Name: intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'nden Dr. Miguel Sena-Esteves'e AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP virüsünü hediye ettiği için ve Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'nden Debra Cameron'a farelerin kafatası taslağını çizdiği için teşekkür ederiz. Ayrıca Bosco, Schafer ve Henninger laboratuvarlarının mevcut ve geçmiş üyelerine önerileri ve destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı (W81XWH202071/PRARP) tarafından DAB, DS ve NH'ye finanse edildi.

Hayvanlarla ilgili tüm protokoller, Ulusal Araştırma Konseyi (ABD) Komitesi tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Protokoller, Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi (UMMS) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (İzin Numarası 202100057). Kısaca, çalışma şemasında gösterildiği gibi (Şekil 1), hayvana bir virüs enjeksiyonu, bir TBI, bir pencere implant...

<ol>
	<li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research:+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences,+Engineering,+and+Medicine.">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li><li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes.">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+NINDS/NIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy.">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li><li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1.">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li><li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury.">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins:+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors.">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li><li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain.">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice.">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060 (2021).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature.">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li><li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD.">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li><li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li><li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice.">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).</li><li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II:+Morphological+characterization.">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device.">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Through-Intact-Skull+(TIS)+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice.">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li><li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging.">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).</li><li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury:+A+case+report.">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601 (2020).</li><li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain;+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations.">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li><li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrecoup-coup+phenomenon:+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury.">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li></ol>

Bu çalışmada, TBH'nin kortikal nöronlar üzerindeki etkilerini gözlemlemek için fare beyin korteksi (katman IV ve V) içindeki EGFP etiketli nöronların uzunlamasına görüntüleme analizi için AAV enjeksiyonu, TBI uygulaması ve kraniyal pencere implantasyonu olan bir başlık birleştirildi. Bu çalışma, burada seçilen TBI bölgesinin, hipokampusun üstünde, kraniyal pencerenin implantasyonu için nispeten düz ve geniş bir yüzey sağladığını belirtmektedir. Tersine, kafatası bu bölgenin önünde n...

Spor yaralanmaları, araç çarpışmaları ve askeri savaştan kaynaklanabilen travmatik beyin hasarı (TBI), dünya çapında bir sağlık sorunudur. TBH fizyolojik, bilişsel ve davranışsal eksikliklere ve yaşam boyu sakatlık veya mortaliteye yol açabilir 1,2. TBH şiddeti hafif, orta ve şiddetli olarak sınıflandırılabilir, büyük çoğunluğu hafif TBH'dir (%75-%90)3. TBH'nin, özellikle tekrarlayan TBH oluşumlarının, nöronal dejenerasyonu teşvik edebileceği ve Alzheimer hastalığı (AD), amyotrofik lateral skleroz (ALS), frontotemporal demans (FTD) ve kronik travmatik ensefalopati (CTE) dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için risk faktörleri olarak hizmet edebileceği giderek daha fazla kabul edilmektedir4,5,6. Bununla birlikte, TBH kaynaklı nörodejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve bu nedenle aktif bir çalışma alanını temsil etmektedir. Nöronların TBH'ye nasıl tepki verdiği ve TBH'den nasıl kurtulduğu hakkında fikir edinmek için, TBH'den sonra farelerde uzunlamasına intravital görüntüleme ile, özellikle nöronlar içinde, floresan etiketli proteinlerin izlenmesi için bir yöntem burada açıklanmaktadır.
Bu amaçla, bu çalışma, daha öncebildirilenlere benzer kapalı kafatası TBH'sinin uygulanması için cerrahi bir prosedürün nasıl birleştirileceğini göstermektedir 7,8 Goldey ve ark.9 tarafından tanımlandığı gibi, aşağı akış intravital görüntüleme için bir kraniyal pencerenin implantasyonu için cerrahi bir prosedür. Özellikle, TBI'yı indükleyen ağırlık düşüşünün etkisinin pencereye zarar vermesi ve fareye onarılamaz bir zarar vermesi muhtemel olduğundan, önce bir kraniyal pencere implante etmek ve ardından aynı bölgede bir TBI gerçekleştirmek mümkün değildir. Bu nedenle, bu protokol TBH'yi uygulamak ve daha sonra kraniyal pencereyi doğrudan etki bölgesine implante etmek için tasarlanmıştır. Hem TBI hem de kraniyal pencere implantasyonunu tek bir cerrahi seansta birleştirmenin bir avantajı, bir farenin ameliyata maruz kalma sayısındaki azalmadır. Ayrıca, pencereyi daha sonraki bir cerrahi seansta implante etmek yerine (yani, TBI sonrası günlerin zaman ölçeğinde başlayan ilk görüntüleme) TBI'ya anında yanıtı (yani, saatlerin zaman ölçeğinde) izlemesine izin verir. Kraniyal pencere ve intravital görüntüleme platformu, sabit dokuların immün boyanması gibi geleneksel yöntemlerle nöronal proteinlerin izlenmesine göre de avantajlar sunar. Örneğin, intravital görüntüleme için daha az fare gerekir, çünkü aynı fare, ayrı zaman noktaları için gereken ayrı fare kohortlarının aksine, birden fazla zaman noktasında incelenebilir. Ayrıca, aynı nöronlar zaman içinde izlenebilir ve aynı hücre içindeki belirli biyolojik veya patolojik olayların izlenmesine izin verilir.
Kavramın bir kanıtı olarak, sinapsin promotörü altında gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) nörona özgü ekspresyonu burada gösterilmiştir10. Bu yaklaşım, 1) oligodendrositler için miyelin bazik protein (MBP) promotörü ve astrositler için glial fibriler asidik protein (GFAP) promotörü gibi diğer hücre tipine özgü promotörleri kullanarak farklı beyin hücresi tiplerine genişletilebilir11, 2) genlerini EGFP geni ile kaynaştırarak ilgilenilen farklı hedef proteinler ve 3) farklı floroforlara kaynaşmış çoklu proteinleri birlikte eksprese etmek. Burada EGFP, intrakraniyal enjeksiyon yoluyla adeno-ilişkili virüs (AAV) iletimi yoluyla paketlenir ve eksprese edilir. Kapalı bir kafatası TBI, bir ağırlık düşürme cihazı kullanılarak uygulanır ve ardından bir kraniyal pencerenin implantasyonu yapılır. Nöronal EGFP'nin görselleştirilmesi, in vivo EGFP floresansını tespit etmek için iki foton mikroskobu kullanılarak kraniyal pencereden elde edilir. İki fotonlu lazer ile, minimum foto hasarı ile kortikal dokuya daha derine nüfuz etmek mümkündür, bu da tek bir fare içinde aynı kortikal bölgelerin günlerce veaylara kadar tekrarlanan uzunlamasına görüntülenmesine izin verir 12,13,14,15. Özetle, TBH cerrahisini intravital görüntüleme ile birleştiren bu yaklaşım, TBH'nin neden olduğu hastalık patolojisine katkıda bulunan moleküler olayların anlaşılmasını ilerletmeyi amaçlamaktadır16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>NDC/HRI#08290-3284-38</td>
			<td>5/16&#34; x 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC67618-151-17</td>
			<td>including 7.5% povidone iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>PAR Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>HIKMA Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 0143-9924-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Mixing Dish</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>SKU: S387</td>
			<td>For dental cement preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G9531702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S371</td>
			<td>full name: &#34;C&#34; Universal TBB Catalyst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement powder</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S396</td>
			<td>Radiopaque L-Powder for C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>H.MH-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill controller</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>HP4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150113</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethonal</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04355223EA</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG1/4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150413</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG4 carbide bit</td>
			<td>Microcopy</td>
			<td>Lot# C150309</td>
			<td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headpost</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating apparatus</td>
			<td>CWE</td>
			<td>TC-1000 Mouse</td>
			<td>equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating blanket</td>
			<td>CVS pharmacy</td>
			<td>E12107</td>
			<td>extra heating device and be used after surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>89012-688</td>
			<td>induction chamber for short</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane volatilizing machine holder</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>901801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA 10450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Picetal</td>
			<td>NDC 46066-753-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>SMP-BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump and its controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>micro4 and UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Hamilton 80014</td>
			<td>1701 RN, 10 &#956;L gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #:625314</td>
			<td>Stainless Steel, Curved, 5 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory agent</td>
			<td>McKesson Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nair Hair Aloe &#38; Lanolin Hair Removal Lotion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon microscope for cranial window preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7 MP</td>
			<td>two-photon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W</td>
			<td>laser for two-photon microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>catlog# 59-6860</td>
			<td>6-0, with round needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No-Snag Needle Holder</td>
			<td>CAROLINA</td>
			<td>Item #: 567912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick base liquid</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S398</td>
			<td>&#34;B&#34; Quick Base For C&#38;B Metabond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 1</td>
			<td>Eurostat</td>
			<td>eurostat es5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501759-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 1</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-5R Cat# 64-0700</td>
			<td>for 5 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 2</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>CS-3R Cat# 64-0720</td>
			<td>for 3 mm of diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber rings</td>
			<td>Orings-Online</td>
			<td>Item # OO-014-70-50</td>
			<td>O-Rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>L19102411PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 1</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91500-09</td>
			<td>tip straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 91501-09</td>
			<td>tip curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Item #: 1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical Caliper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>No. 501200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 1</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 2</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 0103-5-PO</td>
			<td>style 5, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 3</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>catlog# 72912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps 4</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>Catlog# 0508-5/45-PO</td>
			<td>style 5/45, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gauze</td>
			<td>ZORO</td>
			<td>catlog #: G0593801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica KL300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Spectrolinker</td>
			<td>XL-1000</td>
			<td>also called UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporguard</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M Animal Care</td>
			<td>Part Number:014006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope

Bu protokolün amacı, eksojen uyaranlara maruz kaldıktan sonra, bir hayvanın beyninin belirli hücre tipleri içinde ilgilenilen bir proteinin ekspresyonunun ve lokalizasyonunun uzunlamasına nasıl görselleştirileceğini göstermektir. Burada, kapalı kafatası travmatik beyin hasarının (TBI) uygulanması ve farelerde müteakip uzunlamasına intravital görüntüleme için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonu gösterilmektedir. Farelere intrakraniyal olarak, nöronal spesifik bir promotör altında gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) eksprese eden adeno-ilişkili bir virüs (AAV) enjekte edilir. 2 ila 4 hafta sonra, fareler, AAV enjeksiyon yeri üzerinde bir ağırlık düşürme cihazı kullanılarak tekrarlayan bir TBI'ya tabi tutulur. Aynı cerrahi seansta, farelere metal bir başlık ve daha sonra TBI etki bölgesi üzerine bir cam kraniyal pencere implante edilir. EGFP'nin ekspresyonu ve hücresel lokalizasyonu, aylar boyunca travmaya maruz kalan aynı beyin bölgesinde iki fotonlu bir mikroskop kullanılarak incelenir.

Bu protokol için kavram kanıtı olarak, AAV-Syn1-EGFP eksprese eden viral partiküller, 3 aylıkken erkek TDP-43 Q331K /Q331K farelerinin (C57BL / 6J arka planı) 19 beyin korteksine enjekte edildi. Yabani tip C57BL/6J hayvanların da kullanılabileceği belirtilmektedir, ancak bu çalışma TDP-43Q331K/Q331K farelerinde gerçekleştirilmiştir çünkü laboratuvar nörodejeneratif hastalık araştırmalarına odaklanmıştır. AAV enjeksiyonundan 4 hafta sonra TBI ameliyat...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope at Jo

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Protokolümüz, travmatik beyin hasarının beyni nasıl etkilediğine dair doğrudan kanıt sağlayabilen, canlı bir farede mekanik strese verilen nöronal tepkiyi görselleştirmenin bir yolunu sunar. Bu teknik, travmatik beyin hasarından sonra hem akut hem de kronik fazlar için aynı hayvanda aynı beyin bölgesinde hedef proteini izleyebilir. İlgilenilen gen ve virüs promotörü, beyindeki spesifik hücre tiplerindeki diğer proteinleri incelemek için buna göre değiştirilebilir.Başlamak için, anestezi uygulanmış farenin gözlerine oftalmik merhem sürün. Normal makasla keserek saçı başın üstünden çıkarın. 12 ila 15 milimetre uzunluğunda bir orta hat kesisi oluşturduktan sonra, kavisli uçlu yaylı makas kullanarak kafatasının sol ve sağ yarım küreleri üzerindeki cildi çıkarın.Kafatası açığa çıktığında, steril pamuk uçlu aplikatör ile hafifçe ovalayarak ve steril salinle yıkayarak periosteuumu çıkarın. Kafatası bölgesi kuruduktan sonra, Travmatik Beyin Hasarı veya TBI, darbe bölgesini bregmanın 2.5 milimetre posterior ve sagital sütürden sağa iki milimetre lateral koordinatlarda işaretleyin. Fareyi stereotaksik çerçeveden hızla çıkarın ve kafayı TBI cihazının altındaki tampon yastığına yerleştirin.Çarpma tertibatı ucunu işaretli çarpma alanıyla hizalayın. Bağlı naylon ipi fare kafasının 15 santimetre yukarısına çekerek metal sütunu kaldırın ve ardından serbest bırakın, ağırlığın TBI bölgesindeki kafatası tepesi ile temas halinde olan dönüştürücü çubuğun üzerine serbestçe düşmesine izin verin. Anestezi uygulanmış farenin kafasını cerrahi mikroskop altında tutulan stereotaksik çerçeveye yerleştirin.Kalan periosteuumu çıkarmak için düşük rotor hızında bir FG4 karbür uç kullanarak kafatasının yüzeyini nazikçe ve yavaşça delin ve diş çimentosu kafatasına güvenli bir şekilde bağlanacak şekilde pürüzlü bir kafatası yüzeyi oluşturun. Kafatası yüzeyindeki kemik tozunu temizlemek ve temizlemek için salin kullanın. Lateral kasları kafatasından ayırmak için, parietal ve temporal kafatasını birbirine bağlayan sütürün bulunduğu gözün yaklaşık beş milimetre arkasında, ince kapalı uçları nazikçe yerleştirin ve kapalı uçları lambdoid dikişe kadar yavaşça arka yönde hareket ettirin.Kraniyal pencere implantasyonunun gerçekleşeceği taraftaki yan kasları ayırın. Tuzlu su kullanarak ameliyat bölgesindeki kalıntıları yıkayın ve alanı gazlı bezle kurulayın. Baş direğini implante etmek için, bir işaretleyici kalem ve cerrahi bir kumpas kullanarak sağ hemisferde bregmanın 2,5 milimetre arkasında ve sagital sütürden 1,5 milimetre uzakta merkez noktasını işaretleyin.Sonra temiz ve kuru kafatası üzerinde kraniotominin çevresini izleyin. Kulak çubuğunu gevşetin ve kafayı döndürün, böylece kraniyotomi düzlemi tamamen yatay olur ve ardından kulak çubuğunu tekrar sıkın. Baş direğinin ön ve arka kenarına iki küçük damla süper yapıştırıcı eklemek için pamuk uçlu bir aplikatörün ahşap çubuğunu kullanın.Titanyum kafa direğini kraniotominin merkezine yerleştirin ve kraniyal pencerenin implante edileceği aynı düzlemde duracak şekilde hızlı bir şekilde ayarlayın. Süper yapıştırıcı kuruyana kadar hafif basınç uygulayın, bu genellikle yaklaşık 30 saniye sürer. 300 miligram çimento tozu, altı damla QuickBase sıvısı ve bir damla katalizörü iyice karıştırarak önceden soğutulmuş bir seramik kapta diş çimentosu hazırlayın.İzlenen çevrenin dış çevresine bol miktarda diş çimentosu karışımını hızlı bir şekilde uygulayın ve açıkta kalan kemik yüzeyini örtün. Bununla birlikte, kraniotomi bölgesini kapsamayın. İşaretli kraniyotomi çevresi boyunca hassas delme için başlığın sabit olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu serbest bırakın ve kafa direğini metal çerçeveye sabitleyin.Kraniyotomiyi gerçekleştirmek için, daha önce gösterildiği gibi işaretli dairenin çapını doğrulamak için cerrahi bir kumpas kullanın ve kraniyal pencerenin kraniotominin içine sıkıca oturması için gerektiği gibi ayarlayın. Elektrikli bir diş matkabı kullanarak, önce kafatasını inceltmek için bir iz oluşturan bir FG4 karbür ucu kullanarak kafatasını işaretli dairenin dışı boyunca aşındırın ve inceltin. Kemik tozunu temizlemek için alanı tuzlu suyla sulayın.Kafatası kağıt inceliğinde ve şeffaf olana kadar bir FG 1/4 karbür uç kullanarak kafatasını inceltmeye devam edin. Periyodik olarak, delmeyi durdurun ve matkaptan kaynaklanan ısınmayı azaltmak ve kemik tozunu yıkamak için tüm alanı tekrar steril tuzlu su ile sulayın. Bir EF4 karbür uç kullanarak kafatası inceltme işlemini tamamlayın ve iz boyunca kafatasının geri kalanını inceltmeye ve delmeye devam edin.Çatlak yerden 0,5 milimetre ince uçlu bir forseps sokun ve alttaki beyni girintilemeden kemik flebini hafifçe yukarı doğru kaldırın. Kemik flebini çıkardıktan sonra, kraniyotomi bölgesini tuzlu su ile yıkayın. Kavisli uçlu cerrahi forsepsleri kullanarak, görünür araknoid maddeyi nazikçe çıkarın.Üç milimetre cam kapak kayması aşağı bakacak şekilde steril cam pencereyi almak için düz uçlu cerrahi forseps kullanın. Pencerenin kraniyotomi kenarına tam olarak oturduğundan emin olmak için cam pencereyi kraniyotomi bölgesinin üzerine yerleştirin ve ayarlayın. Beş milimetrelik cam kapak kayma üstte.Diş çimentosunu daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve çimento macun kıvamına gelene ve kalınlaşana kadar yaklaşık altı dakika bekleyin. Çimentonun macun kıvamına gelmesini ve kalınlaşmasını beklerken, kafatasının cam pencereye güvenli ve sıkı bir şekilde temas edip etmediğini kontrol etmek için stereotaksik bir manipülatör aracılığıyla pencereye yeterli miktarda basınç uygulayın. Cam pencereyi kafatası ile kapatmak için pencere kenarının yanına az miktarda çimento eklemek için ayarlanabilir bir hassas aplikatör fırçası kullanın.Çimentonun tamamen kuruması için yaklaşık 10 dakika bekleyin, ardından yavaşça serbest bırakın ve manipülatörü pencerenin üzerinde çıkarın. Fazla çimento pencereyi kaplıyorsa, bir FG4 karbür uçlu diş matkabını kullanarak diş çimentosunu keserek tamamlayın. Ameliyattan yaklaşık dört saat sonra, yüzeysel düzeyde damar sisteminin siyah göründüğü ve yaklaşık 400 mikrometre derin seviyede, EGFP protein ekspresyonunun hücre gövdesi boyunca yaygın olarak dağıldığı iki foton görüntüleme gerçekleştirildi.TBH'den bir hafta ve dört ay sonra, sıfır zaman noktasında gözlemlenen vaskülatür paterni, aynı görüntüleme bölgesini bulmak için referans olarak kullanıldı. Damar sistemi paterni sıfırıncı gündekine benzer. Benzer şekilde, EGFP ekspresyonu hücre gövdesi boyunca tespit edildi.Sıfırıncı ve dört aydaki floresan yoğunluğu hem yüzeysel hem de daha derin seviyelerde benzerdi. Bununla birlikte, bir haftadaki floresan yoğunluğu, muhtemelen diğer TBI modelleri için bildirilen translasyonel baskıdan dolayı, sıfır ve dört aydan daha düşüktü. Beyin dokusuna zarar vermemek için kraniyotomi adımını çalıştırırken azami özen göstermek çok önemlidir.Matkap ucunu beyne sokmayın. Araştırmacılar bu tekniği kullanarak, TBI sonrası farklı fazlarda aynı hücrede ilgilenilen farklı proteinleri uzunlamasına görselleştirebilir ve bu proteinin travma sonrası memeli beynindeki lokalizasyonu, ekspresyonu ve çözünürlüğü hakkında bilgi sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Yanal Akışkan Perküsyon: Travmatik Beyin Hasarı Farelerde Modeli

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Kapalı Başkanı Travmatik Beyin yaralayabilecek Bir Yöntem<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Patlama travmatik beyin hasarı roman Vitro modeli

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Serebral arterler patlama kaynaklı Neurotrauma etkilerini basınçlı kemirgen orta

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...