Name: human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00
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Les auteurs sont particulièrement reconnaissants de l’assistance technique fournie par Oksana et John Greenacre. Ce travail a été soutenu par ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Allemagne.

L’approbation éthique a été obtenue (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) pour effectuer ces expériences et le consentement éclairé a été signé par tous les donneurs avant l’extraction de sang conformément aux directives institutionnelles.
1. Préparation de cellules mononucléées (MNC) à partir de sang périphérique humain (PB)
<ol><li>Extraire 30 mL de sang de donneurs sains avec l’aide d’un personnel médical formé selon le protocole standard.</li>...

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620 (2019).</li><li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research.">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li><li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology.">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signalling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li><li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+for+studying+tumor+responses+to+anticancer+therapies.">Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies.</a> Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance.">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+stem+cells+into+liver.">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li><li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis.">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure.">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans.">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., Schott, A. K., Zipan&#269;i&#263;, I., Hern&#225;ndez-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells.">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+neural+stem+cells.">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).</li><li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-fetoprotein:+a+review.">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li><li>Magalh&#227;es, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transthyretin+in+cell+biology:+impact+on+human+pathophysiology.">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li><li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice.">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li><li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury.">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li><li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease.">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).</li><li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects:+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates.">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li><li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes.">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li><li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro.">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).</li></ol>

Le foie est un organe majeur du corps humain avec de nombreuses fonctions biologiques essentielles, telles que la désintoxication des métabolites. En raison d’insuffisances hépatiques graves comme la cirrhose et / ou l’hépatite virale, il y a près de 2 millions de décès par an dans le monde. Les transplantations hépatiques se classent au deuxième rang mondial des transplantations d’organes pleins, mais seulement environ 10% des besoins actuels sont satisfaits22.
<p class="jove_c...

Au cours des dernières années, les systèmes de culture sphéroïde tridimensionnels (3D) sont devenus un outil important pour étudier divers domaines de la recherche sur le cancer, de la découverte de médicaments et de la toxicologie. De telles cultures suscitent un grand intérêt car elles comblent le fossé entre les monocouches de culture cellulaire bidimensionnelles (2D) et les organes complexes1.
En l’absence de surface adhésive, par rapport à la culture cellulaire 2D, la formation de sphéroïdes est basée sur l’affinité naturelle de ces cellules pour se regrouper sous forme 3D. Ces cellules s’organisent en groupes constitués d’un ou plusieurs types de cellules matures. Exemptes de corps étrangers, ces cellules interagissent les unes avec les autres comme dans leur microenvironnement d’origine. Les cellules en culture 3D sont beaucoup plus proches et ont une orientation appropriée les unes vers les autres, avec une production de matrice extracellulaire plus élevée que les cultures 2D, et constituent un environnement proche de la nature 2.
Les modèles animaux sont utilisés depuis longtemps pour étudier la biologie humaine et les maladies3. À cet égard, il existe des différences intrinsèques entre les humains et les animaux, ce qui rend ces modèles pas tout à fait adaptés aux études extrapolatives. Les sphéroïdes et les organoïdes de culture 3D représentent un outil prometteur pour étudier l’architecture, l’interaction et la diaphonie tissulaires entre différents types de cellules qui se produisent in vivo et peuvent contribuer à réduire, voire à remplacer, les modèles animaux. Ils présentent un intérêt particulier pour l’étude de la pathogenèse des maladies du foie ainsi que des plateformes de criblagede médicaments 4.
La culture sphéroïde 3D revêt une importance particulière pour la recherche sur le cancer, car elle peut éliminer la discontinuité entre les cellules et leur environnement en réduisant le besoin de trypsinisation ou de traitement par collagénase nécessaire à la préparation des monocouches de cellules tumorales pour les cultures 2D. Les sphéroïdes tumoraux permettent d’étudier comment les cellules normales par rapport aux cellules malignes reçoivent et répondent aux signaux de leur environnement5 et constituent une partie importante des études de biologie tumorale.
Par rapport à la monocouche, les cultures 3D composées de différents types de cellules ressemblent aux tissus tumoraux dans leurs propriétés structurelles et fonctionnelles et conviennent donc à l’étude des métastases et de l’invasion des cellules tumorales. C’est pourquoi de tels modèles sphéroïdes contribuent à accélérer la recherche sur le cancer6.
Les sphéroïdes aident également à développer la technologie pour créer des organoïdes humains parce que la biologie des tissus et des organes est très difficile à étudier, en particulier chez les humains. Les progrès de la culture de cellules souches permettent de développer des cultures 3D comme des organoïdes constitués de cellules souches et de progéniteurs tissulaires ainsi que différents types de cellules matures (tissulaires) à partir d’un organe présentant certaines caractéristiques fonctionnelles comme un organe réel qui peut être utilisé pour modéliser le développement des organes, les maladies, mais elles peuvent également être considérées comme utiles en médecine régénérative7.
Les hépatocytes humains primaires sont généralement utilisés pour étudier in vitro la biologie des hépatocytes humains, la fonction hépatique et la toxicité induite par les médicaments. Les cultures d’hépatocytes humains présentent deux inconvénients principaux, d’une part, la disponibilité limitée de tissus primaires comme les hépatocytes humains, et d’autre part, la tendance des hépatocytes à se dédifférencier rapidement en culture 2D, perdant ainsi leur fonction hépatocytes spécifique8. Les cultures hépatiques 3D sont supérieures à cet égard et ont récemment été fabriquées à partir de cellules souches embryonnaires humaines différenciées (CSEh) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPhi)9. Les sphéroïdes hépatiques 3D issus de la bio-ingénierie présentent un intérêt particulier pour étudier le développement, la toxicité, les maladies génétiques et infectieuses du foie, ainsi que la découverte de médicaments pour le traitement des maladies du foie10. Enfin, ils ont également le potentiel d’être utilisés cliniquement, sachant que les maladies hépatiques aiguës ont un taux de mortalité de près de 80%, le foie bio-artificiel et / ou les sphéroïdes hépatiques pourraient potentiellement sauver ces patients en fournissant une fonction hépatique partielle jusqu’à ce qu’un donneur approprié puisse être trouvé11.
Nous avons établi un protocole pour la génération de sphéroïdes hépatiques humains à l’aide de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSC) pour préparer des sphéroïdes de tailles différentes contenant 4000 à 1 x 106 cellules et les avons analysés au moyen de la microscopie optique et de l’immunofluorescence. Nous avons également testé la capacité de la fonction spécifique des hépatocytes, en évaluant l’expression des enzymes du cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) et 2E1 (CYP2E1) appartenant à la famille du cytochrome P450 qui jouent un rôle important dans le métabolisme cellulaire et médicamenteux par le processus de désintoxication12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500217</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1 Fetoprotein</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>14550-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 111 LN</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN111-02</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-10040-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEROplate 96 well</td>
			<td>OLS OMNI Life Science</td>
			<td>2800-109-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercially available detergent</td>
			<td>Procter &#38; Gamble</td>
			<td></td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2E1-specific antibody</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>19937-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal antibody IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4&#160;</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>67110-1-lg</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>M7010</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips 14 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>01-0014/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G588.2-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Cy3</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1673767</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG DyLight 488</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1889284</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721-1LGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17705021</td>
			<td>hepatocyte maturation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0324</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4&#945; antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1457-25UL</td>
			<td>clone 4C19 ZooMAb Rbmono</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay18226-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A3181501</td>
			<td>KSR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Multidishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6789</td>
			<td>4 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC5015</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>A2213</td>
			<td>10000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 15ml tubes sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-chicken IgG Texas red</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN637943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Cell Iscoves MDM</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Mount FluorCare DAPI</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>HP20.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Sep 1077 human</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>0642.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transthyretin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500378</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies

Les cellules hépatiques humaines peuvent former une structure tridimensionnelle (3D) capable de croître en culture pendant quelques semaines, préservant ainsi leur capacité fonctionnelle. En raison de leur nature à se regrouper dans les boîtes de culture avec des caractéristiques adhésives faibles ou nulles, ils forment des agrégats de plusieurs cellules hépatiques appelées sphéroïdes hépatiques humains. La formation de sphéroïdes hépatiques 3D repose sur la tendance naturelle des cellules hépatiques à s’agréger en l’absence d’un substrat adhésif. Ces structures 3D possèdent de meilleures réponses physiologiques que les cellules, qui sont plus proches d’un environnement in vivo . L’utilisation de cultures d’hépatocytes 3D présente de nombreux avantages par rapport aux cultures bidimensionnelles classiques (2D), notamment un microenvironnement biologiquement plus pertinent, une morphologie architecturale qui réassemble les organes naturels ainsi qu’une meilleure prédiction de l’état de la maladie et des réponses in vivo aux médicaments. Diverses sources peuvent être utilisées pour générer des sphéroïdes, comme le tissu hépatique primaire ou les lignées cellulaires immortalisées. Le tissu hépatique 3D peut également être modifié en utilisant des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPhi) pour obtenir des hépatocytes. Nous avons obtenu des sphéroïdes hépatiques humains en utilisant des cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSC) générées à partir de sang périphérique non manipulé par activation de la protéine liée à la GPI liée à la membrane humaine et différenciée aux hépatocytes humains. Les cellules hépatiques humaines dérivées des BD-PSC et les sphéroïdes hépatiques humains ont été analysés par microscopie optique et immunophénotypage à l’aide de marqueurs hépatocytes humains.

Nous avons réussi à différencier les CSD-BD humaines en cellules progénitrices endodermiques/hépatiques et en hépatocytes en appliquant un protocole en deux étapes. Les changements morphologiques au cours du processus de différenciation hépatique sont illustrés à la figure 1. Les CSP-BD se différencient en hépatocytes passant par trois étapes différentes. La première étape représente la différenciation en cellules endodermiques L4, la deuxième, la différenciation en cell...

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Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Nous présentons ici une méthode non génétique pour générer des sphéroïdes hépatiques autologues humains en utilisant des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à l’état d’équilibre.

Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

La génération de sphéroïdes hépatiques humains à l’aide de sources autologues peut contribuer à divers domaines de recherche tels que la toxicologie, le cancer et la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique est d’utiliser des hépatocytes humains dérivés du BDPC pour concevoir des sphéroïdes hépatiques humains, en contournant la pénurie d’hépatocytes humains primaires ou PHH. Les sphéroïdes humains autologues peuvent être étendus à la médecine et à la thérapie régénératives, en particulier chez les patients atteints d’insuffisance hépatique aiguë.La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Anne-Katherin Schott, chef de projet dans mon laboratoire. Commencez par préparer 500 millilitres de diméthylsulfoxyde de diméthyle de remplacement du sérum KnockOut ou de milieu DMSO KSR et milieu de maturation des hépatocytes. Aliquote du milieu du stock et ajouter le facteur de croissance des hépatocytes frais ou HGF et l’oncostatine M ou OCM à des concentrations finales de 10 ou 20 nanogrammes par millilitre pour chaque changement de milieu.Transférer trois fois 10 à la cinquième cellule souche pluripotente dérivée du sang ou cellules BD-PSCs dans une plaque à quatre puits recouverte de biolaminine et incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Pour soutenir la différenciation endodermique, cultiver les cellules pendant cinq jours dans un milieu hépatoblast de KSR DMSO et changer le milieu toutes les 48 heures. Le cinquième jour, ajouter le milieu de maturation des hépatocytes et cultiver les cellules pendant sept à 10 jours supplémentaires dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en assurant le changement du milieu toutes les 48 heures.Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage et centrifuger la suspension cellulaire dédifférenciée BD à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension les cellules dédifférenciées BD dans le milieu DMSO KSR à deux fois 10 des six cellules par millilitre de concentration. Après avoir assuré la suspension unicellulaire, enlevez tout débris supplémentaire en faisant passer les cellules à travers une crépine à cellules de 40 micromètres.Encore une fois, comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage et préparez un volume suffisant de chaque densité d’ensemencement cellulaire pour distribuer le volume requis par puits. Préparez un gradient avec un ensemencement supérieur d’un million de cellules jusqu’à une faible densité d’ensemencement de 4 000 cellules. Ensuite, distribuez 100 microlitres de milieu DMSO KSR dans des plaques de fixation basses à 96 puits et ajoutez 100 microlitres de dilution d’ensemencement cellulaire.Incuber la plaque de fixation basse pendant cinq jours. Changez 50% du milieu le troisième ou le quatrième jour après l’ensemencement lorsque les sphéroïdes sont suffisamment compacts. Le cinquième jour, changez le milieu en milieu de maturation hépatocytes et cultivez les cellules qu’il contient pendant sept à 10 jours supplémentaires, en changeant le milieu toutes les 48 heures.Après avoir cultivé les cellules pendant 4, 8, 15 et 24 jours en utilisant la méthode de différenciation décrite précédemment, retirez le milieu. Incuber les cellules avec des fixateurs préchauffés contenant 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 minutes. Ensuite, jetez le fixateur et lavez les cellules avec du PBS deux fois pendant cinq minutes chacune.Ajouter immédiatement la solution de Triton X-100 à 0,1% et perméabiliser les cellules pendant cinq minutes avant deux lavages de PBS. Ajouter une solution de blocage à base de PBS et d’albumine sérique bovine à 5% ou BSA avant de placer les cellules sur une plaque à bascule pendant une heure à température ambiante. Diluer les anticorps primaires dans un tampon de dilution à 1% de PBS BSA et ajouter 50 microlitres de dilution d’anticorps par puits.Jeter la solution d’anticorps après une incubation d’une heure à température ambiante et donner trois lavages de cinq minutes chacun en utilisant du PBS. Ajouter 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans un tampon de dilution dans chaque puits et incuber les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, montez les lamelles de couverture avec un support de montage contenant du DAPI pour une analyse microscopique.Jeter soigneusement les milieux de culture sans toucher les sphéroïdes et ajouter du PBS fraîchement préparé avec une solution de Triton X-100 à 0,1% et incuber pendant cinq minutes pour perméabiliser les cellules. Lavez les sphéroïdes deux fois avec le milieu en pipetant lentement le milieu. Ensuite, incuber les sphéroïdes avec 50 microlitres d’anticorps primaires pendant une heure.Une fois cela fait, retirez soigneusement l’excès de solution d’anticorps et donnez trois lavages de moyen. Préparez les anticorps secondaires correspondants comme l’IgG Cy3 anti-souris de chèvre, l’IgG 488 anti-souris de chèvre et l’IgG Texas Red anti-poulet de lapin dans du PBS avec 1% de BSA et ajoutez 50 microlitres de dilution d’anticorps par puits avant 20 minutes d’incubation dans l’incubateur de dioxyde de carbone. Encore une fois, laver trois fois avec le milieu avant 30 minutes d’incubation dans l’incubateur.Allumez la source lumineuse à fluorescence 10 minutes avant utilisation. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel d’imagerie. Utilisez l’objectif d’agrandissement 4X en cliquant sur le bouton 4X dans la barre d’outils pour sélectionner la barre d’échelle appropriée.Placez ensuite la plaque de 96 puits sur la plaque centrale de la scène. Allumez la source lumineuse LED, utilisez le filtre en fond clair et positionnez la plaque sur le puits d’intérêt à l’aide du bouton de réglage de la platine de l’axe XY. Passez au chemin lumineux de la caméra et cliquez sur le bouton en direct dans le logiciel d’imagerie pour visualiser l’image à l’écran.Assurez-vous que le sphéroïde est centré à l’aide des boutons de l’axe XY et faites la mise au point à l’aide du bouton de mise au point grossier ou fin. Ensuite, choisissez la méthode d’observation en fond clair dans la barre d’outils, définissez les paramètres d’exposition sur automatique, puis cliquez sur le bouton d’instantané dans le panneau de configuration de l’appareil photo pour prendre une photo. Enregistrez ensuite l’image en tant que fichier vsi en utilisant le nom approprié dans le dossier qui vous intéresse.Placez la plaque de blindage de la lumière ambiante pour éteindre la lumière LED et changer le filtre pour l’excitation B. Choisissez ensuite la méthode d’observation 488. Ouvrez l’obturateur, prenez une photo en cliquant sur le bouton snapshot et fermez l’obturateur et enregistrez le fichier en tant que vsi.Répétez le processus avec un filtre pour l’excitation G afin de réitérer le processus pour chaque puits d’intérêt. Les changements morphologiques au cours du processus de différenciation hépatique ont montré que les CSP-BD se différenciaient en hépatocytes en trois étapes. La première étape représentait la différenciation en cellules endodermiques.La deuxième différenciation en cellules progénitrices hépatiques présentant une morphologie polygonale typique. Et le troisième, la maturation en hépatocytes. L’analyse par immunofluorescence a montré la forte expression de marqueurs progéniteurs hépatiques humains de l’endoderme tels que l’alpha fœtoprotéine ou APF et la transthyrétine ou TTR dans les cellules au premier stade du processus de différenciation hépatique au jour L4 à L8.Cependant, leur expression a diminué à L15 jours. L’expression de l’albumine ou ALB et du facteur nucléaire quatre alpha des hépatocytes ou HNF4 alpha est apparue d’abord à L4, a augmenté tout au long du temps de différenciation L4 à L15, et a atteint une expression forte et stable pendant le temps de maturation L15 à L24. L’agrégation spontanée des cellules a été observée dans des plaques de fixation faibles contenant une induction hépatocytes ou une formation de sphéroïdes initiée par un milieu de maturation.Une corrélation constante a été observée entre le stéroïde sphéroïde et le nombre variable de cellules. Les sphéroïdes formés et différenciés à L14 et vivants colorés avec des anticorps ont révélé l’activité fonctionnelle hépatique potentielle des sphéroïdes dérivés des BD-PSC. La préparation des cellules mononucléaires pour la reprogrammation est l’étape la plus importante de cette procédure.La génération de sphéroïdes hépatiques humains est la première étape pour créer des organoïdes version simplifiée in vitro de l’organe en 3D avec une micro anatomie similaire à celle in vivo. Les organoïdes créés en laboratoire sont utilisés pour étudier l’organogenèse, le développement de maladies et les nutriments.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Manufacturing Devices and Instruments for Easier Rat Liver Transplantation

fabriquer des dispositifs et instruments pour faciliter le Rat Liver Transplantation

Orthotopic rat liver transplantation is a popular model, which has been shown in a recent JoVE paper with the use of the "quick-linker" device. This ...

Recherche

Bio-ingénierie

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Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

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