Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Vi tackar Dr. Miguel Sena-Esteves vid University of Massachusetts Chan Medical School för att ha gett bort AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-viruset, och Debra Cameron vid University of Massachusetts Chan Medical School för att ha ritat skissen med mössskallen. Vi tackar också nuvarande och tidigare medlemmar i Bosco-, Schafer- och Henninger-laboratorierna för deras förslag och stöd. Detta arbete finansierades av försvarsdepartementet (W81XWH202071/PRARP) till DAB, DS och NH.

Alla djurrelaterade protokoll genomfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicerad av National Research Council (US) Committee. Protokollen godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (tillståndsnummer 202100057). I korthet, som visas i schemat för studien (figur 1), får djuret en virusinjektion, en TBI, en fönsterimplantation och sedan intravital avbildning i en tidssekvens.
<...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

I denna studie kombinerades AAV-injektion, TBI-administrering och en huvudstolpe med kraniell fönsterimplantation för longitudinell avbildningsanalys av EGFP-märkta neuroner i mushjärnbarken (lager IV och V) för att observera effekterna av TBI på kortikala neuroner. Denna studie noterar att den TBI-plats som valts här, ovanför hippocampus, ger en relativt plan och bred yta för implantation av kranialfönstret. Omvänt är skallen relativt smal framför detta ställe, och därför är det svårt att säkerställa...

Traumatisk hjärnskada (TBI), som kan uppstå till följd av idrottsskador, fordonskollisioner och militära strider, är ett globalt hälsoproblem. TBI kan leda till fysiologiska, kognitiva och beteendemässiga brister och livslång funktionsnedsättning eller dödlighet 1,2. TBI:s svårighetsgrad kan klassificeras som mild, måttlig och svår, de allra flesta är mild TBI (75–90 %)3. Det blir alltmer erkänt att TBI, särskilt upprepade förekomster av TBI, kan främja neuronal degeneration och fungera som riskfaktorer för flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateralskleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och kronisk traumatisk encefalopati (CTE)4,5,6. De molekylära mekanismerna bakom TBI-inducerad neurodegeneration är dock fortfarande oklara, och utgör därför ett aktivt studieområde. För att få insikt i hur nervceller svarar på och återhämtar sig från TBI beskrivs här en metod för att övervaka fluorescerande märkta proteiner av intresse, särskilt inom nervceller, genom longitudinell intravital avbildning hos möss efter TBI.
För detta ändamål visar denna studie hur man kan kombinera ett kirurgiskt ingrepp för administrering av TBI med sluten skalle som liknar det som har rapporterats tidigare7,8, tillsammans med ett kirurgiskt ingrepp för implantation av ett kranialfönster för intravital avbildning nedströms, som beskrivs av Goldey et al9. Det är inte möjligt att implantera ett kranialfönster först och därefter utföra en TBI i samma region, eftersom effekten av viktnedgången som inducerar TBI sannolikt kommer att skada fönstret och orsaka irreparabel skada på musen. Därför utformades detta protokoll för att administrera TBI och sedan implantera kranialfönstret direkt över nedslagsstället, allt inom samma kirurgiska session. En fördel med att kombinera både TBI och kranialfönsterimplantation i en enda kirurgisk session är en minskning av antalet gånger en mus utsätts för operation. Dessutom gör det det möjligt att övervaka det omedelbara svaret (dvs. på tidsskalan av timmar) på TBI, i motsats till att implantera fönstret vid en senare kirurgisk session (dvs. initial avbildning som börjar på en tidsskala på dagar efter TBI). Det kraniala fönstret och den intravitala avbildningsplattformen erbjuder också fördelar jämfört med övervakning av neuronala proteiner med konventionella metoder som immunfärgning av fixerade vävnader. Till exempel krävs färre möss för intravital avbildning, eftersom samma mus kan studeras vid flera tidpunkter, i motsats till separata kohorter av möss som behövs för diskreta tidpunkter. Vidare kan samma neuroner övervakas över tid, vilket gör att man kan spåra specifika biologiska eller patologiska händelser inom samma cell.
Som ett proof of concept demonstreras det neuronspecifika uttrycket av förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under synapsinpromotorn här10. Detta tillvägagångssätt kan utvidgas till 1) olika typer av hjärnceller genom att använda andra celltypsspecifika promotorer, såsom myelinbasprotein (MBP) promotor för oligodendrocyter och gliafibrillärt surt protein (GFAP) promotor för astrocyter11, 2) olika målproteiner av intresse genom att smälta samman deras gener med EGFP-genen, och 3) samuttrycka flera proteiner sammansmälta till olika fluoroforer. Här förpackas EGFP och uttrycks via adenoassocierat virus (AAV) genom en intrakraniell injektion. En TBI med sluten skalle administreras med hjälp av en viktdroppsanordning, följt av implantation av ett kranialfönster. Visualisering av neuronal EGFP uppnås genom kranialfönstret, med hjälp av tvåfotonmikroskopi för att detektera EGFP-fluorescens in vivo. Med tvåfotonlasern är det möjligt att tränga djupare in i den kortikala vävnaden med minimal fotoskada, vilket möjliggör upprepad longitudinell avbildning av samma kortikala regioner inom en enskild mus i dagar och upp till månader12,13,14,15. Sammanfattningsvis syftar detta tillvägagångssätt att kombinera en TBI-operation med intravital avbildning till att öka förståelsen för de molekylära händelser som bidrar till TBI-inducerad sjukdomspatologi16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Målet med detta protokoll är att visa hur man longitudinellt visualiserar uttrycket och lokaliseringen av ett protein av intresse inom specifika celltyper i ett djurs hjärna, vid exponering för exogena stimuli. Här visas administrering av en traumatisk hjärnskada (TBI) och samtidig implantation av ett kranialfönster för efterföljande longitudinell intravital avbildning i möss. Möss injiceras intrakraniellt med ett adenoassocierat virus (AAV) som uttrycker förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under en neuronal specifik promotor. Efter 2 till 4 veckor utsätts mössen för en upprepad TBI med hjälp av en viktminskningsanordning över AAV-injektionsstället. Under samma kirurgiska session implanteras mössen med en huvudstolpe av metall och sedan ett kranialfönster av glas över det plats där TBI slår in. Uttrycket och den cellulära lokaliseringen av EGFP undersöks med hjälp av ett tvåfotonmikroskop i samma hjärnregion som utsatts för trauma under loppet av månader.

Som proof of concept för detta protokoll injicerades viruspartiklar som uttryckte AAV-Syn1-EGFP i hjärnbarken hos hanmöss av typen TDP-43 Q331K/Q331K (C57BL/6J bakgrund)19 vid 3 månaders ålder. Det noteras att vildtypsdjur av C57BL/6J också kan användas, men denna studie utfördes på TDP-43 Q331K/Q331K-möss eftersom laboratoriet är inriktat på forskning om neurodegenerativa sjukdomar. En TBI-operation utfördes 4 veckor efter AAV-injektionen. I samma kirurgiska mil...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Denna studie visar leverans av en repetitiv traumatisk hjärnskada till möss och samtidig implantation av ett kranialfönster för efterföljande intravital avbildning av en neuron-uttryckt EGFP med hjälp av tvåfotonmikroskopi.

Intravital avbildning av fluorescerande proteinuttryck hos möss med en traumatisk hjärnskada med stängd skalle och kranialfönster med hjälp av ett tvåfotonmikroskop

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Vårt protokoll ger ett sätt att visualisera det neuronala svaret på mekanisk stress hos en levande mus, vilket kan ge direkta bevis på hur traumatisk hjärnskada påverkar hjärnan. Denna teknik kan övervaka målproteinet på samma hjärnplats i samma djur för både de akuta och kroniska faserna efter traumatisk hjärnskada. Genen och viruspromotorn kan ändras för att studera andra proteiner i de specifika celltyperna i hjärnan.Börja med att applicera ögonsalva på den sövda musens ögon. Ta bort håret från toppen av huvudet genom att trimma med en vanlig sax. Efter att ha etablerat ett 12 till 15 millimeter långt snitt i mittlinjen, skär huden över vänster och höger hjärnhalva av skallen med hjälp av en böjd spetsfjädersax.När skallen är exponerad, ta bort benhinnan genom att försiktigt gnugga den med den sterila applikatorn med bomullsspets och spola den med steril koksaltlösning. När skallområdet har torkat, markera nedslagsplatsen för traumatisk hjärnskada, eller TBI, vid koordinaterna 2,5 millimeter bakom bregman och två millimeter lateralt från den sagittala suturen till höger. Ta snabbt bort musen från den stereotaktiska ramen och placera huvudet på buffertkudden under TBI-enheten.Rikta in provkroppens spets mot det markerade islagsstället. Lyft metallpelaren genom att dra i den bundna nylonsträngen 15 centimeter ovanför mushuvudet och släpp den sedan, så att vikten kan falla fritt på givarstången, som är i kontakt med skallens topp på TBI-platsen. Placera det sövda mushuvudet på den stereotaktiska ramen som hålls under det kirurgiska mikroskopet.Borra försiktigt och långsamt skallens yta med en FG4-hårdmetallborrkrona med låg rotorhastighet för att ta bort det återstående benhinnan och skapa en grov skallyta så att tandcementet binder säkert till skallen. Använd koksaltlösning för att spola och rensa bort bendamm från skallens yta. För att separera de laterala musklerna från skallen, cirka fem millimeter bakom ögat, där suturen som förbinder parietal- och temporalskallen är belägen, för försiktigt in de fina stängda spetsarna och flytta försiktigt de stängda spetsarna i den bakre riktningen tills lambdoid sutur.Separera de laterala musklerna på den sida där kranialfönsterimplantation kommer att ske. Tvätta bort skräpet från operationsområdet med koksaltlösning och torka området med gasbinda. För att implantera huvudstolpen, markera mittpunkten 2.5 millimeter bakom bregma och 1.5 millimeter från sagittalsuturen på höger halvklot med en markeringspenna och ett kirurgiskt skjutmått.Spåra sedan kraniotomins omkrets på den rena och torra skallen. Lossa öronbågen och vrid huvudet så att kraniotomiplanet är helt horisontellt och dra sedan åt öronbågen igen. Använd träpinnen på en bomullsapplikator för att lägga till två små droppar superlim på fram- och bakkanten av huvudstolpen.Placera huvudstolpen av titan över mitten av kraniotomin och justera den snabbt så att den vilar inom samma plan där kranialfönstret kommer att implanteras. Applicera lätt tryck tills superlimmet har torkat, vilket vanligtvis tar cirka 30 sekunder. Förbered tandcement i en förkyld keramisk skål genom att noggrant blanda 300 milligram cementpulver, sex droppar QuickBase-vätska och en droppe katalysator.Applicera snabbt en generös mängd tandcementblandning på utsidan av den spårade omkretsen och täck alla exponerade benytor. Täck dock inte över platsen för kraniotomin. Lossa öronstången och fäst huvudstolpen på metallramen för att säkerställa att huvudet är stabilt för exakt borrning längs den markerade kraniotomomkretsen.För att utföra kraniotomin, använd ett kirurgiskt skjutmått för att verifiera diametern på den markerade cirkeln som visats tidigare, och justera vid behov, så att kranialfönstret passar tätt inuti kraniotomin. Använd en elektrisk tandborr för att etsa och tunna ut skallen längs utsidan av den markerade cirkeln med hjälp av en FG4-hårdmetallborr först, vilket skapar ett spår inom vilket skallen kan tunnas ut. Skölj området med koksaltlösning för att tvätta bort bendammet.Fortsätt att tunna ut skallen med ett FG 1/4 hårdmetallbett tills skallen är papperstunn och genomskinlig. Sluta borra med jämna mellanrum och skölj hela området med steril koksaltlösning igen för att minska uppvärmningen från borren och för att tvätta bort bendammet. Slutför skallförtunningen med en EF4-hårdmetallborrkrona och fortsätt att tunna ut och borra genom resten av skallen längs spåret.För in en 0,5 millimeter finspetsad pincett genom det spruckna stället och lyft benfliken försiktigt uppåt utan att trycka in den underliggande hjärnan. Efter att ha tagit bort benfliken, skölj kraniotomiområdet med koksaltlösning. Använd den böjda kirurgiska pincetten och ta försiktigt bort det synliga spindelmaterialet.Använd den raka kirurgiska pincetten för att plocka upp det sterila glasfönstret med den tre millimeter stora glasluckan nedåt. Placera och justera glasfönstret ovanför kraniotomistället för att se till att fönstret kan passa tätt mot kraniotomikanten. Täckglaset på fem millimeter ligger ovanpå.Bered tandcementet som visats tidigare och vänta cirka sex minuter tills cementet blir degigt och tjockt. Medan du väntar på att cementen ska bli klibbig och tjock, applicera ett tillräckligt tryck på fönstret genom en stereotaktisk manipulator för att kontrollera att skallen säkert och tätt kan komma i kontakt med glasfönstret. Använd en justerbar precisionsapplikatorborste för att lägga till en liten mängd cement längs fönsterkanten för att försegla glasfönstret med dödskallen.Vänta cirka 10 minuter för att låta cementen torka helt, släpp sedan försiktigt och ta bort manipulatorn ovanför fönstret. Komplettera genom att trimma tandcementet med hjälp av tandborren med en FG4-hårdmetallbit om överflödig cement täcker fönstret. Cirka fyra timmar efter operationen utfördes tvåfotonavbildning, där kärlen på ytlig nivå såg svarta ut och EGFP-proteinuttrycket var diffust fördelat i hela cellkroppen på den ytliga nivån.En vecka och fyra månader efter TBI användes det kärlmönster som observerades vid tidpunkten dag noll som referens för att lokalisera samma bildregion. Kärlmönstret liknar det vid dag noll. På samma sätt detekterades EGFP-uttrycket i hela cellkroppen.Fluorescensintensiteten vid dag noll och fyra månader var likartad på både ytlig och djupare nivå. Fluorescensintensiteten efter en vecka var dock lägre än vid dag noll och fyra månader, möjligen på grund av den translationella repression som rapporterats för andra TBI-modeller. Det är viktigt att vara ytterst försiktig när man utför kraniotomisteget för att undvika att skada hjärnvävnaden.Sätt inte in borrspetsen i hjärnan. Med hjälp av denna teknik kan forskare visualisera olika proteiner av intresse i samma cell longitudinellt över olika faser efter TBI, vilket ger information om lokalisering, uttryck och löslighet av det proteinet i däggdjurshjärnan efter trauma.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

En tunn-skalle Fönster Teknik för kronisk två-photon In vivo Imaging av murina mikroglia i modeller av Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravital Mikroskopi av Mouse Brain Mikrocirkulationen hjälp av ett slutet Kraniell fönster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid slagverk: Modell av traumatisk hjärnskada hos möss

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Intravital avbildning av axonal Interaktioner med mikroglia och makrofager i en mus Dorsal Kolumn krosskada

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

En metod för att tillfoga Stängd Head traumatisk hjärnskada i<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural aktivitet i den primära somatosensoriska Cortex med Thy1-GCaMP6s transgena möss

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

En roman In Vitro modell av Blast traumatisk hjärnskada

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effekter av Blast-inducerad Neurotrauma på trycksatt gnagare mellersta cerebrala artärer

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...