Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) finansiering (H18/01/a0/021 og H18/AH/a0/001) fra A * STAR, Singapore.

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. og J.N. er ansatte hos Thermo Fisher Scientific. A.L. og S.O. har ingen interessekonflikter.

I dette arbejde har vi vist evnen til at lukke og semiautomatisere hMSC-dissociation og vaske og høste på bænken ved hjælp af et modstrømscentrifugeringsinstrument. Et af de kritiske trin i hele arbejdsgangen er at sikre, at slangerne er forbundet i henhold til den forudindstillede protokol, der er defineret i modstrømscentrifugeringssystemprotokolbyggeren. Opsætningen og betjeningen er enkel, og den tid, det tog at behandle omkring 2 liter kultur fra en 10-lags kolbe fra kitsamling til cellehøst, var omkring 60 minutter. Et af de begrænsende trin i denne arbejdsgang er væskeoverførslen fra flerlagskolben til overførselsposerne, der er forbundet med modstrømscentrifugeringsinstrumentet. High-flow engangssættet kan kun køres med en maksimal flowhastighed på 165 ml/min, og dette kan være en udfordring for behandling af f.eks. en 40-lags kolbe. For at fremskynde processen med væskeoverførsel kan eksterne højstrømspumper bruges til først at overføre det trypsiniserede indhold til en overførselspose, efterfulgt af vask/koncentrering og høstning af cellerne fra overførselsposen ved hjælp af modstrømscentrifugeringssystemet. Desuden kan denne protokol også anvendes til at passere celler fra 4-lags til 10-lags flerlagskolber. Længere opstrøms kunne modstrømscentrifugeringssystemet også optimeres til vask af optøede hMSC'er og direkte høst og mediumformulering i flerlagskolber for at starte frøstammen. Det skal bemærkes, at det mindste antal celler, der kræves for at danne det fluidiserede leje i modstrømscentrifugeringskammeret, er ca. 30 millioner celler, og det maksimale anbefalede volumen, der skal behandles pr. Batch, er 20 L.
I øjeblikket er fastgørelse af den brugerdefinerede slangeenhed til flerlagskolben i biosikkerhedsskabet og autoklavering af komponenternes dele ikke ønskelig i en cGMP-indstilling. Som et alternativ kunne en brugerdefineret gammasteriliseret rørsamling outsources til leverandører. Leverandører, der leverer flerlagskolber, tilbyder også mulighed for at formontere kolberne med ønskede slangesamlinger, herunder et 0,2 μm filter og gammasterilisering af hele udstyret. Dette ville sikre, at flerlagskolberne og de påsatte slanger virkelig er lukkede, hvilket betyder, at processen kan afsluttes på bænken i et renrum i klasse C.
Denne proces, der anvender modstrømscentrifugeringssystemet, er ikke begrænset til vedhængende baserede dyrkede celler i en flerlagsbeholder og kan tilpasses dynamiske (omrørte tank- eller bølgebioreaktorer) og statiske (gasgennemtrængelige) suspensionsbaserede celleudvidelsesplatforme. Specifikt for hMSC'er, der er udvidet i 3D-mikrobærerkulturer, kan protokoller optimeres på modstrømscentrifugeringssystemet til at høste, vaske og formulere hMSC'erne adskilt fra mikrobærere. 
Samlet set har stigende interesse for at udvikle translationelle cellulære terapier med forbedret procesrobusthed og pålidelighed ført til udviklingen af lukkede, automatiserede cellebehandlingsplatforme. Disse systemer er bydende nødvendige, da de reducerer antallet af håndteringstrin, forhindrer potentiel kontaminering af sterile forbindelser og reducerer produktionsomkostningerne ved at reducere arbejdskraften og forbedre den effektive brug af renrumsplads21. I tråd med dette er mange af de udviklere af celleterapiprodukter, der søger myndighedsgodkendelse til at oversætte deres terapier, opmærksomme på vigtigheden af at lukke processen og implementere fuld automatisering eller semiautomatisering allerede i procesudviklingsfasen 14,31,32.
Med brugen af regulatorisk venligt SFM XF-medium og sammen med hjælpereagenser, der er i overensstemmelse med 21 CFR GMP Part 11 og internationale kvalitetsretningslinjer, ville denne halvautomatiske proces være let egnet til klinisk fremstilling. Vi har vist reproducerbarheden af den lukkede proces og opretholdelsen af kvaliteten af WJ-MSC'erne. Forbedring af effektiviteten og sikkerheden ved dyrkning af klæbende celler i flerlagskolber ville ikke kun gavne hMSC-terapiområdet, men også virksomheder inden for cellelinjebank og vedhængende virusproduktion.

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) er en god kandidat til kliniske anvendelser, både inden for vævsteknik og i celleterapier, i betragtning af deres terapeutiske potentiale og høje selvfornyelsespotentiale til at vokse in vitro, hvilket er afgørende for at generere klinisk relevante doser af celler 1,2,3. Ifølge ClinicalTrials.gov er der over 1.000 kliniske forsøg i øjeblikket under undersøgelse for forskellige sygdomstilstande4. På baggrund af den stigende interesse for at bruge hMSC'er er flere kliniske forsøg og markedsgodkendelser nært forestående i den nærmeste fremtid 5,6. Fremstillingen af hMSC'er har imidlertid mange iboende udfordringer med hensyn til batch-til-batch-variabilitet, brugen af højrisikoråmaterialer, bekymringer vedrørende forurening på grund af mange åbne og manuelle processer, da fremstillingen involverer flere enhedsoperationer, højere lønomkostninger, omkostningerne ved udskalering eller opskalering og lovgivningsmæssige forhindringer 6,7,8,9,10, 11,12. Disse spørgsmål er fortsat en væsentlig hindring for nuværende og fremtidig markedsadgang.
Udviklingen af lukkede, modulopbyggede, automatiserede produktionsløsninger og anvendelse af lavrisikohjælpereagenser vil løse disse udfordringer. Dette vil også sikre ensartet produktkvalitet, mindske sandsynligheden for batchfejl på grund af menneskelige fejl, reducere lønomkostningerne og forbedre processtandardisering og overholdelse af lovgivningen, f.eks.med hensyn til digital batchregistrering 8,12,13,14. For at kunne opnå en klinisk relevant dosering af celler, det være sig autolog eller allogen, strømlinet fremstilling, der involverer opstrøms celleudvidelse og nedstrømsbehandling på en lukket, automatiseret måde, er afgørende.
Til opstrøms hMSC-ekspansion er de to mest almindelige fremstillingsmetoder, der i øjeblikket anvendes, udskalering (2D-monolag) og opskalering (3D-mikrobærerbaseret affjedringssystem)15,16,17,18. Den mest traditionelle og udbredte metode til hMSC-udvidelse er 2D-monolagsbaseret kultur på grund af de lave produktionsomkostninger og den nemme opsætning19.
Flerlagskolber bestående af bakker med flade overflader stablet i et dyrkningskar bruges almindeligvis til at udskalere hMSC-produktionen. Disse systemer leveres typisk i 1-lags til 40-lags kulturbeholdere20 og håndteres manuelt inde i biosikkerhedsskabe. Behandlingstrinnene under cellegennemløb og høstning involverer manuel dispensering og dekantering af ekspansionsmediet, dissociationsreagenset og vaskebufferen ved pipettering eller fysisk vipning af hele beholderen. Desuden er håndtering af flere enheder udfordrende og tidskrævende på grund af deres store størrelse og vægt.
Derefter er efterhøstning fra flerlagskolber, centrifugering til medieudveksling, cellevask og volumenreduktion vigtige trin på tværs af hele cellefremstillingsarbejdsgangen21. Konventionel bordcentrifugering er en for det meste åben og manuel proces, der involverer en lang række trin, såsom overførsel af cellesuspensionen til lukkede rør eller flasker inde i et biosikkerhedsskab, spinding af cellerne, manuel aspirering af supernatanten, celleopslæmning med bufferen og gentagne cellevask. Dette øger dramatisk både risikoen for kontaminering på grund af åbning og lukning af hætterne og chancerne for at miste cellepelleten under den manuelle aspirations-/pipetteringsproces22. I forbindelse med håndtering af flerlags kultursystemer til vedhængende celler såsom hMSC'er skal operatøren gennemgå en besværlig proces med at skifte mellem centrifugen og biosikkerhedsskabet gentagne gange og håndtere en tung enhed på samme tid. Disse manuelle trin er besværlige, udgør risici med hensyn til menneskelige fejl og kontaminering og skal udføres i et renrumsmiljø i klasse B, hvilket er dyrt23. Derudover er den konventionelle manuelle centrifugeringsproces ikke skalerbar og kan forårsage cellulær forskydning og stress; Således er maksimering af cellegenvinding, levedygtighed og udvaskningseffektiviteten af resterende urenheder andre store udfordringer22. Kommerciel cGMP-skalafremstilling af celleterapier kræver lukkede, modulære automatiseringsløsninger for at reducere risikoen for kontaminering, sikre ensartet produktkvalitet, reducere arbejds- og produktionsomkostninger og øge procespålideligheden24,25. Flerlagskolber kan håndteres som et lukket system ved at have et sterilt 0,2 μm filter i en af portene for at lette steril gasudveksling og en anden port aseptisk forbundet via stik eller rørsvejset direkte til et automatiseret cellebehandlingsinstrument til cellehøstning. Vi arbejdede hen imod at lukke og automatisere de fleste trin i WJ-hMSC-passering og høst ved at evaluere en innovativ lukket modstrømscentrifuge beregnet til fremstilling af celle-, gen- eller vævsbaserede produkter. Denne modstrømscentrifuge har også fleksibiliteten til at udføre en række cellebehandlingsapplikationer, såsom celleseparation baseret på størrelse, medium / bufferudveksling, koncentration og høst for en række celletyper 8,26,27,28. Instrumentet bruger et lukket engangssæt, der kan tilsluttes sterilt ved hjælp af rørsvejsning eller aseptiske stik til overførsel af poser eller kan tilsluttes direkte til enhver ekspansionsplatform efter eget valg.
I denne undersøgelse designede vi en brugerdefineret slangesamling for at muliggøre lukkede sterile forbindelser mellem engangsmodstrømscentrifugeringssættet og flerlagskolben. Vi optimerede en protokol til enzymatisk afmontering, vask og høst af WJ-MSC'er fra flerlagskolben på en helt lukket og halvautomatisk måde inden for en enkelt kørsel. De høstede WJ-hMSC'er blev karakteriseret for renhed (overflademarkøranalyse) og styrke (CFU-F, trilineagedifferentiering og cytokinsekretionsprofiler) for at sikre, at det endelige produkt opfyldte de kritiske kvalitetsattributter (CQA'er) for batchfrigivelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) undersøges i øjeblikket som en lovende cellebaseret terapeutisk modalitet til forskellige sygdomme, og der forventes flere markedsgodkendelser til klinisk brug i løbet af de næste par år. For at lette denne overgang er det afgørende at tackle flaskehalse i skala, lot-to-lot reproducerbarhed, omkostninger, overholdelse af lovgivningen og kvalitetskontrol. Disse udfordringer kan løses ved at lukke processen og indføre automatiserede produktionsplatforme. I denne undersøgelse udviklede vi en lukket og halvautomatisk proces til passering og høst af Whartons gelé (WJ)-afledte hMSC'er (WJ-hMSC'er) fra flerlagskolber ved hjælp af modstrømscentrifugering. WJ-hMSC'erne blev udvidet ved hjælp af regulatorisk kompatibelt serumfrit xenofrit (SFM XF) medium, og de viste sammenlignelig celleproliferation (populationsfordobling) og morfologi med WJ-hMSC'er udvidet i klassiske serumholdige medier. Vores lukkede halvautomatiske høstprotokol viste høj cellegendannelse (~ 98%) og levedygtighed (~ 99%). Cellerne vasket og koncentreret ved hjælp af modstrømscentrifugering opretholdt WJ-hMSC overflademarkørekspression, kolonidannende enheder (CFU-F), trilineagedifferentieringspotentiale og cytokinsekretionsprofiler. Den halvautomatiske cellehøstningsprotokol, der er udviklet i undersøgelsen, kan let anvendes til behandling i lille til mellemstor skala af forskellige vedhængende celler og suspensionsceller ved direkte forbindelse til forskellige celleudvidelsesplatforme for at udføre volumenreduktion, vask og høst med et lavt outputvolumen.

WJ-hMSC master cell bank (MCB) efter optøning blev opretholdt i tre på hinanden følgende passager (p1-p4) i klassisk serumholdigt medium til at producere nok fungerende cellebanker (WCB'er) til eksperimenterne. P4 WCB'erne blev optøet og udvidet i både serumholdigt medium og SFM XF-medium til yderligere tre passager (p4-p7) i T-175-kolber. WJ-MSC'erne tilpassede sig godt, når de blev udvidet i SFM XF-medium og var i stand til at opretholde stabil proliferation svarende til den i serumholdigt medium (figur 2A). Imidlertid udviste cellerne udvidet i SFM XF-medium lidt længere fibroblastlignende spindelformet morfologi, hvilket resulterede i en lidt større cellestørrelse (figur 2B) på et gennemsnit på ~ 17 μm sammenlignet med ~ 15 μm i serumholdigt medium. Under begge medieforhold på tværs af de tre passager nåede WJ-hMSC'erne konsekvent deres maksimale celletæthed på ~ 2,3 x 104 celler / cm2 og en populationsfordoblingstid på ~ 34 timer (figur 2C, D).
Til storstilet WJ-hMSC-udvidelse i et lukket system udførte vi en frøtogsudvidelse af WJ-hMSC'er først i en 4-lags kolbe og derefter i en 10-lags flerlagskolbe. Ved omkring 80% -90% sammenløb efter 4 dages dyrkning høstede vi 9,6 x 10 7 ± 0,9 x 107 og 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 celler til henholdsvis 4-lags og 10-lags stakke. En højere celletæthed på 3,6 x 10 4-3,8 x 104 celler / cm 2 blev nået sammenlignet med i T-175-kolberne, hvilket betyder, at stablerne tillod bedre celleudvidelse med op til syv gange.
Desuden blev WJ-hMSC'erne, der blev udvidet i 10-lags kulturbeholdere, høstet direkte ved hjælp af modstrømscentrifugering. Den sterile forbindelse til engangssættet var let at etablere til direkte væskeoverførsel ved en maksimal flowhastighed på 165 ml/min ved hjælp af instrumentets peristaltiske pumpe. Den halvautomatiske cellehøstningsproces blev opnået ved først at høste cellerne ved hjælp af enzymatisk dissociation, indlæse cellerne i modstrømskammeret for volumenreduktion og koncentrering og derefter vaske med vaskebuffer, hvilket var omkring 3x volumenet af modstrømscentrifugeringskammeret. Endvidere blev de vaskede celler derefter koncentreret og høstet til det ønskede høstvolumen, der var forudindstillet i protokollen. De behandlingstrin, der blev brugt til den halvautomatiske cellebehandling, blev designet til at efterligne den manuelle høstarbejdsgang. Vi opnåede en 10 gange volumenreduktion, hvilket resulterede i generering af cellekoncentrationer så høje som 5,3 millioner celler / ml. Protokollen var i stand til at opnå høj cellegendannelse ved ~ 98% og høj cellelevedygtighed ved ~ 99% konsekvent for alle tre uafhængige kørsler (figur 3A-C).
Vi udførte omfattende cellekarakteriseringsassays for at bestemme de kritiske kvalitetsegenskaber ved cellehøsten ved hjælp af modstrømscentrifugering sammenlignet med manuel centrifugering. For at teste identiteten af WJ-hMSC'erne blev celleoverflademarkører analyseret ved flowcytometri. Som vist i figur 4A viste WJ-hMSC'erne høstet ved hjælp af begge metoder karakteristiske overflademarkørprofiler i henhold til ISCT-reglerne, positiv ekspression af CD73, CD90 og CD105 samt negativ ekspression af CD34 og CD45. Dernæst blev CFU-F-assays udført for at evaluere WJ-hMSC'ernes klonogene potentiale. Som vist i figur 4B viste celler høstet fra modstrømscentrifugering et lignende CFU-F-potentiale sammenlignet med celler høstet ved manuel centrifugering (henholdsvis 21% ± 1% vs. 20% ± 1%). Som vist i figur 4C bevarede de centrifugeringshøstede celler efter modstrømmen desuden evnen til at differentiere sig til adipocytter, osteoblaster og chondrocytter svarende til cellerne i den manuelle centrifugeringsmetode. Endelig undersøgte vi 18 forskellige cytokinsekretionsprofiler af cellerne ved hjælp af multipleximmunoassays. Som vist i figur 4D vaskede og koncentrerede cellerne ved hjælp af post-modstrømscentrifugering opretholdt cytokinsekretionsprofiler, og profilerne var sammenlignelige med profilerne for prøven taget før vask/koncentrering af cellerne (præ-modstrømscentrifugering).
Samlet set har vi demonstreret effektiv hMSC-ekspansion i et SFM XF-kultursystem, og cellerne, der blev vasket og koncentreret ved hjælp af det lukkede, automatiserede modstrømscentrifugeringssystem, gav høj cellegenvinding og levedygtighed efter vask og kunne opretholde deres fænotype og funktionalitet. Den lukkede semiautomatiserede proces, der er udviklet i denne undersøgelse, kan levere konsistens i produktkvaliteten med hensyn til endelig WJ-MSC-genvinding, som det fremgår af tre uafhængige kørsler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Figur 1: Konfiguration og samling af engangssæt med højt flow til høst, vask og koncentrering af hMSC'er . (A) Kitdiagram, efter at poserne er blevet tilsluttet i overensstemmelse med den respektive slange. (B) Den 10-lags flerlagskolbe, der er forbundet med high-flow engangssættet med den brugerdefinerede slangeenhed. (C) Visualisering af det stabile fluidiserede celleleje, der dannes i modstrømskammeret via kamerafunktionen aktiveret i den grafiske brugergrænseflade til modstrømscentrifugeringssoftwaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Figur 2: Sammenligning af cellemorfologi og udvidelse af hMSC'er i serumholdigt medium og SFM XF-medium. (A) Den repræsentative cellemorfologi af hMSC'er i klassisk serummedium og SFM XF-medium. SFM XF-udvidede celler viste en længere, spindelformet, karakteristisk fibroblastlignende morfologi, mens cellerne dyrket i serumholdigt medium viste en mere flad morfologi. (B) Den gennemsnitlige MSC-størrelse mellem det serumholdige substrat og SFM XF-mediet, målt ved hjælp af en automatiseret celletæller (n = 3). Det er tydeligt at se, at SFM XF-udvidede celler generelt var større end serumudvidede celler på tværs af forskellige passager. Det samlede celleudbytte i forskellige passager (n = 3) (C) udtrykt i celler pr. Kulturoverfladeareal og (D) populationsfordoblingsniveauer. Lignende niveauer af celleudbytte blev opnået mellem SFM XF-mediet og serumholdigt medium på tværs af forskellige passager. Data udtrykkes som gennemsnittet ± standardafvigelsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Figur 3: Karakterisering af celler behandlet ved hjælp af modstrømscentrifugeringssystemet. (A) Samlede levedygtige celler før og efter vask og koncentration. (B) Der blev opnået en volumenreduktion på 10x efter modstrømscentrifugering. C) Cellernes samlede restitution og levedygtighed. Data beregnes som gennemsnit over tre biologiske replikater (n = 3) af vaske- og koncentrationskørsler. Data udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Figur 4: Analyse af kritiske kvalitetsegenskaber . (A) Repræsentative data fra flowcytometri. (B) Repræsentative billeder, der viser den samlede CFU. C) Repræsentative mikroskopiske billeder af trilineagedifferentieringen. (D) Cytokinekspressionsanalyseresultater før og efter behandling af cellerne på modstrømscentrifugeringssystemet (n = 3). Data udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Sekvens af hMSC-høsten ved trypsinisering, vask og koncentrationsprotokol på modstrømscentrifugeringssystemet, herunder de indledende primingtrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Her præsenterer vi en protokol til høst af klæbende celler fra flerlagskolber på en lukket halvautomatisk måde ved hjælp af et modstrømscentrifugeringssystem. Denne protokol kan anvendes til høst af både vedhængende og suspensionsceller fra andre celleudvidelsesplatforme med få ændringer af de eksisterende trin.

Human mesenkymal stamcellebehandling til kliniske applikationer ved hjælp af en lukket semi-automatiseret arbejdsgang

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

Bordcentrifugering er en åben og manuel proces, der er udfordrende at skalere. Vores protokol viser, hvordan man lukker og automatiserer dissociation, vask og høst af mesenkymale stamceller, eller MSC'er, i en enkelt kørsel. Opsætningen er enkel.Hele processen kan udføres uden for biosikkerhedsskabet i et klasse cGMP-anlæg. Lukket automatiseret cellebehandling reducerer manuelle håndteringstrin, der kan være tilbøjelige til risiko og muliggør cGMP-overholdelse. Denne metode kan anvendes på andre celletyper udvidet i flerlags kultursystemer.Modstrømscentrifugeringssystemet tillader ændring af alle protokoltrin til forskellige applikationer. Demonstrere denne procedure vil være Dr.Alan Lam, personaleforsker fra stamcellebioforarbejdningsgruppen ved Bioprocessing Technology Institute, A star i Singapore. For at starte centrifugeringssættet til engangsmodstrøm skal du forbinde engangssættet med PVC-overførselsposerne til engangsbrug via rørsvejsning som beskrevet på billedet.Derefter fastgøres en 10-lags flerlagskolbe indeholdende sammenflydende, Whartons Jelly-afledte humane mesenkymale stamceller eller Whartons Jelly HMSC'er inde i et biosikkerhedsskab til den brugerdefinerede slangesamling. Overfør den vedhæftede 10-lags kulturbeholder med den brugerdefinerede slangesamling til en bænk, og svejs den til linje E i engangssættet. Også. Svejs en steril prøveport til linje G i high-flow engangssættet.Tilslut derefter høstlinjen H til en steril lokke, udstyret med en 50 ml sprøjte. For at indstille instrumentkørslen skal du tænde instrumentet ved hjælp af vippekontakten bag på instrumentet og slutte den bærbare computer til USBC-porten på instrumentet ved hjælp af det medfølgende USBC-kabel. Kør den grafiske brugergrænseflade Counterflow Centrifuge eller GUI-softwaren fra skrivebordet eller startmenuen, og log ind.Indlæs derefter protokollen ved at klikke på knappen Vælg en protokol på velkomstsiden hoved. Tryk derefter på den blå oplåsningsknap på instrumentet, og åbn glasdøren for at lægge det samlede engangssæt på modstrømscentrifugeringssystemet. Start med at hænge poserne på bøjlekrogene i en rækkefølge, der passer dem bedst sammen med rørportene på boblesensorstrimlerne med den 10-lags flerlagskolbe placeret skråt.Stil sættet op med de to placeringsknapper. Stræk pumpeslangen rundt om den peristaltiske pumpe, og tryk det hvide pæreformede stik på plads. Fastgør centrifugekammeret ved at løfte sølvhåndtaget på modstrømscentrifugekammerbæreren og fastgøre det ved at føre håndtaget tilbage til lodret position.Tryk slangen fra hver port på sættet ind i sporene langs boblesensorstrimlerne. Luk døren ved at trykke ned på dørlåsen. Tryk på knappen Start på GUI'en.Der vises en tjekliste. De første fire punkter er instrumentkontrol, mens de sidste to er brugerkontrol. På dette tidspunkt skal du sikre dig, at poserne og tilslutningerne matcher kitbilledet, og at de manuelle klemmer er åbne.Tryk på Bekræft for at få vist skærmbilledet Protokolinput. Indstil værdien for dataindtastning eller høstvolumen til 45 ml, og tryk på Bekræft. Tryk på den grønne startknap på instrumentet for at starte protokolkørslen.Når den indledende priming er afsluttet, skal du sikre dig, at det brugte medium pumpes helt ud i affaldsposen. I pausetrin som markeret i arbejdsgangstabellen skal du løfte kolben med flere lag op og ryste den for at fordele bufferen ligeligt på alle bakkerne. Når du er færdig, skal du placere 10-lags flerlagskolben tilbage i sin oprindelige trækposition til de næste trin.I trin 20 og 23 skal du sikre dig, at de trypsiniserede celler overføres fuldstændigt til mellemposen. Bland mellemposen godt manuelt i trin 25. I trin 26 skal du bruge en to-milliliter lokkesprøjte til at prøve gennem prøveudtagningsporten.I trin 29 og 30 skal du kontrollere den stabile dannelse af det fluidiserede celleleje. Det skal være som det fluidiserede celleleje vist her. Kørslen er fuldført ved rampen for at stoppe trinnet, og alle knibeværdierne på modstrømscentrifugeringssystemet lukkes automatisk.Når protokolkørslen er fuldført, skal du trykke på den blå oplåsningsknap på instrumentet og åbne glasdøren. Aseptisk forsegler høstslangen ved hjælp af en håndbåret rørforsegler og overfør forsigtigt den forseglede sprøjte fyldt med den koncentrerede cellehøst til det biologiske sikkerhedsskab til celletælling og kryopræservering. Fjern kammeret igen ved hjælp af håndtaget.Træk pærestikket ud af beslaget, løft forsigtigt sættet væk, og bortskaf det i en pose med biologisk fare. Rengør instrumentet med ethanolservietter, og luk døren. Til sidst skal du først lukke GUI-applikationen, før du slukker for kontakten bag på instrumentet.Wharton's Jelly MSC'erne spredte sig godt, når de blev udvidet i både serumholdige og serumfrie, xenofrie medier. Imidlertid udviste de i serumfri, xenofrit medium lidt længere fibroblastlignende spindelformet morfologi med en større gennemsnitlig cellestørrelse på 17 mikron sammenlignet med 15 mikron i serummedium. I begge medier på tværs af de tre passager nåede Wharton's Jelly HMSC'erne konsekvent en maksimal celletæthed på ca. 23.000 celler pr. Kvadratcentimeter og en befolkningsfordoblingstid på 34 timer.Da Whartons Jelly HMSC'er blev udvidet i 10-lags kulturbeholdere ved hjælp af den demonstrerede modstrømscentrifugering, blev der opnået en ti gange volumenreduktion, der genererede cellekoncentrationer så høje som 5,3 millioner celler pr. Milliliter. Protokollen opnåede konsekvent en høj cellegendannelse på ca. 98% og en høj cellelevedygtighed på ca. 99% i tre uafhængige kørsler. Wharton's Jelly HMSC'er høstet ved hjælp af begge metoder viste karakteristiske overflademarkørprofiler, der er CD73, CD90 og CD105 positive, såvel som CD34 og CD45 negative.Cellerne høstet fra modstrømscentrifugering viste et lignende kolonidannende enhedsfibroblastassay eller CFU-potentiale sammenlignet med dem, der blev høstet ved manuel centrifugering. I begge metoder bevarede cellerne evnen til at differentiere sig til adipocytter, osteoblaster og chondrocytter. Cytokinsekretionsprofilerne for celler efter modstrømscentrifugering var sammenlignelige med centrifugering før modstrøm.Sørg for at samle engangssættet med henvisning til sengeopsætningen, fortræng det i denne Counterflow Centrifusion System Protocol Builder. Protokollen for vask af resterende urenheder fra slutproduktet kan anvendes i kliniske anvendelser for at hjælpe brugerne med at opfylde deres kriterier for frigivelse af partier. For at fremskynde processen med væskeoverførsel til storskala behandling kan eksterne pumper bruges til først at overføre det trypsiniserede indhold til en overførselspose i stedet for direkte høst fra flerlagskolben.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting-protokollen for et lille antal hæmatopoietisk stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Et Fluorogenic peptid kavalergang Assay til at screene for proteolytiske aktivitet: ansøgninger om coronavirus spike protein aktivering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...