kranialvinduimplantasjon i en enkelt kirurgisk økt er en reduksjon i antall ganger en mus blir utsatt for kirurgi. Videre tillater det en å overvåke den umiddelbare responsen (dvs. på tidsskalaen for timer) til TBI, i motsetning til å implantere vinduet ved en senere kirurgisk økt (dvs. innledende bildebehandling som starter på en tidsskala på dager etter TBI). Kranialvinduet og den intravitale bildebehandlingsplattformen gir også fordeler i forhold til overvåking av nevronproteiner ved konvensjonelle metoder som immunfarging av faste vev. For eksempel kreves færre mus for intravital avbildning, da samme mus kan studeres på flere tidspunkter, i motsetning til separate kohorter av mus som trengs for diskrete tidspunkter. Videre kan de samme nevronene overvåkes over tid, slik at man kan spore spesifikke biologiske eller patologiske hendelser i samme celle.
Som et bevis på konsept er det nevronspesifikke uttrykket av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under synapsinpromotoren demonstrert her10. Denne tilnærmingen kan utvides til 1) forskjellige hjernecelletyper ved å benytte andre celletypespesifikke promotorer, for eksempel myelinbasisk protein (MBP) promotor for oligodendrocytter og glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter for astrocytter11, 2) forskjellige målproteiner av interesse ved å fusjonere sine gener med EGFP-genet, og 3) co-uttrykke flere proteiner fusjonert til forskjellige fluoroforer. Her pakkes EGFP og uttrykkes via adenoassosiert virus (AAV) levering gjennom en intrakraniell injeksjon. En lukket hodeskalle TBI administreres ved hjelp av en vektdråpeanordning, etterfulgt av implantasjon av et kranialvindu. Visualisering av neuronal EGFP oppnås gjennom kranialvinduet, ved bruk av to-foton mikroskopi for å oppdage EGFP-fluorescens in vivo. Med to-foton laseren er det mulig å trenge dypere inn i kortikale vev med minimal fotodamage, noe som muliggjør gjentatt langsgående avbildning av de samme kortikale områdene i en individuell mus i dager og opp til måneder12,13,14,15. I sum har denne tilnærmingen til å kombinere en TBI-kirurgi med intravital bildebehandling som mål å fremme forståelsen av molekylære hendelser som bidrar til TBI-indusert sykdomspatologi16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man langsgående visualiserer uttrykket og lokaliseringen av et protein av interesse innenfor bestemte celletyper i et dyrs hjerne, ved eksponering for eksogene stimuli. Her vises administrering av en lukket hodeskalle traumatisk hjerneskade (TBI) og samtidig implantasjon av et kranialvindu for etterfølgende langsgående intravital avbildning hos mus. Mus injiseres intrakranielt med et adenoassosiert virus (AAV) som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en nevronspesifikk promotor. Etter 2 til 4 uker blir musene utsatt for en repeterende TBI ved hjelp av et vekttapsapparat over AAV-injeksjonsstedet. Innenfor samme kirurgiske økt blir musene implantert med en metallstolpe og deretter et glasskranialvindu over TBI-påvirkningsstedet. Ekspresjonen og cellulær lokalisering av EGFP undersøkes ved hjelp av et to-foton mikroskop i samme hjernegruppe utsatt for traumer i løpet av måneder.

Som bevis på konsept for denne protokollen ble virale partikler som uttrykker AAV-Syn1-EGFP injisert i hjernebarken hos mannlige TDP-43Q331K / Q331K-mus (C57BL/6J-bakgrunn)19 i en alder av 3 måneder. Det bemerkes at villtype C57BL/6J dyr også kan brukes, men denne studien ble utført i TDP-43 Q331K/ Q331K mus fordi laboratoriet er fokusert på nevrodegenerativ sykdomsforskning. TBI-operasjon ble utført 4 uker etter AAV-injeksjon. Innenfor samme kirurgiske omgivelser ble h...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Denne studien demonstrerer levering av en repeterende traumatisk hjerneskade på mus og samtidig implantasjon av et kranialvindu for etterfølgende intravital avbildning av en nevronuttrykt EGFP ved bruk av to-foton mikroskopi.

Intravital avbildning av fluorescerende proteinuttrykk hos mus med en lukket skalle traumatisk hjerneskade og kranialvindu ved bruk av et to-foton mikroskop

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Vår protokoll gir en måte å visualisere nevronresponsen på mekanisk stress i en levende mus, noe som kan gi direkte bevis på hvordan traumatisk hjerneskade påvirker hjernen. Denne teknikken kan overvåke målproteinet på samme hjerneplassering i samme dyr for både akutte og kroniske faser etter traumatisk hjerneskade. Genet av interesse og viruspromotoren kan endres tilsvarende for å studere andre proteiner i de spesifikke celletypene i hjernen.For å begynne, bruk oftalmisk salve til den bedøvede musens øyne. Fjern håret fra toppen av hodet ved å trimme med vanlig saks. Etter å ha etablert et 12 til 15 millimeter langt midtlinjesnitt, skjær huden over venstre og høyre hjernehalvdel av skallen ved hjelp av buet spissfjærsaks.Når skallen er utsatt, fjern periosteum ved å forsiktig gni den med den sterile bomullstippede applikatoren og skylle den med sterilt saltvann. Når skalleområdet er tørket, merk Traumatic Brain Injury, eller TBI, nedslagsstedet ved koordinatene 2,5 millimeter bakre for bregma og to millimeter lateralt fra sagittal sutur til høyre. Fjern musen raskt fra den stereotaksiske rammen og plasser hodet på bufferputen under TBI-enheten.Juster kollisjonsspissen etter det markerte nedslagsstedet. Løft metallkolonnen ved å trekke den tethered nylonstrengen 15 centimeter over musehodet, og slipp den deretter, slik at vekten faller fritt på transduserstangen, som er i kontakt med skalletoppen på TBI-stedet. Plasser den bedøvede musens hode på den stereotaksiske rammen som holdes under kirurgisk mikroskop.Bor forsiktig og sakte overflaten av skallen ved hjelp av en FG4-karbidbit med lav rotorhastighet for å fjerne gjenværende periosteum, og opprett en grov skalleoverflate slik at tannsementen binder seg sikkert med skallen. Bruk saltvann til å skylle og fjerne beinstøv fra skalleoverflaten. For å skille sidemusklene fra skallen, omtrent fem millimeter bakre for øyet, hvor suturen som forbinder parietal- og tidsskallen er plassert, sett forsiktig inn de fine lukkede spissene og beveg forsiktig de lukkede spissene i bakre retning til lambdoidsuturen.Separat laterale muskler på siden der kranialvinduimplantasjon vil oppstå. Vask bort rusk fra operasjonsstedet med saltvann og tørk området med gasbind. For å implantere hodestolpen, merk midtpunktet 2,5 millimeter bakre for bregma og 1,5 millimeter av sagittalsuturen på høyre halvkule ved hjelp av en markørpenn og en kirurgisk tykkelse.Deretter spores omkretsen av kraniotomien på den rene og tørre skallen. Løsne ørestangen og roter hodet, slik at kraniotomiplanet er helt horisontalt, og stram deretter ørestangen igjen. Bruk trepinnen på en bomullstippet applikator for å legge til to små dråper superlim på forsiden og baksiden av hodestolpen.Plasser titanhodestolpen over midten av kraniotomien, og juster den raskt for å hvile i samme plan der kranialvinduet skal implanteres. Påfør lett trykk til superlimet er tørket, noe som vanligvis tar omtrent 30 sekunder. Forbered dental sement i en forkjølt keramisk tallerken ved å blande grundig 300 milligram sementpulver, seks dråper QuickBase-væske og en dråpe katalysator.Påfør raskt en sjenerøs mengde dental sementblanding på utsiden av den sporede omkretsen og dekk enhver eksponert beinoverflate. Dekk imidlertid ikke til kraniotomiområdet. Slipp ørestangen og fest hodestolpen til metallrammen for å sikre at hodet er stabilt for presis boring langs den markerte kraniotomiomkretsen.For å utføre kraniotomien, bruk en kirurgisk tykkelse for å verifisere diameteren på den markerte sirkelen som vist før, og juster etter behov, slik at kranialvinduet passer godt inn i kraniotomien. Ved hjelp av en elektrisk tannbor, ets og tynn skallen langs utsiden av den merkede sirkelen ved hjelp av en FG4-karbidbit først, noe som skaper et spor for å tynne skallen. Skyll området med saltvann for å vaske bort beinstøvet.Fortsett å tynne skallen ved hjelp av en FG 1/4 karbidbit til skallen er papirtynn og gjennomsiktig. Stopp boringen med jevne mellomrom, og skyll hele området med sterilt saltvann igjen for å redusere oppvarmingen fra boret og for å vaske bort beinstøvet. Fullfør skalletynningen med en EF4-karbidbit, og fortsett å tynne og bore gjennom resten av skallen langs sporet.Sett en 0,5 millimeter fintippet tang gjennom det sprukne stedet, og løft beinklaffen forsiktig oppover uten å rykke inn den underliggende hjernen. Etter å ha fjernet beinklaffen, skyll kraniotomiområdet med saltvann. Bruk de buede tippede kirurgiske tangene, fjern forsiktig det synlige arachnoide stoffet.Bruk den kirurgiske tangen med rette tupp til å plukke opp det sterile glassvinduet med det tre millimeter store glassdekselet vendt ned. Plasser og juster glassvinduet over kraniotomiområdet for å sikre at vinduet kan passe godt til kraniotomikanten. Glassdekselet på fem millimeter er på toppen.Forbered tannsementen som vist tidligere, og vent ca. seks minutter til sementen blir deigaktig og tykk. Mens du venter på at sementen blir pastaaktig og tykk, må du bruke et tilstrekkelig trykk på vinduet gjennom en stereotaksisk manipulator for å kontrollere at skallen kan komme i kontakt med glassvinduet sikkert og tett. Bruk en justerbar presisjonsapplikatorbørste for å legge til en liten mengde sement langs vinduskanten for å forsegle glassvinduet med skallen.Vent ca. 10 minutter for å la sementen tørke helt, slipp deretter forsiktig ut og fjern manipulatoren over vinduet. Komplett ved å trimme tannsementen ved hjelp av tannboret med en FG4-karbidbit hvis overflødig sement dekker vinduet. Omtrent fire timer etter operasjonen ble det utført to-foton avbildning, hvor vaskulaturen på overfladisk nivå virket svart, og på det dype nivået på ca. 400 mikrometer ble EGFP-proteinuttrykk diffust fordelt gjennom hele cellekroppen.Én uke og fire måneder etter TBI ble vaskulaturmønsteret observert ved nullpunktet brukt som referanse for å lokalisere samme bildeområde. Vaskulaturmønsteret ligner på dag null. Tilsvarende ble EGFP-uttrykket detektert gjennom hele cellekroppen.Fluorescensintensiteten ved dag null og fire måneder var lik både på overfladisk og dypere nivå. Imidlertid var fluorescensintensiteten ved en uke lavere enn for dag null og fire måneder, muligens på grunn av translasjonsundertrykkelsen rapportert for andre TBI-modeller. Det er avgjørende å ta ytterste forsiktighet når du opererer kraniotomi trinn for å unngå å skade hjernevevet.Ikke få borespissen satt inn i hjernen. Ved hjelp av denne teknikken kan forskere visualisere forskjellige proteiner av interesse i samme celle langsgående over forskjellige faser etter TBI, og gi informasjon om lokalisering, uttrykk og oppløselighet av proteinet i pattedyrhjernen etter traumer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Intra Imaging av aksonal Interaksjoner med Microglia og makrofager i en mus Dorsal kolonne Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

En metode å påføre Stengt Leder traumatisk hjerneskade i<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging nevrale aktivitet i primære Somatosensory Cortex ved hjelp av Thy1-GCaMP6s transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Romanen In Vitro modell for Blast traumatisk hjerneskade

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effekter av Blast-indusert Biografiske filmer på trykksatt gnager midt Cerebral arterier

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...