Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا الدعم المقدم من تمويل التخزين المسبق لصندوق محاذاة الصناعة (IAF-PP) (H18 / 01 / a0/021 و H18 / AH / a0 / 001) من A * STAR ، سنغافورة.

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J. ، A.B. ، R.L. ، و JN هم موظفون في Thermo Fisher Scientific. ليس لدى A.L. و S.O. أي تضارب في المصالح.

في هذا العمل ، أظهرنا القدرة على إغلاق وشبه أتمتة تفكك hMSC والغسيل والحصاد على مقاعد البدلاء باستخدام أداة طرد مركزي معاكسة. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في سير العمل بأكمله في التأكد من توصيل الأنابيب وفقا للبروتوكول المحدد مسبقا المحدد في منشئ بروتوكول نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس. الإعداد والتشغيل بسيطان ، وكان الوقت المستغرق لمعالجة حوالي 2 لتر من الثقافة من قارورة من 10 طبقات من تجميع المجموعة إلى حصاد الخلايا حوالي 60 دقيقة. تتمثل إحدى الخطوات المحددة في سير العمل هذا في نقل السوائل من القارورة متعددة الطبقات إلى أكياس النقل المتصلة بأداة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس. لا يمكن تشغيل المجموعة ذات الاستخدام الواحد عالية التدفق إلا بمعدل تدفق أقصى يبلغ 165 مل / دقيقة ، وقد يكون هذا تحديا للمعالجة ، على سبيل المثال ، قارورة من 40 طبقة. لتسريع عملية نقل السوائل ، يمكن استخدام مضخات خارجية ذات معدل تدفق مرتفع لنقل محتويات التربسين إلى كيس نقل أولا ، يليها غسل / تركيز وحصاد الخلايا من كيس النقل باستخدام نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على تمرير الخلايا من 4 طبقات إلى 10 طبقات متعددة الطبقات. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحسين نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس لغسل hMSCs المذابة والحصاد المباشر والتركيب المتوسط في قوارير متعددة الطبقات لبدء قطار البذور. وتجدر الإشارة إلى أن الحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوبة لتشكيل الطبقة المميعة في غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس هو حوالي 30 مليون خلية ، والحد الأقصى الموصى به للمعالجة لكل دفعة هو 20 لترا.
في الوقت الحالي ، لا ينصح بربط مجموعة الأنابيب المخصصة بالقارورة متعددة الطبقات في خزانة السلامة البيولوجية وتعقيم أجزاء المكونات في إعداد cGMP. كبديل ، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية لمجموعة أنابيب معقمة بأشعة غاما مخصصة للموردين. يوفر الموردون الذين يقدمون قوارير متعددة الطبقات أيضا خيار التركيب المسبق للقوارير مع مجموعات الأنابيب المرغوبة ، بما في ذلك مرشح 0.2 ميكرومتر ، وتعقيم جاما للزي بأكمله. سيضمن ذلك إغلاق القوارير متعددة الطبقات والأنابيب المرفقة حقا ، مما يعني أنه يمكن إكمال العملية على المقعد في إعداد غرفة نظيفة من الفئة C.
لا تقتصر هذه العملية التي تستخدم نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس على الخلايا المستزرعة القائمة على الالتصاق في وعاء متعدد الطبقات ويمكن تكييفها مع منصات توسيع الخلايا الديناميكية (الخزان المقلوب أو المفاعلات الحيوية الموجية) ومنصات توسيع الخلايا الثابتة (المنفذة للغاز). على وجه التحديد ، بالنسبة ل hMSCs الموسعة في ثقافات الناقلات الدقيقة 3D ، يمكن تحسين البروتوكولات على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس لحصاد وغسل وصياغة hMSCs المنفصلة عن الناقلات الدقيقة. 
بشكل عام ، أدى الاهتمام المتزايد بتطوير العلاجات الخلوية الانتقالية مع تحسين قوة العملية وموثوقيتها إلى تطوير منصات معالجة الخلايا الآلية المغلقة. هذه الأنظمة ضرورية ، لأنها تقلل من عدد خطوات المناولة ، وتمنع التلوث المحتمل عن طريق التوصيلات المعقمة ، وتقلل من تكاليف التصنيع عن طريق تقليل العمالة وتعزيز الاستخدام الفعال لمساحة الغرفة النظيفة21. تماشيا مع هذا ، يدرك العديد من مطوري منتجات العلاج بالخلايا الذين يسعون للحصول على موافقة تنظيمية لترجمة علاجاتهم أهمية إغلاق العملية وتنفيذ الأتمتة الكاملة أو شبه الأتمتة في وقت مبكر من مرحلة تطوير العملية14،31،32.
مع استخدام وسيط SFM XF الصديق للتنظيم ، جنبا إلى جنب مع الكواشف المساعدة المتوافقة مع 21 CFR GMP Part 11 وإرشادات الجودة الدولية ، ستكون هذه العملية شبه الآلية مناسبة بسهولة للتصنيع السريري. لقد أظهرنا قابلية استنساخ العملية المغلقة والحفاظ على جودة WJ-MSCs. إن تحسين كفاءة وسلامة زراعة الخلايا القائمة على الالتصاق في قوارير متعددة الطبقات لن يفيد مجال علاج hMSC فحسب ، بل يفيد أيضا الشركات في مجال تخزين خط الخلايا وإنتاج الفيروسات الملتصقة.

تعد الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) مرشحا رائعا للتطبيقات السريرية ، سواء في هندسة الأنسجة أو في العلاجات الخلوية ، نظرا لإمكاناتها العلاجية وقدرتها العالية على التجديد الذاتي للنمو في المختبر ، والتي تعتبر ضرورية لتوليد جرعات ذات صلة سريريا من الخلايا1،2،3. وفقا ل ClinicalTrials.gov ، هناك أكثر من 1000 تجربة سريرية قيد التحقيق حاليا لحالات مرضية مختلفة4. بالنظر إلى خلفية الاهتمام المتزايد باستخدام hMSCs ، فإن المزيد من التجارب السريرية وموافقات السوق وشيكة في المستقبلالقريب 5,6. ومع ذلك ، فإن تصنيع hMSCs لديه العديد من التحديات المتأصلة من حيث التباين من دفعة إلى أخرى ، واستخدام المواد الخام عالية الخطورة ، والمخاوف المتعلقة بالتلوث بسبب العديد من العمليات المفتوحة واليدوية ، حيث يتضمن التصنيع عمليات وحدة متعددة ، وارتفاع تكاليف العمالة ، وتكلفة التوسع أو التوسع ، والعقبات التنظيمية6،7،8،9،10 ، 11,12. ولا تزال هذه القضايا تشكل عائقا كبيرا أمام الوصول إلى الأسواق في الحاضر والمستقبل.
إن تطوير حلول التصنيع المغلقة والمعيارية والآلية واستخدام الكواشف المساعدة منخفضة المخاطر من شأنه أن يعالج هذه التحديات. سيضمن ذلك أيضا جودة المنتج المتسقة ، ويقلل من احتمالية فشل الدفعات بسبب الخطأ البشري ، ويقلل من تكاليف العمالة ، ويحسن توحيد العمليات والامتثال التنظيمي ، كما هو الحال فيما يتعلق بحفظ سجلات الدفعات الرقمية8،12،13،14. لتكون قادرا على الحصول على جرعة ذات صلة سريريا من الخلايا ، سواء كانت ذاتية أو خيفية ، فإن التصنيع المبسط الذي يتضمن توسيع الخلايا الأولية ومعالجة المصب بطريقة مغلقة وآلية أمر بالغ الأهمية.
بالنسبة لتوسيع hMSC في المنبع ، فإن طريقتي التصنيع الأكثر شيوعا المستخدمتان حاليا هما التوسع (2D أحادي الطبقة) والتوسع (نظام التعليق القائم على الناقل الصغير ثلاثي الأبعاد) 15،16،17،18. الطريقة الأكثر تقليدية والمعتمدة على نطاق واسع لتوسيع hMSC هي الثقافة أحادية الطبقة 2D بسبب انخفاض تكلفة الإنتاج وسهولة الإعداد19.
تستخدم القوارير متعددة الطبقات المكونة من صواني ذات سطح مستو مكدسة داخل وعاء استزراع بشكل شائع لتوسيع نطاق إنتاج hMSC. تأتي هذه الأنظمة عادة في أوعية استزراع من طبقة 1 إلى 40 طبقة20 ويتم التعامل معها يدويا داخل خزانات السلامة الأحيائية. تتضمن خطوات المعالجة أثناء مرور الخلايا وحصادها توزيع وصب وسائط التمدد يدويا ، وكاشف التفكك ، وغسل المخزن المؤقت عن طريق سحب الوعاء بأكمله أو إمالته جسديا. إلى جانب ذلك ، يعد التعامل مع وحدات متعددة أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا نظرا لحجمها ووزنها الهائل.
بعد ذلك ، يعد ما بعد الحصاد من القوارير متعددة الطبقات ، والطرد المركزي لتبادل الوسائط ، وغسل الخلايا ، وتقليل الحجم خطوات أساسية عبر سير عمل تصنيع الخلايا بالكامل21. الطرد المركزي التقليدي على الطاولة هو عملية مفتوحة ويدوية في الغالب تتضمن العديد من الخطوات ، مثل نقل تعليق الخلية إلى أنابيب أو زجاجات مغطاة داخل خزانة السلامة البيولوجية ، وتدوير الخلايا ، واستنشاق المادة الطافية يدويا ، وإعادة تعليق الخلية مع المخزن المؤقت ، وغسل الخلايا المتكرر. هذا يزيد بشكل كبير من خطر التلوث بسبب فتح وإغلاق الأغطية وفرص فقدان حبيبات الخلية أثناء عملية الشفط / السحب اليدوي22. في سياق التعامل مع أنظمة الاستزراع متعددة الطبقات للخلايا القائمة على الالتصاق مثل hMSCs ، سيحتاج المشغل إلى المرور بعملية شاقة من التنقل بين أجهزة الطرد المركزي وخزانة السلامة البيولوجية بشكل متكرر والتعامل مع وحدة ثقيلة في نفس الوقت. هذه الخطوات اليدوية شاقة ، وتشكل مخاطر من حيث الأخطاء البشرية والتلوث ، ويجب إجراؤها في بيئة غرفة نظيفة من الفئة ب ، وهي مكلفة23. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عملية الطرد المركزي اليدوية التقليدية غير قابلة للتطوير ويمكن أن تسبب القص الخلوي والإجهاد ؛ وبالتالي ، فإن تعظيم استعادة الخلايا ، والقدرة على البقاء ، وكفاءة غسل الشوائب المتبقية هي تحديات رئيسية أخرى22. يتطلب التصنيع التجاري على نطاق cGMP للعلاجات الخلوية حلول أتمتة معيارية مغلقة لتقليل مخاطر التلوث ، وضمان جودة المنتج المتسقة ، وتقليل تكاليف العمالة والإنتاج ، وزيادة موثوقية العملية24,25. يمكن التعامل مع القوارير متعددة الطبقات كنظام مغلق من خلال وجود مرشح معقم 0.2 ميكرومتر في أحد المنافذ لتسهيل تبادل الغازات المعقمة ومنفذ ثان متصل بشكل معقم عبر موصلات أو أنبوب ملحوم مباشرة بأداة معالجة الخلايا الآلية لحصاد الخلايا. لقد عملنا على إغلاق وأتمتة معظم خطوات تمرير وحصاد WJ-hMSC من خلال تقييم جهاز طرد مركزي مغلق مبتكر للتدفق المعاكس مخصص لتصنيع المنتجات القائمة على الخلايا أو الجينات أو الأنسجة. يتمتع جهاز الطرد المركزي ذو التدفق المعاكس أيضا بالمرونة اللازمة لأداء مجموعة متنوعة من تطبيقات معالجة الخلايا ، مثل فصل الخلايا بناء على الحجم ، والتبادل المتوسط / العازل ، والتركيز ، والحصاد لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا8،26،27،28. تستخدم الأداة مجموعة مغلقة للاستخدام مرة واحدة يمكن توصيلها بشكل معقم باستخدام لحام الأنبوب أو الموصلات المعقمة لنقل الأكياس أو يمكن توصيلها مباشرة بأي منصة تمدد من اختيارك.
في هذه الدراسة ، قمنا بتصميم مجموعة أنابيب مخصصة للسماح بالوصلات المعقمة المغلقة بين مجموعة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس ذات الاستخدام الواحد والقارورة متعددة الطبقات. لقد قمنا بتحسين بروتوكول لفصل وغسل وحصاد WJ-MSCs إنزيميا من القارورة متعددة الطبقات بطريقة مغلقة تماما وشبه آلية خلال جولة واحدة. تم تمييز WJ-hMSCs المحصودة من حيث النقاء (تحليل علامات السطح) والفعالية (CFU-F ، والتمايز ثلاثي النسب ، وملامح إفراز السيتوكينات) لضمان أن المنتج النهائي يلبي سمات الجودة الحرجة (CQAs) لإطلاق الكثير.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

يتم حاليا استكشاف الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) كطريقة علاجية واعدة قائمة على الخلايا لمختلف الأمراض ، مع توقع المزيد من الموافقات في السوق للاستخدام السريري خلال السنوات القليلة المقبلة. لتسهيل هذا الانتقال ، تعد معالجة اختناقات الحجم ، وقابلية التكرار من دفعة إلى دفعة ، والتكلفة ، والامتثال التنظيمي ، ومراقبة الجودة أمرا بالغ الأهمية. يمكن معالجة هذه التحديات عن طريق إغلاق العملية واعتماد منصات التصنيع الآلي. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير عملية مغلقة وشبه آلية لتمرير وحصاد هلام وارتون (WJ) المشتق من hMSCs (WJ-hMSCs) من قوارير متعددة الطبقات باستخدام الطرد المركزي المعاكس. تم توسيع WJ-hMSCs باستخدام وسيط خال من xeno المتوافق مع اللوائح التنظيمية (SFM XF) ، وأظهرت تكاثر خلايا مماثل (مضاعفة السكان) ومورفولوجيا ل WJ-hMSCs الموسعة في الوسائط الكلاسيكية المحتوية على المصل. أظهر بروتوكول الحصاد شبه الآلي المغلق الخاص بنا استردادا عاليا للخلايا (~ 98٪) وقابلية للحياة (~ 99٪). حافظت الخلايا التي تم غسلها وتركيزها باستخدام الطرد المركزي للتدفق المعاكس على تعبير علامة سطح WJ-hMSC ، ووحدات تشكيل المستعمرات (CFU-F) ، وإمكانية تمايز النسب الثلاثي ، وملامح إفراز السيتوكين. يمكن تطبيق بروتوكول حصاد الخلايا شبه الآلي الذي تم تطويره في الدراسة بسهولة على المعالجة الصغيرة والمتوسطة الحجم لمختلف الخلايا الملتصقة والمعلقة عن طريق الاتصال المباشر بمنصات توسيع الخلايا المختلفة لأداء تقليل الحجم والغسيل والحصاد بحجم إنتاج منخفض.

تم الحفاظ على بنك الخلايا الرئيسية WJ-hMSC (MCB) بعد الذوبان لثلاثة مقاطع متتالية (p1-p4) في وسط كلاسيكي يحتوي على مصل لإنتاج ما يكفي من بنوك الخلايا العاملة (WCBs) للتجارب. تم إذابة وتوسيع p4 WCBs في كل من الوسط المحتوي على المصل ووسط SFM XF لثلاثة ممرات أخرى (p4-p7) في قوارير T-175. تكيفت WJ-MSCs بشكل جيد عند توسيعها في وسط SFM XF وتمكنت من الحفاظ على انتشار مستقر مماثل لذلك الموجود في الوسط المحتوي على المصل (الشكل 2A). ومع ذلك ، أظهرت الخلايا الموسعة في وسط SFM XF مورفولوجيا أطول قليلا على شكل مغزل يشبه الخلايا الليفية ، مما أدى إلى حجم خلية أكبر قليلا (الشكل 2B) بمتوسط ~ 17 ميكرومتر مقارنة ب ~ 15 ميكرومتر في وسط يحتوي على المصل. في كلتا الحالتين المتوسطتين عبر الممرات الثلاثة ، وصلت WJ-hMSCs باستمرار إلى أقصى كثافة خلوية لها تبلغ ~ 2.3 × 104 خلايا / سم2 ووقت مضاعفة السكان ~ 34 ساعة (الشكل 2C ، D).
لتوسيع WJ-hMSC على نطاق واسع في نظام مغلق ، قمنا بتوسيع قطار البذور ل WJ-hMSCs أولا في دورق من 4 طبقات ، وبعد ذلك ، في دورق متعدد الطبقات من 10 طبقات. عند التقاء حوالي 80٪ -90٪ بعد 4 أيام من الاستزراع ، حصدنا 9.6 × 10 7 ± 0.9 × 107 و 2.3 × 10 8 ± 0.2 × 108 خلايا للمكدسات المكونة من 4 طبقات و 10 طبقات ، على التوالي. تم الوصول إلى كثافة خلايا أعلى تبلغ 3.6 × 10 4-3.8 × 104 خلايا / سم2 مقارنة بقوارير T-175 ، مما يعني أن المداخن سمحت بتوسع أفضل للخلايا بما يصل إلى سبعة أضعاف.
علاوة على ذلك ، تم حصاد WJ-hMSCs الموسعة في أوعية الاستزراع المكونة من 10 طبقات مباشرة باستخدام الطرد المركزي المعاكس. كان من السهل إنشاء الاتصال المعقم بالمجموعة ذات الاستخدام الواحد لنقل السوائل المباشر بمعدل تدفق أقصى يبلغ 165 مل / دقيقة باستخدام المضخة التمعجية للأداة. تم تحقيق عملية حصاد الخلايا شبه الآلية عن طريق حصاد الخلايا أولا باستخدام التفكك الأنزيمي ، وتحميل الخلايا في غرفة التدفق المعاكس لتقليل الحجم والتركيز ، ثم الغسيل باستخدام مخزن الغسيل المؤقت ، والذي كان حوالي 3 أضعاف حجم غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس. علاوة على ذلك ، تم بعد ذلك تركيز الخلايا المغسولة وحصادها إلى حجم الحصاد المطلوب المحدد مسبقا في البروتوكول. تم تصميم خطوات المعالجة المستخدمة لمعالجة الخلايا شبه الآلية لمحاكاة سير عمل الحصاد اليدوي. لقد حققنا انخفاضا في الحجم بمقدار 10 أضعاف ، مما أدى إلى توليد تركيزات خلايا تصل إلى 5.3 مليون خلية / مل. كان البروتوكول قادرا على تحقيق استرداد عالي للخلايا عند ~ 98٪ وقابلية عالية للخلية عند ~ 99٪ باستمرار لجميع عمليات التشغيل المستقلة الثلاثة (الشكل 3A-C).
أجرينا فحوصات واسعة لتوصيف الخلايا لتحديد سمات الجودة الحرجة لحصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي المعاكس مقارنة بالطرد المركزي اليدوي. لاختبار هوية WJ-hMSCs ، تم تحليل علامات سطح الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما هو موضح في الشكل 4A ، أظهرت WJ-hMSCs التي تم حصادها باستخدام كلتا الطريقتين ملامح علامات السطح المميزة وفقا للوائح ISCT ، والتعبير الإيجابي عن CD73 و CD90 و CD105 ، بالإضافة إلى التعبير السلبي عن CD34 و CD45. بعد ذلك ، لتقييم الإمكانات المستنسخة ل WJ-hMSCs ، تم إجراء فحوصات CFU-F. كما هو موضح في الشكل 4B ، أظهرت الخلايا التي تم حصادها من الطرد المركزي عكس التدفق إمكانات CFU-F مماثلة مقارنة بالخلايا التي يتم حصادها بواسطة الطرد المركزي اليدوي (21٪ ± 1٪ مقابل 20٪ ± 1٪ على التوالي). علاوة على ذلك ، كما هو موضح في الشكل 4C ، احتفظت الخلايا التي تم حصادها بالطرد المركزي بعد التدفق المعاكس بالقدرة على التمايز إلى خلايا دهنية وبانيات عظمية وخلايا غضروفية مشابهة للخلايا في طريقة الطرد المركزي اليدوي. أخيرا ، قمنا بالتحقيق في 18 ملفا مختلفا لإفراز السيتوكين للخلايا باستخدام المقايسات المناعية المتعددة. كما هو موضح في الشكل 4D ، حافظت الخلايا التي تم غسلها وتركيزها باستخدام الطرد المركزي بعد التدفق المعاكس على ملامح إفراز السيتوكين ، وكانت الملامح قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في العينة المأخوذة قبل غسل / تركيز الخلايا (الطرد المركزي قبل التدفق المعاكس).
بشكل عام ، لقد أظهرنا توسعا فعالا في hMSC في نظام زراعة SFM XF ، وأسفرت الخلايا التي تم غسلها وتركيزها باستخدام نظام الطرد المركزي المغلق والآلي للتدفق المعاكس عن استعادة عالية للخلايا وصلاحيتها بعد الغسيل ويمكنها الحفاظ على نمطها الظاهري ووظائفها. يمكن للعملية شبه الآلية المغلقة التي تم تطويرها في هذه الدراسة أن توفر اتساقا في جودة المنتج من حيث الاسترداد النهائي ل WJ-MSC ، كما يتضح من ثلاث عمليات تشغيل مستقلة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> الشكل 1: تكوين وتجميع مجموعة أدوات عالية التدفق للاستخدام مرة واحدة لحصاد وغسل وتركيز hMSCs . (أ) مخطط المجموعة بعد توصيل الأكياس بما يتماشى مع الأنبوب المعني. (ب) الدورق متعدد الطبقات المكون من 10 طبقات المتصل بمجموعة الاستخدام الفردي عالية التدفق مع مجموعة الأنابيب المخصصة. (ج) تصور لطبقة الخلية المميعة المستقرة المتكونة في غرفة التدفق المعاكس عبر وظيفة الكاميرا الممكنة في واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج الطرد المركزي للتدفق المعاكس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> الشكل 2: مقارنة بين مورفولوجيا الخلية وتمدد hMSCs في الوسط المحتوي على المصل ووسط SFM XF. (أ) مورفولوجيا الخلية التمثيلية ل hMSCs في وسط المصل الكلاسيكي ووسط SFM XF. أظهرت الخلايا الموسعة SFM XF مورفولوجيا أطول على شكل مغزل تشبه الخلايا الليفية المميزة ، في حين أن الخلايا المزروعة في وسط يحتوي على مصل أظهرت مورفولوجيا أكثر تسطحا. (ب) متوسط حجم MSC بين الوسط المحتوي على المصل ووسط SFM XF ، مقاسا بواسطة عداد خلية آلي (n = 3). من الواضح أن الخلايا الموسعة SFM XF كانت بشكل عام أكبر من الخلايا الموسعة في المصل عبر مقاطع مختلفة. إجمالي إنتاج الخلية في مقاطع مختلفة (ن = 3) (ج) من حيث الخلايا لكل مساحة سطح مزرعة و (د) مستويات مضاعفة السكان. تم الحصول على مستويات مماثلة من إنتاجية الخلايا بين وسط SFM XF والوسط المحتوي على المصل عبر ممرات مختلفة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> الشكل 3: توصيف الخلايا المعالجة باستخدام نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس. أ: مجموع الخلايا القابلة للحياة قبل الغسيل والتركيز وبعدهما. (ب) تم تخفيض الحجم بمقدار 10 أضعاف معالجة الطرد المركزي بعد التدفق المعاكس. (ج) التعافي التام للخلايا وصلاحيتها. يتم حساب متوسط البيانات على مدى ثلاث مكررات بيولوجية (ن = 3) من عمليات الغسيل والتركيز. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> الشكل 4: تحليل سمات الجودة الحرجة. أ: البيانات التمثيلية من قياس التدفق الخلوي. (ب) صور تمثيلية توضح إجمالي CFU. (ج) صور مجهرية تمثيلية لتمايز النسب الثلاثي. (د) نتائج تحليل تعبير السيتوكين قبل وبعد معالجة الخلايا على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس (ن = 3). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: تسلسل حصاد hMSC بواسطة بروتوكول التربسين والغسيل والتركيز على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس ، بما في ذلك خطوات التحضير الأولية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

هنا ، نقدم بروتوكولا لحصاد الخلايا الملتصقة من قوارير متعددة الطبقات بطريقة مغلقة شبه آلية باستخدام نظام طرد مركزي معاكس. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لحصاد كل من الخلايا الملتصقة والمعلقة من منصات توسيع الخلايا الأخرى مع تعديلات قليلة على الخطوات الحالية.

معالجة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للتطبيقات السريرية باستخدام سير عمل مغلق شبه آلي

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

الطرد المركزي على الطاولة هو عملية مفتوحة ويدوية يصعب توسيع نطاقها. يوضح بروتوكولنا كيفية إغلاق وأتمتة تفكك وغسل وحصاد الخلايا الجذعية الوسيطة ، أو MSCs ، في جولة واحدة. الإعداد بسيط.يمكن تنفيذ العملية بأكملها خارج خزانة السلامة الأحيائية في مرفق cGMP من الفئة. تقلل المعالجة الآلية المغلقة للخلايا من خطوات المناولة اليدوية التي قد تكون عرضة للمخاطر وتمكن من الامتثال لممارسات التصنيع الجيدة cGMP. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع الخلايا الأخرى الموسعة في أنظمة الاستزراع متعددة الطبقات.يسمح نظام الطرد المركزي بالتدفق المعاكس بتعديل أي خطوات بروتوكول لتطبيقات مختلفة. وسيظهر هذا الإجراء الدكتور آلان لام ، عالم الموظفين من مجموعة المعالجة الحيوية للخلايا الجذعية في معهد تكنولوجيا المعالجة الحيوية ، نجم في سنغافورة. لبدء تجميع مجموعة أدوات الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس للاستخدام مرة واحدة ، قم بتوصيل المجموعة ذات الاستخدام الواحد بأكياس نقل PVC ذات الاستخدام الواحد عبر لحام الأنبوب ، كما هو موضح في الصورة.بعد ذلك ، داخل خزانة السلامة البيولوجية ، قم بتوصيل دورق متعدد الطبقات من 10 طبقات يحتوي على خلايا جذعية متوسطة بشرية مشتقة من هلام وارتون أو وجيلي HMSCs من وارتون بمجموعة الأنابيب المخصصة. انقل وعاء الاستزراع المكون من 10 طبقات المرفق مع مجموعة الأنابيب المخصصة إلى مقعد ولحامها بالخط E من المجموعة ذات الاستخدام الواحد. أيضًا. قم بلحام منفذ عينة معقمة لخط G من المجموعة ذات الاستخدام الفردي عالية التدفق.بعد ذلك ، قم بتوصيل خط الحصاد H بإغراء معقم ، مزود بحقنة سعة 50 ملليلتر. لإعداد تشغيل الجهاز ، قم بتشغيل الجهاز باستخدام مفتاح التبديل الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز وقم بتوصيل الكمبيوتر المحمول بمنفذ USBC على الجهاز باستخدام كابل USBC المرفق. قم بتشغيل واجهة المستخدم الرسومية للطرد المركزي Counterflow ، أو برنامج واجهة المستخدم الرسومية من سطح المكتب أو قائمة ابدأ وقم بتسجيل الدخول.بعد ذلك ، قم بتحميل البروتوكول بالنقر فوق حدد بروتوكول زر في صفحة الترحيب الرئيسية. بعد ذلك ، اضغط على زر إلغاء القفل الأزرق على الجهاز وافتح الباب الزجاجي لتحميل المجموعة المجمعة ذات الاستخدام الواحد على نظام الطرد المركزي المعاكس. ابدأ بتعليق الأكياس على خطافات الشماعات بترتيب يصطفها بشكل أفضل مع منافذ الأنبوب الموجودة على شرائط مستشعر الفقاعات مع وضع الدورق متعدد الطبقات المكون من 10 طبقات بزاوية.قم بمحاذاة المجموعة باستخدام زري موقع المجموعة. قم بتمديد أنبوب المضخة حول المضخة التمعجية واضغط على الموصل الأبيض على شكل لمبة في مكانه. قم بتوصيل غرفة الطرد المركزي عن طريق رفع الرافعة الفضية لحامل غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس وتأمينها عن طريق إعادة الرافعة إلى وضعها الرأسي.اضغط على الأنبوب من كل منفذ على المجموعة إلى المسارات على طول شرائط مستشعر الفقاعة. أغلق الباب بالضغط لأسفل على مزلاج الباب. ضرب زر البدء في واجهة المستخدم الرسومية.ستظهر قائمة تحقق. العناصر الأربعة الأولى هي فحوصات الأدوات ، في حين أن الأخيرين هما فحوصات المستخدم. في هذه المرحلة ، تأكد من تطابق الأكياس والوصلات مع صورة المجموعة وأن المشابك اليدوية مفتوحة.اضغط على تأكيد لإظهار شاشة مدخلات البروتوكول. قم بتعيين قيمة مربع حوار إدخال البيانات أو حجم الحصاد على أنها 45 ملليلتر واضغط على تأكيد. اضغط على زر البدء الأخضر على الجهاز لبدء تشغيل البروتوكول.بمجرد اكتمال التحضير الأولي ، تأكد من ضخ الوسط المستهلك بالكامل في كيس النفايات. في خطوات الإيقاف المؤقت كما هو موضح في جدول سير العمل ، ارفع القارورة متعددة الطبقات لأعلى ورجها لتوزيع المخزن المؤقت بالتساوي على جميع الأدراج. بمجرد الانتهاء ، ضع القارورة متعددة الطبقات المكونة من 10 طبقات مرة أخرى في موضع السحب الأصلي للخطوات التالية.في الخطوتين 20 و 23 ، تأكد من نقل الخلايا التربسينية بالكامل إلى الكيس الوسيط. امزج الكيس الوسيط جيدا يدويا في الخطوة 25. في الخطوة 26 ، استخدم حقنة إغراء سعة 2 ملليلتر لأخذ عينات من خلال منفذ أخذ العينات.في الخطوتين 29 و 30 ، تحقق من التكوين المستقر لطبقة الخلية المميعة. يجب أن يكون مثل طبقة الخلية المميعة الموضحة هنا. اكتمل التشغيل عند المنحدر لإيقاف الخطوة ، وسيتم إغلاق جميع قيم الضغط على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس تلقائيا.بعد اكتمال تشغيل البروتوكول ، اضغط على زر إلغاء القفل الأزرق على الجهاز وافتح الباب الزجاجي. قم بإغلاق خط الحصاد بشكل معقم باستخدام سدادة أنبوبية محمولة يدويا وانقل بعناية المحقنة المختومة المملوءة بحصاد الخلايا المركزة إلى خزانة الأمان البيولوجي لعد الخلايا والحفظ بالتبريد. افصل الغرفة مرة أخرى باستخدام الرافعة.اسحب موصل المصباح من تركيبته وارفع المجموعة بعناية بعيدا وتخلص منها في كيس بيولوجي. نظف الأداة باستخدام مناديل الإيثانول وأغلق الباب. أخيرا ، أغلق تطبيق واجهة المستخدم الرسومية أولا قبل إيقاف تشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.انتشرت MSCs Jelly من وارتون بشكل جيد عند توسيعها في كل من الوسائط المحتوية على المصل والخالية من المصل والخالية من الأجانب. ومع ذلك ، فإن أولئك الذين في وسط خال من المصل وخالي من xeno أظهروا مورفولوجيا أطول قليلا على شكل مغزل يشبه الخلايا الليفية ، مع متوسط حجم خلية أكبر يبلغ 17 ميكرون ، مقارنة ب 15 ميكرون في وسط المصل. في كلا الوسائطين عبر الممرات الثلاثة ، وصلت Jelly HMSCs في وارتون باستمرار إلى كثافة خلايا قصوى تبلغ حوالي 23000 خلية لكل سنتيمتر مربع ووقت مضاعفة السكان يبلغ 34 ساعة.عندما تم توسيع Jelly HMSCs في وارتون في أوعية استزراع من 10 طبقات باستخدام الطرد المركزي للتدفق المعاكس ، تم تحقيق انخفاض في الحجم بمقدار عشرة أضعاف ، مما أدى إلى توليد تركيزات خلايا تصل إلى 5.3 مليون خلية لكل ملليلتر. حقق البروتوكول باستمرار استردادا عاليا للخلايا يبلغ حوالي 98٪ وقابلية عالية للخلية تبلغ حوالي 99٪ لثلاث عمليات تشغيل مستقلة. عرضت جيلي HMSCs من وارتون التي تم حصادها باستخدام كلتا الطريقتين ملامح مميزة لعلامات السطح تكون CD73 و CD90 و CD105 إيجابية ، بالإضافة إلى CD34 و CD45 سلبية.أظهرت الخلايا التي تم حصادها من الطرد المركزي عكس التدفق مقايسة مماثلة لوحدة تشكيل المستعمرات أو إمكانات CFU ، مقارنة بتلك التي يتم حصادها بواسطة الطرد المركزي اليدوي. في كلتا الطريقتين ، احتفظت الخلايا بالقدرة على التمايز إلى خلايا دهنية وبانيات عظمية وخلايا غضروفية. كانت ملامح إفراز السيتوكين للخلايا بعد الطرد المركزي بعد التدفق المعاكس قابلة للمقارنة مع الطرد المركزي قبل التدفق المعاكس.تأكد من تجميع مجموعة الاستخدام الفردي بالإشارة إلى إعداد السرير ، واستبدالها في منشئ بروتوكول نظام الانصهار المركزي للتدفق المعاكس. يمكن استخدام بروتوكول غسل الشوائب المتبقية من المنتج النهائي في التطبيقات السريرية لدعم المستخدمين في تلبية معايير إطلاق الدفعة الخاصة بهم. لتسريع عملية نقل السوائل للمعالجة على نطاق واسع ، يمكن استخدام المضخات الخارجية لنقل محتويات التربسين إلى كيس نقل أولا ، بدلا من الحصاد مباشرة من القارورة متعددة الطبقات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...