Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Мы благодарим доктора Мигеля Сена-Эстевеса из Медицинской школы Чана Массачусетского университета за дарение вируса AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP и Дебру Кэмерон из Медицинской школы Чана Массачусетского университета за рисунок эскиза черепа мыши. Мы также благодарим нынешних и бывших сотрудников лабораторий Bosco, Schafer и Henninger за их предложения и поддержку. Эта работа финансировалась Министерством обороны (W81XWH202071/PRARP) для DAB, DS и NH.

Все протоколы, связанные с животными, были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Комитетом Национального исследовательского совета (США). Протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медиц...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

В этом исследовании инъекция AAV, введение ЧМТ и имплантация краниального окна были объединены для анализа продольной визуализации EGFP-меченных нейронов в коре головного мозга мыши (слои IV и V) для наблюдения за влиянием ЧМТ на нейроны коры головного мозга. В этом исследовании отмечается, ...

Черепно-мозговая травма (ЧМТ), которая может возникнуть в результате спортивных травм, столкновений транспортных средств и военных действий, является проблемой здравоохранения во всем мире. ЧМТ может привести к физиологическим, когнитивным и поведенческим нарушениям, а также к пожизненной инвалидности или смертности 1,2. Тяжесть ЧМТ можно классифицировать как легкую, умеренную и тяжелую, в подавляющем большинстве случаев это легкая ЧМТ (75%-90%)3. Все чаще признается, что ЧМТ, особенно повторяющиеся случаи ЧМТ, могут способствовать дегенерации нейронов и служить факторами риска развития ряда нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз (БАС), лобно-височную деменцию (ЛВД) и хроническую травматическую энцефалопатию (ХТЭ)4,5,6. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе нейродегенерации, вызванной ЧМТ, остаются неясными и, таким образом, представляют собой активную область исследований. Чтобы получить представление о том, как нейроны реагируют на ЧМТ и восстанавливаются после нее, в данной статье описан метод мониторинга флуоресцентно меченых белков, представляющих интерес, особенно внутри нейронов, с помощью продольной прижизненной визуализации у мышей после ЧМТ.
С этой целью в данном исследовании показано, как сочетать хирургическую процедуру для введения закрытой черепно-мозговой ЧМТ, аналогичную той, о которой сообщалось ранее7,8, с хирургической процедурой имплантации краниального окна для последующей прижизненной визуализации, как описано Goldey et al9. Примечательно, что невозможно сначала имплантировать краниальное окно, а затем выполнить ЧМТ в той же области, так как воздействие падения веса, которое вызывает ЧМТ, может повредить окно и нанести непоправимый вред мыши. Таким образом, этот протокол был разработан для проведения ЧМТ, а затем имплантации краниального окна непосредственно над местом удара, и все это в рамках одного хирургического сеанса. Преимуществом сочетания ЧМТ и имплантации краниального окна в одном хирургическом сеансе является сокращение количества операций, которые мышь подвергается хирургическому вмешательству. Кроме того, это позволяет отслеживать немедленный ответ (т.е. в течение нескольких часов) на ЧМТ, в отличие от имплантации окна на более позднем хирургическом сеансе (т.е. первичная визуализация, начинающаяся в течение нескольких дней после ЧМТ). Краниальное окно и платформа прижизненной визуализации также имеют преимущества по сравнению с мониторингом белков нейронов традиционными методами, такими как иммуноокрашивание фиксированных тканей. Например, для прижизненной визуализации требуется меньшее количество мышей, так как одна и та же мышь может быть изучена в несколько временных точек, в отличие от отдельных когорт мышей, необходимых для дискретных моментов времени. Кроме того, одни и те же нейроны могут контролироваться с течением времени, что позволяет отслеживать конкретные биологические или патологические события в одной и той же клетке.
В качестве доказательства концепции здесь демонстрируется нейрон-специфическая экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под промотором синапсина10. Этот подход может быть распространен на: 1) различные типы клеток головного мозга путем использования других специфических промоторов клеточного типа, таких как промотор основного белка миелина (MBP) для олигодендроцитов и промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для астроцитов11, 2) различные белки-мишени, представляющие интерес, путем слияния их генов с геном EGFP, и 3) коэкспрессия нескольких белков, объединенных с различными флуорофорами. Здесь EGFP упаковывается и экспрессируется путем доставки аденоассоциированного вируса (AAV) через внутричерепную инъекцию. ЧМТ с закрытым черепом проводится с помощью устройства для снижения веса с последующей имплантацией краниального окна. Визуализация нейронального EGFP достигается через краниальное окно с помощью двухфотонной микроскопии для обнаружения флуоресценции EGFP in vivo. С помощью двухфотонного лазера можно проникнуть глубже в кортикальную ткань с минимальным фотоповреждением, что позволяет проводить повторную продольную визуализацию одних и тех же областей коры у отдельной мыши в течение нескольких дней и месяцев12,13,14,15. Таким образом, этот подход, сочетающий операцию ЧМТ с прижизненной визуализацией, направлен на углубление понимания молекулярных событий, которые способствуют патологии, вызванной ЧМТ16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Целью этого протокола является демонстрация того, как лонгитюдно визуализировать экспрессию и локализацию интересующего белка в определенных типах клеток мозга животного при воздействии экзогенных стимулов. Здесь показано введение закрытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и одновременная имплантация краниального окна для последующей продольной прижизненной визуализации у мышей. Мышам внутричерепно вводят аденоассоциированный вирус (AAV), экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) под действием нейронно-специфического промотора. Через 2-4 недели мышей подвергают повторной ЧМТ с использованием устройства для сброса веса над местом инъекции AAV. Во время одного хирургического сеанса мышам имплантируют металлический подголовник, а затем стеклянное краниальное окно над местом удара ЧМТ. Экспрессия и клеточная локализация EGFP исследуется с помощью двухфотонного микроскопа в одной и той же области мозга, подвергшейся травме в течение нескольких месяцев.

В качестве доказательства концепции этого протокола вирусные частицы, экспрессирующие AAV-Syn1-EGFP, были введены в кору головного мозга самцов мышей TDP-43Q331K/Q331K (C57BL/6J фон)19 в возрасте 3 месяцев. Отмечается, что животные дикого типа C57BL/6J также могут быть использованы, однако ?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Это исследование демонстрирует доставку повторяющейся черепно-мозговой травмы мышам и одновременную имплантацию краниального окна для последующей прижизненной визуализации нейрон-экспрессируемого EGFP с помощью двухфотонной микроскопии.

Прижизненная визуализация экспрессии флуоресцентных белков у мышей с закрытой черепно-мозговой травмой и краниальным окном с использованием двухфотонного микроскопа

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Наш протокол позволяет визуализировать реакцию нейронов на механический стресс у живой мыши, что может предоставить прямое доказательство того, как черепно-мозговая травма влияет на мозг. Этот метод позволяет контролировать целевой белок в одном и том же месте мозга у одного и того же животного как в острой, так и в хронической фазе после черепно-мозговой травмы. Интересующий нас ген и промотор вируса могут быть изменены соответствующим образом для изучения других белков в конкретных типах клеток головного мозга.Для начала нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши, находящейся под наркозом. Удалите волосы с макушки путем подравнивания обычными ножницами. После создания разреза по средней линии длиной от 12 до 15 миллиметров иссеките кожу над левым и правым полушариями черепа с помощью пружинных ножниц с изогнутым кончиком.После того, как череп обнажен, удалите надкостницу, осторожно потерев ее стерильным аппликатором с ватным наконечником и промыв стерильным физиологическим раствором. После того, как область черепа высохнет, отметьте место черепно-мозговой травмы (ЧМТ) в координатах 2,5 миллиметра позади брегмы и на два миллиметра латеральнее сагиттального шва справа. Быстро извлеките мышь из стереотаксической рамки и поместите голову на буферную подушку под устройством ЧМТ.Совместите наконечник ударника с отмеченным местом удара. Поднимите металлическую колонку, потянув за привязанную нейлоновую веревку на 15 сантиметров выше головы мыши, а затем отпустите ее, позволив весу свободно упасть на стержень датчика, который соприкасается с верхней частью черепа в месте ЧМТ. Поместите голову мыши, находящейся под наркозом, на стереотаксическую рамку, находящуюся под операционным микроскопом.Осторожно и медленно просверлите поверхность черепа твердосплавным сверлом FG4 на низкой скорости вращения ротора, чтобы удалить оставшуюся надкостницу и создать шероховатую поверхность черепа, чтобы стоматологический цемент надежно сцепился с черепом. Используйте физиологический раствор, чтобы смыть и очистить поверхность черепа от костной пыли. Чтобы отделить боковые мышцы от черепа, примерно на пять миллиметров позади глаза, где расположен шов, соединяющий теменный и височный череп, осторожно введите тонкие закрытые кончики и осторожно сдвиньте закрытые кончики в заднем направлении до лямбдовидного шва.Отделите боковые мышцы на той стороне, где будет происходить имплантация краниального окна. Смойте мусор с места операции с помощью физиологического раствора и высушите область марлей. Чтобы имплантировать штифт головы, отметьте центральную точку на расстоянии 2,5 миллиметра позади брегмы и на расстоянии 1,5 миллиметра от сагиттального шва на правом полушарии с помощью маркера и хирургического штангенциркуля.Затем обведите окружность трепанации черепа на чистом и сухом черепе. Ослабьте амбушюру и поверните головку так, чтобы плоскость трепанации черепа была идеально горизонтальной, а затем снова затяните ушную планку. Используйте деревянную палочку аппликатора с хлопчатобумажным наконечником, чтобы добавить две небольшие капли суперклея на передний и задний края стойки для головы.Расположите титановый головной штифт над центром трепанации черепа и быстро отрегулируйте его так, чтобы он находился в той же плоскости, где будет имплантировано краниальное окно. Слегка надавливайте до тех пор, пока суперклей не высохнет, что обычно занимает около 30 секунд. Приготовьте стоматологический цемент в предварительно охлажденной керамической посуде, тщательно смешав 300 миллиграммов цементного порошка, шесть капель жидкости QuickBase и одну каплю катализатора.Быстро нанесите большое количество стоматологической цементной смеси на внешний периметр обведенной окружности и покройте любую открытую поверхность кости. Однако не закрывайте место трепанации черепа. Отпустите амбушюру и закрепите головной штырь на металлической раме, чтобы обеспечить устойчивость головки для точного сверления по отмеченной окружности краниотомии.Чтобы выполнить трепанацию черепа, используйте хирургический штангенциркуль, чтобы проверить диаметр отмеченного круга, как показано выше, и при необходимости отрегулируйте его так, чтобы краниальное окно плотно прилегало к краниотомии. С помощью электрической бормашины вытравите и утончите череп вдоль внешней стороны отмеченного круга с помощью твердосплавной коронки FG4, которая создает дорожку, в пределах которой следует проредить череп. Орошайте участок физиологическим раствором, чтобы смыть костную пыль.Продолжайте прореживать череп твердосплавным сверлом FG 1/4 до тех пор, пока череп не станет тонким и прозрачным. Периодически прекращайте сверление и снова орошайте всю область стерильным физиологическим раствором, чтобы уменьшить нагрев от дрели и смыть костную пыль. Завершите истончение черепа с помощью твердосплавной коронки EF4 и продолжайте утончение и сверление остальной части черепа вдоль дорожки.Введите 0,5-миллиметровые щипцы с тонким наконечником через трещину и осторожно приподнимите костный лоскут вверх, не вдавливая в нижележащий мозг. После удаления костного лоскута орошите область краниотомии физиологическим раствором. С помощью хирургических щипцов с изогнутым наконечником аккуратно удалите видимое паутинное вещество.Используйте хирургические щипцы с прямым наконечником, чтобы взять стерильное стеклянное окно с трехмиллиметровой стеклянной крышкой вниз. Разместите и отрегулируйте стеклянное окно над местом трепанации черепа, чтобы убедиться, что окно плотно прилегает к краю краниотомии. Пятимиллиметровая стеклянная крышка находится сверху.Приготовьте стоматологический цемент, как показано ранее, и подождите примерно шесть минут, пока цемент не станет пастообразным и густым. Ожидая, пока цемент станет пастообразным и густым, приложите достаточное давление к окну через стереотаксический манипулятор, чтобы убедиться, что череп может надежно и плотно соприкасаться со стеклянным окном. Используйте регулируемую точную кисть-аппликатор, чтобы добавить небольшое количество цемента вдоль края окна, чтобы закрыть стеклянное окно с черепом.Подождите примерно 10 минут, чтобы цемент полностью высох, затем осторожно отпустите и снимите манипулятор над окном. Завершите обрезкой стоматологического цемента с помощью стоматологической бормашины с твердосплавным сверлом FG4, если излишки цемента покрывают окно. Примерно через четыре часа после операции была проведена двухфотонная визуализация, где на поверхностном уровне сосудистая сеть казалась черной, а на глубоком уровне примерно 400 микрометров экспрессия белка EGFP была диффузно распределена по всему телу клетки.Через одну неделю и четыре месяца после ЧМТ в качестве эталона для определения местоположения той же области визуализации использовался паттерн сосудистой сети, наблюдаемый в нулевой момент времени. Сосудистая сеть аналогична той, что была на нулевой день. Аналогичным образом, экспрессия EGFP была обнаружена по всему телу клетки.Интенсивность флуоресценции на нулевой день и через четыре месяца была одинаковой как на поверхностном, так и на более глубоком уровнях. Тем не менее, интенсивность флуоресценции через одну неделю была ниже, чем на нулевой день и четыре месяца, возможно, из-за трансляционной репрессии, о которой сообщалось для других моделей ЧМТ. Очень важно соблюдать максимальную осторожность при проведении этапа трепанации черепа, чтобы не повредить ткани головного мозга.Не вставляйте наконечник сверла в мозг. Используя этот метод, исследователи могут визуализировать различные интересующие белки в одной и той же клетке в продольном направлении через разные фазы после ЧМТ, предоставляя информацию о локализации, экспрессии и растворимости этого белка в мозге млекопитающих после травмы.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Прижизненные микроскопия микроциркуляции мозга мыши, используя Закрытая черепно Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Боковые ударные жидкости: Модель черепно-мозговой травмой у мышей

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Прижизненной визуализации аксонов Взаимодействие с микроглии и макрофагов у мышей Спинной колонки Давка травмы

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Метод Нанесение Закрытое Глава травматическое повреждение мозга в<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Роман в Vitro модель взрыва черепно-мозговой травмы

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Последствия взрыва индуцированной нейротравма под давлением грызунов средней мозговой артерии

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...