Name: human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies at JoVE.com

De auteurs zijn vooral dankbaar voor de technische assistentie van Oksana en John Greenacre. Dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.

Ethische goedkeuring werd verkregen (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) voor het uitvoeren van deze experimenten en geïnformeerde toestemming werd ondertekend door alle donoren vóór bloedextractie in overeenstemming met institutionele richtlijnen.
1. Bereiding van mononucleaire cellen (MNC's) uit menselijk perifeer bloed (PB)
<ol><li>Extraheer 30 ml bloed van gezonde donoren met behulp van getraind medisch personeel volgens het standaardprotocol.</li>
	<li>Isoleer PBM...

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620 (2019).</li><li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research.">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li><li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology.">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signalling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li><li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+for+studying+tumor+responses+to+anticancer+therapies.">Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies.</a> Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance.">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+stem+cells+into+liver.">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li><li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis.">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure.">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans.">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., Schott, A. K., Zipan&#269;i&#263;, I., Hern&#225;ndez-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells.">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+neural+stem+cells.">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).</li><li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-fetoprotein:+a+review.">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li><li>Magalh&#227;es, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transthyretin+in+cell+biology:+impact+on+human+pathophysiology.">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li><li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice.">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li><li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury.">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li><li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease.">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).</li><li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects:+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates.">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li><li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes.">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li><li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro.">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).</li></ol>

De lever is een belangrijk orgaan in het menselijk lichaam met veel essentiële biologische functies, zoals de ontgifting van metabolieten. Als gevolg van ernstig leverfalen zoals cirrose en / of virale hepatitis, zijn er wereldwijd bijna 2 miljoen sterfgevallen per jaar. Levertransplantaties staan wereldwijd op de tweede plaats in solide orgaantransplantaties, maar slechts aan ongeveer 10% van de huidige behoefte wordt voldaan22.
Primaire menselijke hepatocyten (PHH) w...

In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) sferoïde cultuursystemen een belangrijk hulpmiddel geworden om verschillende gebieden van kankeronderzoek, medicijnontdekking en toxicologie te bestuderen. Dergelijke culturen wekken grote belangstelling omdat ze de kloof overbruggen tussen tweedimensionale (2D) celkweek monolagen en complexe organen1.
Bij afwezigheid van een kleefoppervlak, in vergelijking met de 2D-celcultuur, is de vorming van sferoïden gebaseerd op de natuurlijke affiniteit van deze cellen om in 3D-vorm te clusteren. Deze cellen organiseren zich in groepen bestaande uit een of meer soorten volwassen cellen. Vrij van vreemde materialen, deze cellen interageren met elkaar zoals in hun oorspronkelijke micro-omgeving. De cellen in 3D-cultuur zijn veel dichter bij elkaar en hebben een goede oriëntatie op elkaar, met een hogere extracellulaire matrixproductie dan 2D-culturen, en vormen een dicht bij natuurlijke omgeving 2.
Diermodellen worden al heel lang gebruikt om menselijke biologie en ziekten te bestuderen3. In dit opzicht zijn er intrinsieke verschillen tussen mens en dier, waardoor deze modellen niet helemaal geschikt zijn voor extrapolatieve studies. 3D-cultuursferoïden en organoïden vormen een veelbelovend hulpmiddel om weefselachtige architectuur, interactie en overspraak tussen verschillende celtypen te bestuderen die in vivo voorkomen en kunnen bijdragen aan het verminderen of zelfs vervangen van diermodellen. Ze zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van de pathogenese van leverziekten en voor het screenen van geneesmiddelen4.
3D-sferoïdecultuur is van bijzonder belang voor kankeronderzoek omdat het de discontinuïteit tussen de cellen en hun omgeving kan elimineren door de behoefte aan trypsinisatie of collagenasebehandeling te verminderen die nodig is voor het voorbereiden van de tumorcelmonolagen voor 2D-culturen. Tumorsferoïden maken het mogelijk om te bestuderen hoe de normale versus kwaadaardige cellen signalen uit hun omgeving ontvangen en erop reageren5 en zijn een belangrijk onderdeel van tumorbiologische studies.
In vergelijking met de monolaag lijken 3D-culturen bestaande uit verschillende celtypen op tumorweefsels in hun structurele en functionele eigenschappen en zijn daarom geschikt voor het bestuderen van metastase en invasie van tumorcellen. Daarom dragen dergelijke sferoïde modellen bij aan het versnellen van kankeronderzoek6.
Sferoïden helpen ook bij het ontwikkelen van de technologie om menselijke organoïden te maken, omdat weefsel- en orgaanbiologie zeer uitdagend zijn om te bestuderen, vooral bij mensen. Vooruitgang in stamcelkweek maakt het mogelijk om 3D-culturen zoals organoïden te ontwikkelen die bestaan uit stamcellen en weefselvoorlopers, evenals verschillende soorten volwassen (weefsel) cellen van een orgaan met enkele functionele kenmerken zoals een echt orgaan dat kan worden gebruikt om orgaanontwikkeling, ziekten te modelleren, maar ze kunnen ook als nuttig worden beschouwd in regeneratieve geneeskunde7.
Primaire menselijke hepatocyten worden meestal gebruikt voor het bestuderen van in vitro biologie van menselijke hepatocyten, leverfunctie en geneesmiddel-geïnduceerde toxiciteit. Culturen van menselijke hepatocyten hebben twee belangrijke nadelen, ten eerste de beperkte beschikbaarheid van primair weefsel zoals menselijke hepatocyten, en ten tweede de neiging van hepatocyten om snel te dedifferentiëren in 2D-cultuur, waardoor hun specifieke hepatocytenfunctie verlorengaat 8. 3D-leverculturen zijn in dit opzicht superieur en zijn onlangs gemaakt van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)9. Bioengineered hepatische 3D-sferoïden zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van ontwikkeling, toxiciteit, genetische en infectieziekten van de lever, evenals bij het ontdekken van geneesmiddelen voor de behandeling van leverziekten10. Ten slotte hebben ze ook het potentieel om klinisch te worden gebruikt, wetende dat acute leverziekten een sterftecijfer van bijna 80% hebben, bio-kunstmatige lever en / of leversferoïden kunnen deze patiënten mogelijk redden door een gedeeltelijke leverfunctie te bieden totdat een geschikte donor kan worden gevonden11.
We hebben een protocol opgesteld voor het genereren van menselijke leversferoïden met behulp van bloedafgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) om sferoïden van verschillende grootte te bereiden die 4000 tot 1 x 106 cellen bevatten en deze geanalyseerd door middel van lichtmicroscopie en immunofluorescentie. We hebben ook het vermogen van hepatocyt-specifieke functie getest, waarbij we de expressie van cytochroom P450 3A4 (CYP3A4) en 2E1 (CYP2E1) enzymen beoordeelden die behoren tot de cytochroom P450-familie die een belangrijke rol spelen in cellulair en geneesmiddelmetabolisme door het proces van ontgifting12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500217</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1 Fetoprotein</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>14550-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 111 LN</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN111-02</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-10040-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEROplate 96 well</td>
			<td>OLS OMNI Life Science</td>
			<td>2800-109-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercially available detergent</td>
			<td>Procter &#38; Gamble</td>
			<td></td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2E1-specific antibody</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>19937-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal antibody IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4&#160;</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>67110-1-lg</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>M7010</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips 14 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>01-0014/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G588.2-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Cy3</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1673767</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG DyLight 488</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1889284</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721-1LGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17705021</td>
			<td>hepatocyte maturation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0324</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4&#945; antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1457-25UL</td>
			<td>clone 4C19 ZooMAb Rbmono</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay18226-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A3181501</td>
			<td>KSR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Multidishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6789</td>
			<td>4 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC5015</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>A2213</td>
			<td>10000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 15ml tubes sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-chicken IgG Texas red</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN637943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Cell Iscoves MDM</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Mount FluorCare DAPI</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>HP20.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Sep 1077 human</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>0642.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transthyretin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500378</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies

Menselijke levercellen kunnen een driedimensionale (3D) structuur vormen die in staat is om enkele weken in cultuur te groeien, waardoor hun functionele capaciteit behouden blijft. Vanwege hun aard om te clusteren in de kweekschalen met lage of geen kleefeigenschappen, vormen ze aggregaten van meerdere levercellen die menselijke leversferoïden worden genoemd. De vorming van 3D-leversferoïden is afhankelijk van de natuurlijke neiging van levercellen om te aggregeren in afwezigheid van een kleefbaar substraat. Deze 3D-structuren hebben betere fysiologische reacties dan cellen, die dichter bij een in vivo omgeving staan. Het gebruik van 3D-hepatocytenculturen heeft tal van voordelen in vergelijking met klassieke tweedimensionale (2D) culturen, waaronder een meer biologisch relevante micro-omgeving, architecturale morfologie die natuurlijke organen opnieuw samenstelt, evenals een betere voorspelling met betrekking tot de ziektetoestand en in vivo-achtige reacties op geneesmiddelen. Verschillende bronnen kunnen worden gebruikt om sferoïden te genereren, zoals primair leverweefsel of onsterfelijke cellijnen. Het 3D-leverweefsel kan ook worden gemanipuleerd door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) te gebruiken om hepatocyten af te leiden. We hebben menselijke leversferoïden verkregen met behulp van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) gegenereerd uit ongemanipuleerd perifeer bloed door activering van menselijk membraangebonden GPI-gebonden eiwit en gedifferentieerd tot menselijke hepatocyten. De van BD-PSC's afgeleide menselijke levercellen en menselijke leversferoïden werden geanalyseerd door lichtmicroscopie en immunofenotypering met behulp van menselijke hepatocytenmarkers.

We hebben met succes menselijke BD-PSC's gedifferentieerd in endoderm / hepatische voorlopercellen en hepatocyten door een tweestappenprotocol toe te passen. Morfologische veranderingen tijdens het leverdifferentiatieproces zijn weergegeven in figuur 1. BD-PSC's differentiëren in hepatocyten die drie verschillende stadia doorlopen. De eerste fase vertegenwoordigt de differentiatie in endodermale cellen L4, de tweede, differentiatie naar levervoorlopercellen (hepatoblast) L8, met een typisch...

Watch this Scientific Journal Video about Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies at JoVE.com

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generatie van menselijke leversferoïden met behulp van autologe bronnen kan bijdragen aan verschillende onderzoeksgebieden zoals toxicologie, kanker en geneesmiddelenontdekking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om BDPC-afgeleide menselijke hepatocyten te gebruiken om menselijke leversferoïden te engineeren, waardoor het tekort aan primaire menselijke hepatocyten of PHH wordt omzeild. Autologe menselijke sferoïden kunnen worden uitgebreid tot regeneratieve geneeskunde en therapie, vooral bij patiënten met acuut leverfalen.Dr.Anne-Katherin Schott, projectleider in mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het bereiden van 500 milliliter hepatoblast KnockOut serumvervangend dimethylsulfoxide of KSR DMSO-medium en hepatocytenrijpingsmedium. Aliquoteer het medium uit de bouillon en voeg verse hepatocytengroeifactor of HGF en oncostatine M of OCM toe in eindconcentraties van 10 of 20 nanogram per milliliter voor elke mediumverandering.Breng drie keer 10 tot de vijfde van het bloed afgeleide pluripotente stamcellen of BD-PSC-cellen over in een met biolaminine gecoate vierputplaat en incuber de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vijf dagen. Om de endodermale differentiatie te ondersteunen, kweek de cellen gedurende vijf dagen in KSR DMSO hepatoblastmedium en verander het medium elke 48 uur. Voeg op dag vijf hepatocytenrijpingsmedium toe en kweek de cellen gedurende nog eens zeven tot 10 dagen in de couveuse bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, waardoor het medium elke 48 uur wordt vervangen.Tel cellen met behulp van een telkamer en centrifugeer BD gededifferentieerde celsuspensie bij 300 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien BD gededifferentieerde cellen in KSR DMSO-medium bij twee keer 10 van de zes cellen per milliliter concentratie. Nadat u de suspensie van één cel hebt verzekerd, verwijdert u extra vuil door de cellen door een celzeef van 40 micrometer te laten gaan.Nogmaals, tel de cellen met behulp van een telkamer en bereid een voldoende volume van elke celzaaidichtheid voor om het vereiste volume per put af te geven. Bereid een gradiënt voor met topzaaiing van een miljoen cellen tot een lage zaaidichtheid van 4.000 cellen. Doseer vervolgens 100 microliter KSR DMSO-medium in 96-well lage bevestigingsplaten en voeg 100 microliter celzaaiverdunning toe.Incubeer de lage bevestigingsplaat gedurende vijf dagen. Verander 50% van het medium op de derde of vierde dag na het zaaien wanneer de sferoïden voldoende compact zijn. Verander op dag vijf het medium in hepatocytenrijpingsmedium en kweek de cellen erin gedurende nog eens zeven tot 10 dagen, waarbij het medium elke 48 uur wordt vervangen.Nadat u de cellen gedurende 4, 8, 15 en 24 dagen hebt gekweekt met behulp van de eerder beschreven differentiatiemethode, verwijdert u de media. Incubeer de cellen met voorverwarmde fixatieven die 4% paraformaldehyde bevatten in PBS gedurende 10 minuten. Gooi vervolgens het fixatief weg en was de cellen twee keer met PBS gedurende elk vijf minuten.Voeg onmiddellijk 0,1% Triton X-100-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende vijf minuten voordat u PBS twee keer wast. Voeg een blokkeringsoplossing gemaakt van PBS en 5% runderserumalbumine of BSA toe voordat u de cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur op een wipplaat plaatst. Verdun primaire antilichamen in verdunningsbuffer 1% BSA PBS en voeg 50 microliter van de antilichaamverdunning per put toe.Gooi de antilichaamoplossing na een incubatie van één uur bij kamertemperatuur weg en geef drie wasbeurten van elk vijf minuten met PBS. Voeg 50 microliter secundaire antilichamen verdund in verdunningsbuffer toe in elke put en incuber de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat u de cellen drie keer met PBS gedurende vijf minuten hebt gewassen, monteert u de afdekstroken met montagemedia die DAPI bevatten voor microscopische analyse.Gooi de kweekmedia voorzichtig weg zonder de sferoïden aan te raken en voeg vers bereide PBS toe met 0,1% Triton X-100-oplossing en incubeer gedurende vijf minuten om de cellen te permeabiliseren. Was de sferoïden twee keer met het medium door het medium langzaam te pipetteren. Incubeer vervolgens de sferoïden met 50 microliter van de primaire antilichamen gedurende een uur.Als u klaar bent, verwijdert u voorzichtig de overtollige antilichaamoplossing en geeft u drie wasbeurten medium. Bereid de overeenkomstige secundaire antilichamen zoals geitenantimuis IgG Cy3, geitenantimuis IgG 488 en konijn anti-kip IgG Texas Red in PBS met 1% BSA en voeg 50 microliter antilichaamverdunning per put toe vóór 20 minuten incubatie in de kooldioxide-incubator. Nogmaals, was driemaal met het medium vóór 30 minuten incubatie in de couveuse.Schakel de fluorescentielichtbron 10 minuten voor gebruik in. Schakel de computer in en open de beeldbewerkingssoftware. Gebruik het 4X-vergrotingsobjectief door op de 4X-knop in de werkbalk te klikken om de juiste schaalbalk te selecteren.Plaats vervolgens de 96-putplaat op de middenplaat van het podium. Schakel de LED-lichtbron in, gebruik het brightfield-filter en plaats de plaat in de gewenste put met behulp van de XY-astrapverstelknop. Ga naar het lichtpad van de camera en klik op de live-knop in de beeldbewerkingssoftware om het beeld op het scherm te visualiseren.Zorg ervoor dat de sferoïde gecentreerd is met behulp van de XY-asknoppen en stel scherp met behulp van de grove of fijne scherpstelknop. Kies vervolgens de brightfield-observatiemethode in de werkbalk, zet de belichtingsinstellingen op automatisch en klik op de snapshotknop in het bedieningspaneel van de camera om een foto te maken. Sla de afbeelding vervolgens op als vsi-bestand met de juiste naam in de gewenste map.Plaats een afschermingsplaat voor omgevingslicht om het LED-licht uit te schakelen en vervang het filter voor B-excitatie. Kies dan voor de observatiemethode 488. Open de sluiter, maak een foto door op de snapshotknop te klikken en sluit de sluiter en sla het bestand op als een vsi.Herhaal het proces met een filter voor G-excitatie om het proces voor elke interessante put te herhalen. Morfologische veranderingen tijdens het leverdifferentiatieproces toonden aan dat de BD-PSC's in drie fasen differentieerden in hepatocyten. De eerste fase vertegenwoordigde de differentiatie in endodermale cellen.De tweede differentiatie in levervoorlopercellen vertoont een typische veelhoekige morfologie. En de derde, de rijping tot hepatocyten. Immunofluorescentieanalyse toonde de sterke expressie van endoderm humane levervoorlopermarkers zoals het alfa-fetoproteïne of APF en transthyretine of TTR in de cellen in de eerste fase van het leverdifferentiatieproces op L4 tot L8-dag.Hun expressie nam echter af op L15-dag. De expressie van albumine of ALB en hepatocyten nucleaire factor vier alfa of HNF4 alfa verscheen eerst bij L4, nam toe gedurende de differentiatietijd L4 tot L15 en bereikte een sterke en stabiele expressie tijdens de rijpingstijd L15 tot L24. Spontane aggregatie van cellen werd waargenomen in lage hechtingsplaten die hepatocyteninductie of rijpingsmedium geïnitieerde sferoïdevorming bevatten.Er werd een consistente correlatie waargenomen tussen steroïde sferoïde en het variabele aantal cellen. De sferoïden gevormd en gedifferentieerd bij L14 en levend gekleurd met antilichamen onthulden de potentiële hepatische functionele activiteit van BD-PSC's afgeleide sferoïden. De voorbereiding van mononucleaire cellen voor herprogrammering is de belangrijkste stap in deze procedure.Het genereren van menselijke leversferoïden is de eerste stap naar het creëren van organoïden in vitro vereenvoudigde versie van het orgaan in 3D met microanatomie vergelijkbaar met die in vivo. Organoïden die in het laboratorium zijn gemaakt, worden gebruikt om organogenese, ziekteontwikkeling en voedingsstoffen te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Manufacturing Devices and Instruments for Easier Rat Liver Transplantation

Productie apparaten en instrumenten voor eenvoudiger Rat Liver Transplantation

Orthotopic rat liver transplantation is a popular model, which has been shown in a recent JoVE paper with the use of the "quick-linker" device. This ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...