Name: human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies at JoVE.com

Авторы особенно благодарны за техническую помощь, оказанную Оксаной и Джоном Гринакр. Эта работа была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Гейдельберг, Германия.

Было получено этическое одобрение (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) для проведения этих экспериментов, и информированное согласие было подписано всеми донорами перед извлечением крови в соответствии с руководящими принципами учреждения.
1. Получение мононуклеарных клеток (ТН?...

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620 (2019).</li><li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research.">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li><li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology.">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signalling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li><li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+for+studying+tumor+responses+to+anticancer+therapies.">Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies.</a> Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance.">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+stem+cells+into+liver.">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li><li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis.">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure.">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans.">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., Schott, A. K., Zipan&#269;i&#263;, I., Hern&#225;ndez-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells.">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+neural+stem+cells.">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).</li><li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-fetoprotein:+a+review.">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li><li>Magalh&#227;es, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transthyretin+in+cell+biology:+impact+on+human+pathophysiology.">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li><li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice.">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li><li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury.">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li><li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease.">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).</li><li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects:+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates.">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li><li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes.">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li><li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro.">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).</li></ol>

Печень является основным органом в организме человека со многими важными биологическими функциями, такими как детоксикация метаболитов. Из-за тяжелой печеночной недостаточности, такой как цирроз печени и/или вирусный гепатит, во всем мире ежегодно умирает около 2 миллионов человек. Тр...

В последние годы трехмерные (3D) системы культивирования сфероидов стали важным инструментом для изучения различных областей исследований рака, открытия лекарств и токсикологии. Такие культуры вызывают большой интерес, поскольку они устраняют разрыв между двумерными (2D) монослоями клеточных культур и сложными органами1.
При отсутствии адгезивной поверхности, по сравнению с 2D-культурой клеток, образование сфероидов основано на естественном сродстве этих клеток к кластеризации в 3D-форме. Эти клетки организуются в группы, состоящие из одного или нескольких типов зрелых клеток. Свободные от чужеродных материалов, эти клетки взаимодействуют друг с другом, как в своем первоначальном микроокружении. Клетки в 3D-культуре намного ближе и имеют правильную ориентацию друг к другу, с более высокой продукцией внеклеточного матрикса, чем в 2D-культурах, и представляют собой близкую к естественной среду 2.
Модели на животных уже давно используются для изучения биологии и болезней человека3. В связи с этим существуют внутренние различия между людьми и животными, что делает эти модели не совсем пригодными для экстраполятивных исследований. Сфероиды и органоиды 3D-культур представляют собой многообещающий инструмент для изучения тканеподобной архитектуры, взаимодействия и перекрестных помех между различными типами клеток, которые происходят in vivo и могут способствовать уменьшению или даже замене моделей животных. Они представляют особый интерес для изучения патогенеза заболеваний печени, а также платформ скрининга лекарств4.
3D-сфероидная культура имеет особое значение для исследований рака, поскольку она может устранить разрыв между клетками и их окружением, уменьшая потребность в трипсинизации или лечении коллагеназой, необходимой для подготовки монослоев опухолевых клеток к 2D-культурам. Опухолевые сфероиды позволяют изучать, как нормальные и злокачественные клетки получают и реагируют на сигналы из своего окружения5 , и являются важной частью исследований биологии опухолей.
По сравнению с монослоем 3D-культуры, состоящие из различных типов клеток, по своим структурным и функциональным свойствам напоминают опухолевые ткани и поэтому подходят для изучения метастазирования и инвазии опухолевых клеток. Вот почему такие сфероидные модели способствуют ускорению исследований рака6.
Сфероиды также помогают разрабатывать технологию создания органоидов человека, потому что биология тканей и органов очень сложна для изучения, особенно у людей. Прогресс в культивировании стволовых клеток позволяет разрабатывать 3D-культуры, такие как органоиды, состоящие из стволовых клеток и тканевых предшественников, а также различные типы зрелых (тканевых) клеток из органа с некоторыми функциональными характеристиками, такими как реальный орган, которые могут быть использованы для моделирования развития органов, заболеваний, но их также можно считать полезными в регенеративной медицине7.
Первичные гепатоциты человека обычно используются для изучения in vitro биологии гепатоцитов человека, функции печени и лекарственно-индуцированной токсичности. Культуры гепатоцитов человека имеют два основных недостатка, во-первых, ограниченную доступность первичной ткани, такой как гепатоциты человека, и, во-вторых, склонность гепатоцитов к быстрой дедифференцировке в 2D-культуре, тем самым теряя свою специфическую функцию гепатоцитов8. 3D-культуры печени превосходят в этом отношении и недавно были изготовлены из дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs)9. Биоинженерные печеночные 3D-сфероиды представляют особый интерес для изучения развития, токсичности, генетических и инфекционных заболеваний печени, а также при открытии лекарств для лечения заболеваний печени10. Наконец, они также могут быть использованы клинически, зная, что острые заболевания печени имеют уровень смертности почти 80%, биоискусственная печень и / или сфероиды печени потенциально могут спасти этих пациентов, обеспечивая частичную функцию печени до тех пор, пока не будет найден подходящий донор11.
Мы разработали протокол генерации сфероидов печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), для получения сфероидов разного размера, содержащих от 4000 до 1 x 106 клеток, и проанализировали их с помощью световой микроскопии и иммунофлуоресценции. Мы также проверили способность гепатоцит-специфической функции, оценив экспрессию ферментов цитохрома P450 3A4 (CYP3A4) и 2E1 (CYP2E1), принадлежащих к семейству цитохрома P450, которые играют важную роль в клеточном и лекарственном метаболизме в процессе детоксикации12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500217</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1 Fetoprotein</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>14550-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 111 LN</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN111-02</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-10040-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEROplate 96 well</td>
			<td>OLS OMNI Life Science</td>
			<td>2800-109-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercially available detergent</td>
			<td>Procter &#38; Gamble</td>
			<td></td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2E1-specific antibody</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>19937-1-AP</td>
			<td>rabbit polyclonal antibody IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4&#160;</td>
			<td>Proteintech Germany GmbH</td>
			<td>67110-1-lg</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>M7010</td>
			<td>mouse monoclonal antibody IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips 14 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>01-0014/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G588.2-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Cy3</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1673767</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG DyLight 488</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN1889284</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721-1LGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17705021</td>
			<td>hepatocyte maturation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0324</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF4&#945; antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1457-25UL</td>
			<td>clone 4C19 ZooMAb Rbmono</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay18226-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A3181501</td>
			<td>KSR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Multidishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6789</td>
			<td>4 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC5015</td>
			<td>human recombinant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>A2213</td>
			<td>10000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 15ml tubes sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-chicken IgG Texas red</td>
			<td>Antibodies online</td>
			<td>ABIN637943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Cell Iscoves MDM</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>9033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Mount FluorCare DAPI</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>HP20.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti Sep 1077 human</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td>
			<td>0642.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transthyretin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB3500378</td>
			<td>produced in chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human liver spheroids from peripheral blood for liver disease studies

Клетки печени человека могут образовывать трехмерную (3D) структуру, способную расти в культуре в течение нескольких недель, сохраняя свою функциональную способность. Из-за своей природы группироваться в культуральных чашках с низкими или отсутствующими адгезионными характеристиками они образуют агрегаты из нескольких клеток печени, которые называются сфероидами печени человека. Формирование 3D-сфероидов печени зависит от естественной склонности печеночных клеток к агрегации в отсутствие адгезивного субстрата. Эти 3D-структуры обладают лучшими физиологическими реакциями, чем клетки, которые ближе к среде in vivo . Использование 3D-культур гепатоцитов имеет множество преимуществ по сравнению с классическими двумерными (2D) культурами, включая более биологически значимое микроокружение, архитектурную морфологию, которая воссобирает естественные органы, а также лучшее прогнозирование состояния болезни и реакций in vivo на лекарства. Для получения сфероидов могут использоваться различные источники, такие как первичная ткань печени или иммортализированные клеточные линии. 3D-ткань печени также может быть сконструирована с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) для получения гепатоцитов. Мы получили сфероиды печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), полученных из необработанной периферической крови путем активации связанного с мембраной GPI-связанного белка человека и дифференцированного в гепатоциты человека. Клетки печени человека, полученные из BD-PSCs, и сфероиды печени человека были проанализированы с помощью световой микроскопии и иммунофенотипирования с использованием маркеров гепатоцитов человека.

Мы успешно дифференцировали BD-PSC человека в клетки-предшественники энтодермы / печени и гепатоциты, применяя двухэтапный протокол. Морфологические изменения в процессе дифференцировки печени показаны на рисунке 1. BD-PSC дифференцируются в гепатоциты, проходящие три разл...

Watch this Scientific Journal Video about Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies at JoVE.com

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Здесь мы представляем негенетический метод получения аутологичных сфероидов печени человека с использованием мононуклеарных клеток, выделенных из стационарной периферической крови.

Сфероиды печени человека из периферической крови для исследований заболеваний печени

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Генерация сфероидов печени человека с использованием аутологичных источников может способствовать различным областям исследований, таким как токсикология, рак и открытие лекарств. Основным преимуществом этого метода является использование человеческих гепатоцитов, полученных из BDPC, для создания сфероидов печени человека, обходя нехватку первичных гепатоцитов человека или PHH. Аутологичные сфероиды человека могут быть распространены на регенеративную медицину и терапию, особенно у пациентов с острой печеночной недостаточностью.Продемонстрирует процедуру доктор Анна-Кэтрин Шотт, руководитель проекта в моей лаборатории. Начните с приготовления 500 миллилитров гепатобласта KnockOut сыворотки замещения диметилсульфоксида или среды KSR DMSO и среды для созревания гепатоцитов. Аликвотируйте среду из запаса и добавляйте свежий фактор роста гепатоцитов или HGF и онкостатин M или OCM в конечных концентрациях 10 или 20 нанограмм на миллилитр для каждой смены среды.Трижды от 10 до пятого плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови, или клеток BD-PSCs переносят в четырехлуночную пластину, покрытую биоламинином, и инкубируют пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти дней. Чтобы поддержать энтодермальную дифференцировку, культивируйте клетки в течение пяти дней в среде гепатобласта KSR DMSO и меняйте среду каждые 48 часов. На пятый день добавьте среду для созревания гепатоцитов и культивируйте клетки в течение дополнительных семи-10 дней в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, обеспечивая смену среды каждые 48 часов.Подсчитывают клетки с помощью счетной камеры и центрифуги BD дедифференцированной клеточной суспензии по 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости ресуспендировать дедифференцированные клетки BD в среде KSR DMSO в два раза по 10 из шести клеток на миллилитр концентрации. После обеспечения суспензии одной ячейки удалите лишний мусор, пропустив клетки через сетчатый фильтр ячейки размером 40 микрометров.Опять же, подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры и подготовьте достаточный объем плотности посева каждой ячейки, чтобы распределить необходимый объем на лунку. Подготовьте градиент с верхним посевом в один миллион клеток до низкой плотности посева в 4 000 клеток. Затем распределите 100 микролитров среды KSR DMSO в 96-луночные пластины с низким креплением и добавьте 100 микролитров разбавления семян клеток.Инкубируйте низкую насадочную пластину в течение пяти дней. Смените 50% среды на третий-четвертый день после посева, когда сфероиды станут достаточно компактными. На пятый день смените среду на среду созревания гепатоцитов и культивируйте в ней клетки еще от семи до 10 дней, меняя среду каждые 48 часов.После культивирования клеток в течение 4, 8, 15 и 24 дней с использованием метода дифференцировки, описанного ранее, удаляют среду. Инкубируйте клетки с предварительно подогретыми фиксаторами, содержащими 4% параформальдегида, в PBS в течение 10 минут. Далее откажитесь от фиксатора и промойте клетки PBS два раза по пять минут каждый.Немедленно добавьте 0,1% раствор Triton X-100 и пропекайте клетки в течение пяти минут перед двумя промывками PBS. Добавьте блокирующий раствор из PBS и 5% бычьего сывороточного альбумина или BSA, прежде чем поместить клетки на коромысло на один час при комнатной температуре. Разбавьте первичные антитела в буфере для разведения 1% BSA PBS и добавьте 50 микролитров разведения антител на лунку.Откажитесь от раствора антител после часовой инкубации при комнатной температуре и дайте три промывания по пять минут каждое с использованием PBS. Добавьте 50 микролитров вторичных антител, разведенных в буфере для разведения, в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение 30 минут при комнатной температуре. После трехкратной промывки ячеек PBS в течение пяти минут каждый установите покровные стекла с монтажными носителями, содержащими DAPI, для микроскопического анализа.Осторожно выбросьте питательные среды, не касаясь сфероидов, добавьте свежеприготовленный PBS с 0,1% раствором Triton X-100 и инкубируйте в течение пяти минут, чтобы проникнуть в клетки. Промойте сфероиды два раза со средой, медленно пипетируя среду. Затем инкубируйте сфероиды с 50 микролитрами первичных антител в течение одного часа.После этого осторожно удалите излишки раствора антител и трижды смывайте среду. Приготовьте соответствующие вторичные антитела, такие как козий антимышиный IgG Cy3, козий антимышиный IgG 488 и кролиководческий антикуриный IgG Texas Red в PBS с 1% BSA и добавьте 50 микролитров разбавления антител в лунку до 20 минут инкубации в инкубаторе углекислого газа. Снова трижды промойте со средой до 30 минут инкубации в инкубаторе.Включите флуоресцентный источник света за 10 минут до использования. Включите компьютер и откройте программное обеспечение для работы с изображениями. Используйте цель 4-кратного увеличения, нажав кнопку 4X на панели инструментов, чтобы выбрать правильную масштабную линейку.Затем поместите 96-луночную пластину на центральную пластину сцены. Включите светодиодный источник света, используйте фильтр яркого поля и установите пластину на интересующий колодец с помощью ручки регулировки ступени оси XY. Перейдите на световой путь камеры и нажмите кнопку в реальном времени в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы визуализировать изображение на экране.Убедитесь, что сфероид центрирован с помощью ручек оси XY, и сфокусируйтесь с помощью ручки грубой или тонкой фокусировки. Затем выберите метод наблюдения яркого поля на панели инструментов, установите автоматические настройки экспозиции и нажмите кнопку снимка на панели управления камерой, чтобы сделать снимок. Затем сохраните картинку в виде файла vsi, используя соответствующее имя в интересующей папке.Поместите экранирующую пластину окружающего света, чтобы выключить светодиодную подсветку и заменить фильтр для возбуждения B. Затем выберите метод наблюдения 488. Откройте затвор, сделайте снимок, нажав кнопку моментального снимка, закройте затвор и сохраните файл как vsi.Повторите процесс с фильтром для возбуждения G, чтобы повторить процесс для каждой интересующей скважины. Морфологические изменения в процессе дифференцировки печени показали, что BD-PSC дифференцировались в гепатоциты в три этапа. Первый этап представлял собой дифференцировку в энтодермальные клетки.Вторая дифференцировка в клетки-предшественники печени, демонстрирующие типичную полигональную морфологию. И третье, созревание до гепатоцитов. Иммунофлуоресцентный анализ показал сильную экспрессию маркеров-предшественников энтодермы печени человека, таких как альфа-фетопротеин или APF и транстиретин или TTR, в клетках на первой стадии процесса дифференцировки печени на L4-8 день.Однако их экспрессия снизилась на 15-й день. Экспрессия альбумина или ALB и четвертого ядерного фактора гепатоцитов альфа или HNF4 альфа появлялась сначала в L4, увеличивалась на протяжении всего времени дифференцировки от L4 до L15 и достигала сильной и стабильной экспрессии во время созревания от L15 до L24. Спонтанная агрегация клеток наблюдалась в пластинах с низким прикреплением, содержащих индукцию гепатоцитов или созревание среды, инициированной образованием сфероидов.Наблюдалась последовательная корреляция между стероидным сфероидом и переменным числом клеток. Сфероиды, сформированные и дифференцированные в L14 и живые, окрашенные антителами, показали потенциальную функциональную активность сфероидов, полученных из BD-PSCs. Подготовка мононуклеарных клеток к перепрограммированию является наиболее важным этапом в этой процедуре.Создание сфероидов печени человека является первым шагом к созданию органоидов in vitro, упрощенной версии органа в 3D с микроанатомией, аналогичной анатомии in vivo. Органоиды, созданные в лаборатории, используются для изучения органогенеза, развития заболеваний и питательных веществ.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Manufacturing Devices and Instruments for Easier Rat Liver Transplantation

Производство приборов и инструментов для более легкого Трансплантация печени крыс

Orthotopic rat liver transplantation is a popular model, which has been shown in a recent JoVE paper with the use of the "quick-linker" device. This ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Изготовление Перевернутый коллоидный кристалл поли (этиленгликоль) строительные леса: трехмерная Cell Culture платформа для печени тканевой инженерии

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Многофотонные микроскопические наблюдения сосудов в ткани печени мыши

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Фибробласт, полученный из искусственной соединительной ткани человека для скрининга

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...