Name: human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies at JoVE.com

ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم الخاص للمساعدة التقنية التي قدمها أوكسانا وجون غريناكر. تم دعم هذا العمل من قبل ACA CELL Biotech GmbH هايدلبرغ ، ألمانيا.

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) لإجراء هذه التجارب وتم توقيع الموافقة المستنيرة من قبل جميع المتبرعين قبل استخراج الدم وفقا للإرشادات المؤسسية.
1. تحضير الخلايا أحادية النواة (MNCs) من الدم المحيطي البشري (PB)
<ol><li>استخراج 30 مل من الدم من المتب?...

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620 (2019).</li><li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research.">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li><li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology.">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signalling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li><li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+for+studying+tumor+responses+to+anticancer+therapies.">Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies.</a> Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance.">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+stem+cells+into+liver.">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li><li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis.">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure.">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans.">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., Schott, A. K., Zipan&#269;i&#263;, I., Hern&#225;ndez-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells.">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+neural+stem+cells.">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).</li><li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-fetoprotein:+a+review.">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li><li>Magalh&#227;es, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transthyretin+in+cell+biology:+impact+on+human+pathophysiology.">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li><li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice.">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li><li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury.">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li><li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease.">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).</li><li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects:+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates.">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li><li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes.">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li><li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro.">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).</li></ol>

الكبد هو عضو رئيسي في جسم الإنسان له العديد من الوظائف البيولوجية الأساسية ، مثل إزالة السموم من الأيضات. بسبب فشل الكبد الحاد مثل تليف الكبد و / أو التهاب الكبد الفيروسي ، هناك ما يقرب من 2 مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. تحتل عمليات زرع الكبد المرتبة الثانية في عمليات زرع الأعض?...

في السنوات الأخيرة ، أصبحت أنظمة الاستزراع الكروي ثلاثية الأبعاد (3D) أداة مهمة لدراسة مختلف مجالات أبحاث السرطان واكتشاف الأدوية وعلم السموم. تثير هذه الثقافات اهتماما كبيرا لأنها تسد الفجوة بين أحاديات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) والأعضاء المعقدة1.
في حالة عدم وجود سطح لاصق ، مقارنة بثقافة الخلايا 2D ، يعتمد تكوين الكائنات الكروية على التقارب الطبيعي لهذه الخلايا للتجمع في شكل 3D. تنظم هذه الخلايا نفسها في مجموعات تتكون من نوع واحد أو أكثر من الخلايا الناضجة. خالية من المواد الغريبة ، تتفاعل هذه الخلايا مع بعضها البعض كما هو الحال في بيئتها المكروية الأصلية. الخلايا في ثقافة 3D أقرب بكثير ولها اتجاه مناسب تجاه بعضها البعض ، مع إنتاج مصفوفة خارج الخلية أعلى من الثقافات ثنائية الأبعاد ، وتشكل بيئة قريبة من البيئة الطبيعية 2.
تم استخدام النماذج الحيوانية لفترة طويلة لدراسة البيولوجيا البشرية والأمراض3. في هذا الصدد ، هناك اختلافات جوهرية بين البشر والحيوانات ، مما يجعل هذه النماذج غير مناسبة تماما للدراسات الاستقراءية. تمثل كرويات الثقافة ثلاثية الأبعاد والكائنات العضوية أداة واعدة لدراسة البنية الشبيهة بالأنسجة والتفاعل والحديث المتبادل بين أنواع الخلايا المختلفة التي تحدث في الجسم الحي ويمكن أن تساهم في تقليل أو حتى استبدال النماذج الحيوانية. فهي ذات أهمية خاصة لدراسة التسبب في أمراض الكبد وكذلك منصات فحص المخدرات4.
تعتبر ثقافة كروية 3D ذات أهمية خاصة لأبحاث السرطان لأنها يمكن أن تقضي على الانقطاع بين الخلايا وبيئتها عن طريق تقليل الحاجة إلى علاج التربسين أو كولاجيناز اللازم لإعداد أحاديات الخلايا السرطانية لثقافات 2D. تمكن الأجسام الكروية للورم من دراسة كيفية تلقي الخلايا الطبيعية مقابل الخلايا الخبيثة للإشارات من محيطهاوالاستجابة لها 5 وهي جزء مهم من دراسات بيولوجيا الورم.
بالمقارنة مع monolayer ، تشبه ثقافات 3D التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا أنسجة الورم في خصائصها الهيكلية والوظيفية ، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة ورم خبيث وغزو الخلايا السرطانية. هذا هو السبب في أن هذه النماذج الكروية تساهم في تسريع أبحاث السرطان6.
تساعد الكائنات الكروية أيضا في تطوير التكنولوجيا اللازمة لإنشاء عضويات بشرية لأن بيولوجيا الأنسجة والأعضاء صعبة للغاية للدراسة ، خاصة في البشر. التقدم في زراعة الخلايا الجذعية يجعل من الممكن تطوير ثقافات 3D مثل المواد العضوية التي تتكون من الخلايا الجذعية وأسلاف الأنسجة وكذلك أنواع مختلفة من الخلايا الناضجة (الأنسجة) من عضو مع بعض الخصائص الوظيفية مثل العضو الحقيقي الذي يمكن استخدامه لنمذجة تطور الأعضاء والأمراض ، ولكن يمكن اعتبارها أيضا مفيدة في الطب التجديدي7.
عادة ما تستخدم خلايا الكبد البشرية الأولية لدراسة البيولوجيا المختبرية لخلايا الكبد البشرية ، ووظائف الكبد ، والسمية التي يسببها الدواء. ثقافات خلايا الكبد البشرية لها عيبان رئيسيان ، أولا ، التوافر المحدود للأنسجة الأولية مثل خلايا الكبد البشرية ، وثانيا ، ميل خلايا الكبد إلى عدم التمايز بسرعة في ثقافة 2D وبالتالي فقدان وظيفة خلايا الكبد المحددة8. الثقافات الكبدية 3D متفوقة في هذا الصدد وقد تم تصنيعها مؤخرا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) 9. تعتبر كرويات 3D الكبدية المهندسة بيولوجيا ذات أهمية خاصة لدراسة التطور والسمية والأمراض الوراثية والمعدية للكبد ، وكذلك في اكتشاف الأدوية لعلاج أمراض الكبد10. أخيرا ، لديهم أيضا إمكانية استخدامها سريريا ، مع العلم أن أمراض الكبد الحادة لها معدل وفيات يقارب 80٪ ، والكبد الاصطناعي الحيوي و / أو كرويات الكبد يمكن أن تنقذ هؤلاء المرضى من خلال توفير وظائف الكبد الجزئية حتى يمكن العثور على متبرع مناسب11.
لقد أنشأنا بروتوكولا لتوليد كرويات كبدية بشرية باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) لإعداد كرويات مختلفة الحجم تحتوي على 4000 إلى 1 × 106 خلايا وتحليلها عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتألق المناعي. اختبرنا أيضا قدرة الوظيفة الخاصة بخلايا الكبد ، وتقييم تعبير إنزيمات السيتوكروم P450 3A4 (CYP3A4) و 2E1 (CYP2E1) التي تنتمي إلى عائلة السيتوكروم P450 التي لها أدوار مهمة في التمثيل الغذائي الخلوي والدواء من خلال عملية إزالة السموم12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500217</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1 Fetoprotein</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>14550-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 111 LN</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN111-02</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-10040-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEROplate 96 well</td>
			<td>OLS OMNI Life Science</td>
			<td>2800-109-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercially available detergent</td>
			<td>Procter &#38; Gamble</td>
			<td></td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2E1-specific antibody</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>19937-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal antibody IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4&#160;</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>67110-1-lg</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>M7010</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips 14 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>01-0014/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G588.2-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Cy3</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1673767</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG DyLight 488</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1889284</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721-1LGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17705021</td>
			<td>hepatocyte maturation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0324</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4&#945; antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1457-25UL</td>
			<td>clone 4C19 ZooMAb Rbmono</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay18226-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A3181501</td>
			<td>KSR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Multidishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6789</td>
			<td>4 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC5015</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>A2213</td>
			<td>10000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 15ml tubes sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-chicken IgG Texas red</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN637943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Cell Iscoves MDM</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Mount FluorCare DAPI</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>HP20.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Sep 1077 human</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>0642.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transthyretin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500378</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies

يمكن أن تشكل خلايا الكبد البشرية بنية ثلاثية الأبعاد (3D) قادرة على النمو في الثقافة لعدة أسابيع ، والحفاظ على قدرتها الوظيفية. نظرا لطبيعتها في التجمع في أطباق الاستزراع ذات الخصائص اللاصقة المنخفضة أو المعدومة ، فإنها تشكل تجمعات من خلايا الكبد المتعددة التي تسمى كرويات الكبد البشري. يعتمد تكوين كرويات الكبد 3D على الميل الطبيعي للخلايا الكبدية للتجمع في غياب ركيزة لاصقة. هذه الهياكل 3D تمتلك استجابات فسيولوجية أفضل من الخلايا ، والتي هي أقرب إلى بيئة في الجسم الحي . استخدام ثقافات خلايا الكبد 3D له مزايا عديدة عند مقارنته بالثقافات الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D) ، بما في ذلك بيئة دقيقة أكثر صلة بيولوجيا ، ومورفولوجيا معمارية تعيد تجميع الأعضاء الطبيعية بالإضافة إلى تنبؤ أفضل فيما يتعلق بحالة المرض وفي استجابات شبيهة بالجسم الحي للأدوية. يمكن استخدام مصادر مختلفة لتوليد كرويات ، مثل أنسجة الكبد الأولية أو خطوط الخلايا الخالدة. يمكن أيضا هندسة أنسجة الكبد 3D باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) لاشتقاق خلايا الكبد. لقد حصلنا على كرويات الكبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) المتولدة من الدم المحيطي غير المعالج عن طريق تنشيط البروتين المرتبط بغشاء الإنسان المرتبط ب GPI والمتمايز إلى خلايا الكبد البشرية. تم تحليل خلايا الكبد البشرية المشتقة من BD-PSCs وكرويات الكبد البشري عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتنميط المناعي باستخدام علامات خلايا الكبد البشرية.

لقد نجحنا في تمييز BD-PSCs البشرية إلى خلايا سلف الأديم الباطن / الكبدي وخلايا الكبد من خلال تطبيق بروتوكول من خطوتين. يوضح الشكل 1 التغيرات المورفولوجية أثناء عملية التمايز الكبدي. تتمايز BD-PSCs إلى خلايا كبدية تمر بثلاث مراحل مختلفة. تمثل المرحلة الأولى التمايز إلى خلايا الأدي...

Watch this Scientific Journal Video about Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies at JoVE.com

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

نقدم هنا طريقة غير وراثية لتوليد كرويات كبدية ذاتية بشرية باستخدام خلايا أحادية النواة معزولة من الدم المحيطي المستقر.

كرويات الكبد البشري من الدم المحيطي لدراسات أمراض الكبد

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

يمكن أن يساهم توليد كرويات الكبد البشري باستخدام مصادر ذاتية في مجالات بحثية مختلفة مثل علم السموم والسرطان واكتشاف الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام خلايا الكبد البشرية المشتقة من BDPC لهندسة كرويات الكبد البشري ، والتحايل على النقص في خلايا الكبد البشرية الأولية أو PHH. يمكن أن تمتد الكرويات البشرية الذاتية إلى الطب التجديدي والعلاج ، خاصة في المرضى الذين يعانون من فشل الكبد الحاد.ستوضح العملية الدكتورة آن كاثرين شوت ، قائدة المشروع في مختبري. ابدأ بإعداد 500 ملليلتر من بديل مصل KnockOut ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو وسط KSR DMSO ووسط نضج خلايا الكبد. قسمة الوسط من المخزون وأضف عامل نمو خلايا الكبد الطازجة أو HGF و oncostatin M أو OCM بتركيزات نهائية تبلغ 10 أو 20 نانوجرام لكل مليلتر لكل تغيير متوسط.نقل ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم الخامسة أو خلايا BD-PSCs إلى صفيحة أربعة آبار مغلفة بالبيولامينين واحتضان الصفيحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام. لدعم تمايز الأديم الباطن ، قم بزراعة الخلايا لمدة خمسة أيام في وسط الأرومة الكبدية KSR DMSO وتغيير الوسط كل 48 ساعة. في اليوم الخامس ، أضف وسط نضوج خلايا الكبد واستزرع الخلايا لمدة سبعة إلى 10 أيام إضافية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، مما يضمن تغيير الوسط كل 48 ساعة.عد الخلايا باستخدام غرفة العد ومعلق الخلية غير المتمايز BD للطرد المركزي عند 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا غير المتمايزة BD في وسط KSR DMSO عند مرتين 10 من الخلايا الست لكل تركيز ملليلتر. بعد التأكد من تعليق الخلية المفردة ، قم بإزالة أي حطام إضافي عن طريق تمرير الخلايا عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر.مرة أخرى ، عد الخلايا باستخدام غرفة العد وقم بإعداد حجم كاف من كثافة بذر كل خلية لتوزيع الحجم المطلوب لكل بئر. قم بإعداد تدرج مع البذر العلوي لمليون خلية إلى كثافة بذر منخفضة تبلغ 4000 خلية. بعد ذلك ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من وسط KSR DMSO في 96 لوحة ربط منخفضة البئر وإضافة 100 ميكرولتر من تخفيف بذر الخلايا.احتضان لوحة المرفقات المنخفضة لمدة خمسة أيام. قم بتغيير 50٪ من الوسط في اليوم الثالث أو الرابع بعد البذر عندما تكون الأجسام الكروية مضغوطة بدرجة كافية. في اليوم الخامس ، قم بتغيير الوسط إلى وسط نضج خلايا الكبد واستزرع الخلايا فيه لمدة سبعة إلى 10 أيام إضافية ، وقم بتغيير الوسط كل 48 ساعة.بعد زراعة الخلايا لمدة 4 و 8 و 15 و 24 يوما باستخدام طريقة التمايز الموضحة سابقا ، قم بإزالة الوسائط. احتضان الخلايا مع مثبتات قبل التسخين تحتوي على 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المثبت واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما.أضف على الفور محلول Triton X-100 بنسبة 0.1٪ وتخلل الخلايا لمدة خمس دقائق قبل غسلتين من PBS. أضف محلول مانع مصنوع من PBS و 5٪ ألبومين مصل بقري أو BSA قبل وضع الخلايا على طبق هزاز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت للتخفيف 1٪ BSA PBS وإضافة 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر.تخلص من محلول الأجسام المضادة بعد حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وأعط ثلاث غسلات مدة كل منها خمس دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول التخفيف في كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منها ، قم بتركيب أغطية الغطاء بوسائط متصاعدة تحتوي على DAPI للتحليل المجهري.تخلص بعناية من وسائط الاستزراع دون لمس الأجسام الكروية وأضف برنامج تلفزيوني طازج بمحلول 0.1٪ Triton X-100 واحتضانه لمدة خمس دقائق لاختراق الخلايا. اغسل الكرات الكروية مرتين بالوسط عن طريق سحب الوسط ببطء. بعد ذلك ، احتضان الأجسام الكروية مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة.بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الزائد بعناية وإعطاء ثلاث غسلات من الوسط. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية المقابلة مثل الماعز المضاد للفأر IgG Cy3 ، والماعز المضاد للفأر IgG 488 ، والأرانب المضادة للدجاج IgG Texas Red في PBS مع 1٪ BSA وإضافة 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر قبل 20 دقيقة من الحضانة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. مرة أخرى ، اغسل ثلاث مرات مع المتوسطة قبل 30 دقيقة من الحضانة في الحاضنة.قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري قبل 10 دقائق من الاستخدام. قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التصوير. استخدم هدف التكبير 4X بالنقر فوق الزر 4X في شريط الأدوات لتحديد شريط القياس الصحيح.ثم ضع لوحة 96 بئرا على لوحة مركز المسرح. قم بتشغيل مصدر ضوء LED ، واستخدم مرشح brightfield ، وضع اللوحة في البئر محل الاهتمام باستخدام مقبض ضبط مرحلة المحور XY. قم بالتغيير إلى مسار ضوء الكاميرا وانقر فوق الزر المباشر في برنامج التصوير لتصور الصورة على الشاشة.تأكد من توسيط الكروي باستخدام مقابض المحور XY والتركيز باستخدام مقبض التركيز الخشن أو الدقيق. بعد ذلك ، اختر طريقة مراقبة brightfield في شريط الأدوات ، واضبط إعدادات التعرض على تلقائي ، وانقر فوق زر اللقطة في لوحة تحكم الكاميرا لالتقاط صورة. ثم احفظ الصورة كملف vsi باستخدام الاسم المناسب في مجلد الاهتمام.ضع لوحة حماية الإضاءة المحيطة لإيقاف تشغيل ضوء LED وتغيير الفلتر لإثارة B. ثم اختر طريقة الملاحظة 488. افتح الغالق ، والتقط صورة بالنقر فوق زر اللقطة وأغلق الغالق واحفظ الملف بتنسيق vsi.كرر العملية باستخدام مرشح لإثارة G لتكرار العملية لكل بئر من الاهتمام. أظهرت التغيرات المورفولوجية أثناء عملية التمايز الكبدي أن BD-PSCs تمايزت إلى خلايا كبدية من خلال ثلاث مراحل. تمثل المرحلة الأولى التمايز إلى خلايا الأديم الباطن.التمايز الثاني إلى خلايا سلفية كبدية تظهر مورفولوجيا متعددة الأضلاع نموذجية. والثالث ، نضوج خلايا الكبد. أظهر تحليل التألق المناعي التعبير القوي عن علامات سلف الكبد البشري الأديم الباطن مثل بروتين ألفا الجنيني أو APF وترانسثيريتين أو TTR في الخلايا في المرحلة الأولى من عملية التمايز الكبدي في L4 إلى L8 يوم.ومع ذلك ، انخفض تعبيرهم في L15 يوم. ظهر تعبير الألبومين أو ALB والعامل النووي لخلايا الكبد أربعة ألفا أو HNF4 ألفا أولا في L4 ، وزاد طوال وقت التمايز L4 إلى L15 ، ووصل إلى تعبير قوي ومستقر خلال وقت النضج L15 إلى L24. لوحظ التجمع التلقائي للخلايا في لوحات التعلق المنخفضة التي تحتوي على تحريض خلايا الكبد أو وسط النضج بدأ تكوين كروي.لوحظ وجود علاقة ثابتة بين كروية الستيرويد والعدد المتغير للخلايا. كشفت الأجسام الكروية التي تشكلت وتمايزت في L14 وتعيش ملطخة بالأجسام المضادة عن النشاط الوظيفي الكبدي المحتمل للكرويات المشتقة من BD-PSCs. يعد تحضير الخلايا أحادية النواة لإعادة البرمجة أهم خطوة في هذا الإجراء.توليد كرويات الكبد البشري هو الخطوة الأولى لإنشاء عضويات في نسخة مبسطة من الجهاز في 3D مع تشريح دقيق مشابه لتلك الموجودة في الجسم الحي. تستخدم المواد العضوية التي تم إنشاؤها في المختبر لدراسة تكوين الأعضاء وتطور الأمراض والمغذيات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Manufacturing Devices and Instruments for Easier Rat Liver Transplantation

أجهزة التصنيع والادوات لتسهيل الجرذ زرع الكبد

Orthotopic rat liver transplantation is a popular model, which has been shown in a recent JoVE paper with the use of the "quick-linker" device. This ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

تصنيع مقلوب الغروية كريستال بولي (جلايكول الإثيلين) سقالة: وثلاثي الأبعاد منصة الثقافة خلية للهندسة الأنسجة الكبد

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

المراقبة المجهرية متعددة الفوتون للأوعية في أنسجة كبد الفأر

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...