Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות על תמיכת קרן התיאום התעשייתי Pre-Positioning Fund (IAF-PP) (H18/01/a0/021 ו-H18/AH/a0/001) מ-A*STAR, סינגפור.

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. ו- J.N. הם עובדים של Thermo Fisher Scientific. לא.ל. ולש.א. אין ניגודי עניינים.

בעבודה זו, הראינו את היכולת לסגור ולהפוך דיסוציאציה hMSC לאוטומטית למחצה ולשטוף ולקצור על הספסל באמצעות מכשיר צנטריפוגה נגד הזרם. אחד השלבים הקריטיים בתהליך העבודה כולו הוא לוודא שהצינורות מחוברים בהתאם לפרוטוקול המוגדר מראש המוגדר בבונה פרוטוקולי מערכת הצנטריפוגות של זרימה נגדית. ההתקנה והתפעול פשוטים, והזמן שלקח לעבד כ-2 ליטר תרבית מבקבוק בן 10 שכבות מהרכבת הערכה ועד קציר התאים היה כ-60 דקות. אחד השלבים המגבילים בתהליך עבודה זה הוא העברת נוזלים מהבקבוק הרב-שכבתי לשקיות ההעברה המחוברות למכשיר הצנטריפוגה נגד הזרם. הערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה יכולה להיות מופעלת רק בקצב זרימה מרבי של 165 מ"ל/דקה, וזה עשוי להיות מאתגר לעיבוד, לדוגמה, בקבוק של 40 שכבות. כדי לזרז את תהליך העברת הנוזלים, ניתן להשתמש תחילה במשאבות חיצוניות בעלות קצב זרימה גבוה כדי להעביר תחילה את תכולת הטריפסינציה לשקית העברה, ולאחר מכן לשטוף/לרכז ולקצור את התאים משקית ההעברה באמצעות מערכת הצנטריפוגות נגד הזרם. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם עבור תאים עוברים מ 4 שכבות ל 10 שכבות צלוחיות רב שכבתיות. בהמשך הזרם, מערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה יכולה להיות מותאמת גם לשטיפה של hMSCs מופשרים ולקציר ישיר ופורמולציה בינונית לצלוחיות רב-שכבתיות כדי להתחיל את רכבת הזרעים. יש לציין כי מספר התאים המינימלי הדרוש ליצירת המצע הנוזלי בתא הצנטריפוגה נגד הזרימה הוא כ-30 מיליון תאים, והנפח המרבי המומלץ לעיבוד לכל אצווה הוא 20 ליטר.
נכון לעכשיו, החיבור של מכלול הצינור המותאם אישית לבקבוק הרב-שכבתי בארון הבטיחות הביולוגית והאוטוקלאבינג של חלקי הרכיבים אינם רצויים בהגדרת cGMP. כחלופה, מכלול צינורות מעוקר גמא מותאם אישית יכול להיות במיקור חוץ לספקים. ספקים המספקים צלוחיות רב שכבתיות מציעים גם אפשרות של התאמה מראש של הצלוחיות עם מכלולי צינורות רצויים, כולל מסנן 0.2 מיקרומטר, ועיקור גמא של התלבושת כולה. זה יבטיח שהצלוחיות הרב-שכבתיות והצנרת המחוברת יהיו סגורות באמת, כלומר ניתן יהיה להשלים את התהליך על הספסל בסביבה של חדר נקי Class C.
תהליך זה המשתמש במערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה אינו מוגבל לתאים מתורבתים מבוססי דבק בכלי רב שכבתי וניתן להתאים אותו לפלטפורמות התפשטות תאים דינמיות (ביוריאקטורים של מיכל ערבוב או גל) וסטטיות (חדירות לגז) המבוססות על התפשטות תאים. באופן ספציפי, עבור hMSCs שהורחבו בתרביות מיקרו-נשא תלת-ממדיות, ניתן למטב פרוטוקולים במערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה כדי לקצור, לשטוף ולנסח את ה-hMSCs המנותקים ממיקרו-נשאים. 
בסך הכל, העניין הגובר בפיתוח טיפולים תאיים תרגומיים עם חוסן ואמינות משופרים של תהליכים הוביל לפיתוח פלטפורמות סגורות ואוטומטיות לעיבוד תאים. מערכות אלה הכרחיות, שכן הן מפחיתות את מספר שלבי הטיפול, מונעות זיהום פוטנציאלי על ידי חיבורים סטריליים ומפחיתות את עלויות הייצור על ידי הפחתת כוח אדם ושיפור השימוש היעיל בשטח החדר הנקי21 . בהתאם לכך, רבים ממפתחי מוצרי התרפיה התאית המבקשים אישור רגולטורי לתרגם את הטיפולים שלהם מודעים לחשיבות של סגירת התהליך ויישום אוטומציה מלאה או אוטומציה למחצה כבר בשלב פיתוח התהליך 14,31,32.
עם השימוש בתווך SFM XF ידידותי לרגולציה, ויחד עם ריאגנטים נלווים התואמים ל- 21 CFR GMP Part 11 ולהנחיות איכות בינלאומיות, תהליך אוטומטי למחצה זה יתאים בקלות לייצור קליני. הראינו את יכולת השחזור של התהליך הסגור ואת התחזוקה של איכות WJ-MSCs. שיפור היעילות והבטיחות של גידול תאים מבוססי דבק בצלוחיות רב-שכבתיות יועיל לא רק לתחום הטיפול ב-hMSC אלא גם לחברות בתחום בנקאות קווי התאים וייצור וירוסים דבקים.

תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) הם מועמדים מצוינים ליישומים קליניים, הן בהנדסת רקמות והן בטיפולים תאיים, בהתחשב בפוטנציאל הטיפולי שלהם ובפוטנציאל ההתחדשות העצמית הגבוה שלהם לגדול במבחנה, שהם קריטיים ליצירת מינונים רלוונטיים קלינית של תאים 1,2,3. על פי ClinicalTrials.gov, ישנם מעל 1,000 ניסויים קליניים הנמצאים כעת תחת חקירה עבור מצבי מחלה שונים4. על רקע העניין הגובר בשימוש ב-hMSCs, ניסויים קליניים נוספים ואישורי שוק צפויים בעתיד הקרוב 5,6. עם זאת, לייצור hMSCs יש אתגרים מובנים רבים במונחים של השתנות אצווה לאצווה, שימוש בחומרי גלם בסיכון גבוה, חששות לגבי זיהום עקב תהליכים פתוחים וידניים רבים, שכן הייצור כרוך בפעולות מרובות יחידות, עלויות עבודה גבוהות יותר, עלות הרחבה או הרחבה, ומכשולים רגולטוריים 6,7,8,9,10, 11,12. נושאים אלה נותרו חסם משמעותי לגישה לשוק הנוכחי והעתידי.
פיתוח פתרונות ייצור סגורים, מודולריים ואוטומטיים ושימוש בריאגנטים נלווים בסיכון נמוך יתמודדו עם אתגרים אלה. זה גם יבטיח איכות מוצר עקבית, יפחית את הסבירות לכשלי אצווה עקב טעויות אנוש, יפחית את עלויות העבודה וישפר את סטנדרטיזציה של תהליכים ותאימות לתקנות, כגון במונחים של שמירת רשומות אצווה דיגיטלית 8,12,13,14. כדי להיות מסוגל להשיג מינון רלוונטי מבחינה קלינית של תאים, בין אם זה אוטולוגי או אלוגני, ייצור יעיל הכולל הרחבת תאים במעלה הזרם ועיבוד במורד הזרם באופן סגור ואוטומטי הוא חיוני.
עבור הרחבת hMSC במעלה הזרם, שתי שיטות הייצור הנפוצות ביותר המשמשות כיום הן scale-out (monolayer דו-ממדי) ו-scale-up (מערכת מתלים תלת-ממדית מבוססת מיקרו-מוביל)15,16,17,18. השיטה המסורתית והנפוצה ביותר להרחבת hMSC היא תרבות דו-ממדית חד-שכבתית בשל עלות הייצור הנמוכה וקלות ההתקנה19.
צלוחיות רב-שכבתיות המורכבות ממגשי משטח שטוחים המוערמים בתוך כלי תרבית משמשות בדרך כלל להרחבת ייצור hMSC. מערכות אלה מגיעות בדרך כלל בכלי תרבית של שכבה אחת עד 40 שכבות20 ומטופלות ידנית בתוך ארונות בטיחות ביולוגית. שלבי העיבוד במהלך העברת התאים וקצירתם כוללים ניפוק ידני וניקוי של מדיית ההתפשטות, מגיב דיסוציאציה וחיץ שטיפה על ידי פיפטינג או הטיה פיזית של הכלי כולו. חוץ מזה, הטיפול ביחידות מרובות הוא מאתגר וגוזל זמן בשל גודלן ומשקלן העצום.
לאחר הקציר, לאחר הקציר מצלוחיות רב-שכבתיות, צנטריפוגה להחלפת מדיה, שטיפת תאים והפחתת נפח הם שלבים חיוניים בכל תהליך הייצור של התא21. צנטריפוגה קונבנציונלית היא תהליך פתוח וידני ברובו הכולל מספר רב של שלבים, כגון העברת מתלה התא לצינורות מכוסים או בקבוקים בתוך ארון בטיחות ביולוגית, סיבוב התאים, שאיפה ידנית של הסופר-נטנט, מתלה תאים עם החיץ ושטיפות תאים חוזרות ונשנות. זה מגדיל באופן דרמטי הן את הסיכון לזיהום עקב פתיחה וסגירה של הפקקים והן את הסיכוי לאבד את כדורית התא במהלך תהליך השאיפה / צנרת ידנית22. בהקשר של טיפול במערכות תרבית רב-שכבתיות עבור תאים מבוססי דבק כגון hMSCs, המפעיל יצטרך לעבור תהליך מייגע של מעבר בין הצנטריפוגה לארון הבטיחות הביולוגית שוב ושוב וטיפול ביחידה כבדה בו זמנית. צעדים ידניים אלה מייגעים, מהווים סיכונים במונחים של טעויות אנוש וזיהום, ויש לבצע אותם בסביבת חדר נקי Class B, שהיא יקרה23. בנוסף, תהליך הצנטריפוגה הידנית הקונבנציונלית אינו ניתן להרחבה ועלול לגרום לגזירה וללחץ תאי; לפיכך, מקסום התאוששות התא, הכדאיות ויעילות השטיפה של זיהומים שיוריים הם אתגרים מרכזיים אחרים22. ייצור מסחרי בקנה מידה cGMP של טיפולים תאיים דורש פתרונות אוטומציה סגורים ומודולריים כדי להפחית את הסיכון לזיהום, להבטיח איכות מוצר עקבית, להפחית את עלויות העבודה והייצור ולהגדיל את אמינות התהליך24,25. ניתן לטפל בצלוחיות רב-שכבתיות כמערכת סגורה על ידי מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר באחת היציאות כדי להקל על חילופי גזים סטריליים ויציאה שנייה המחוברת באופן אספטי באמצעות מחברים או מרותכת בצינור ישירות למכשיר עיבוד תאים אוטומטי לקצירת תאים. עבדנו לקראת סגירה ואוטומציה של רוב השלבים של המעבר והקציר של WJ-hMSC על ידי הערכת צנטריפוגה חדשנית של זרימה נגדית סגורה המיועדת לייצור מוצרים מבוססי תאים, גנים או רקמות. לצנטריפוגה זו של זרימה נגדית יש גם את הגמישות לבצע מגוון יישומי עיבוד תאים, כגון הפרדת תאים על בסיס גודל, חילופי בינוני/חיץ, ריכוז וקציר עבור מגוון סוגי תאים 8,26,27,28. המכשיר משתמש בערכה חד-פעמית סגורה הניתנת לחיבור סטרילי באמצעות ריתוך צינור או מחברים אספטיים להעברת שקיות או שניתן לחבר אותה ישירות לכל פלטפורמת הרחבה לפי בחירתו.
במחקר זה תכננו מכלול צינורות מותאם אישית שיאפשר חיבורים סטריליים סגורים בין ערכת הצנטריפוגה החד-פעמית נגד הזרימה לבין הצלוחית הרב-שכבתית. ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לניתוק, שטיפה וקציר אנזימטיים של WJ-MSCs מהבקבוק הרב-שכבתי באופן סגור לחלוטין ואוטומטי למחצה בהפעלה אחת. ה-WJ-hMSCs שנקטפו אופיינו בטוהר (ניתוח סמנים על פני השטח) ובעוצמה (CFU-F, התמיינות תלת-שושלת ופרופילי הפרשת ציטוקינים) כדי להבטיח שהמוצר הסופי עומד בתכונות האיכות הקריטיות (CQAs) לשחרור לוט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) נחקרים כיום כשיטת טיפול מבטיחה מבוססת תאים למחלות שונות, עם אישורי שוק נוספים לשימוש קליני צפויים בשנים הקרובות. כדי להקל על מעבר זה, טיפול בצווארי בקבוק של קנה מידה, יכולת שחזור מלוט למגרש, עלות, תאימות לתקנות ובקרת איכות הוא קריטי. ניתן להתמודד עם אתגרים אלה על ידי סגירת התהליך ואימוץ פלטפורמות ייצור אוטומטיות. במחקר זה פיתחנו תהליך סגור ואוטומטי למחצה להעברה ולקציר של hMSCs שמקורם בג'לי של וורטון (WJ-hMSCs) מצלוחיות רב-שכבתיות באמצעות צנטריפוגות נגד הזרם. ה-WJ-hMSCs הורחבו באמצעות תווך תואם רגולציה ללא קסנו-נטול קסנו (SFM XF), והם הראו התפשטות תאים דומה (הכפלת אוכלוסייה) ומורפולוגיה ל-WJ-hMSCs שהורחבו במדיה קלאסית המכילה סרום. פרוטוקול הקציר הסגור והחצי-אוטומטי שלנו הוכיח התאוששות תאים גבוהה (~98%) וכדאיות (~99%). התאים שנשטפו ורוכזו באמצעות צנטריפוגה נגד זרימה שמרו על ביטוי סמן פני השטח WJ-hMSC, יחידות יוצרות מושבה (CFU-F), פוטנציאל התמיינות טרי-שושלת ופרופילי הפרשת ציטוקינים. פרוטוקול קצירת התאים החצי-אוטומטי שפותח במחקר יכול להיות מיושם בקלות לעיבוד בקנה מידה קטן עד בינוני של תאים דבקים ותרחיפים שונים על ידי חיבור ישיר לפלטפורמות הרחבת תאים שונות כדי לבצע הפחתת נפח, שטיפה וקציר עם נפח פלט נמוך.

בנק תאי האב WJ-hMSC (MCB) לאחר ההפשרה נשמר במשך שלושה מעברים רצופים (p1-p4) בתווך קלאסי המכיל סרום כדי לייצר מספיק בנקי תאים עובדים (WCB) לניסויים. ה-wcb p4 הופשרו והורחבו הן בתווך המכיל סרום והן בתווך SFM XF לשלושה מעברים נוספים (עמ' 4-p7) בצלוחיות T-175. ה-WJ-MSCs הסתגלו היטב כאשר הורחבו בתווך SFM XF, והצליחו לשמור על שגשוג יציב בדומה לזה שבתווך המכיל סרום (איור 2A). אולם התאים שהתרחבו בתווך SFM XF הציגו מורפולוגיה מעט ארוכה יותר דמוית ציר דמוי פיברובלסט, וכתוצאה מכך גודל התא מעט גדול יותר (איור 2B) של ממוצע של ~17 מיקרומטר בהשוואה ל~15 מיקרומטר בתווך המכיל סרום. בשני התנאים הבינוניים לאורך שלושת המעברים, WJ-hMSCs הגיעו באופן עקבי לצפיפות התאים המקסימלית שלהם של ~2.3 x 104 תאים/ס"מ2 וזמן הכפלת אוכלוסייה של ~34 שעות (איור 2C,D).
לצורך הרחבת WJ-hMSC בקנה מידה גדול במערכת סגורה, ביצענו הרחבה של רכבת זרעים של WJ-hMSCs תחילה בבקבוק בן 4 שכבות, ולאחר מכן, בצלוחית רב-שכבתית בת 10 שכבות. בסביבות 80%-90% מפגש לאחר 4 ימי תרבית, קצרנו 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 ו- 2.3 x 10 8 ± 0.2 x 10 8 תאים עבור ערימות 4 שכבות ו- 10 שכבות, בהתאמה. צפיפות תאים גבוהה יותר של 3.6 x 10 4-3.8 x 104 תאים/ס"מ2 הושגה בהשוואה לצלוחיות T-175, כלומר הערימות אפשרו התרחבות תאים טובה יותר עד פי שבעה.
יתר על כן, WJ-hMSCs שהורחבו בכלי תרבית של 10 שכבות נקטפו ישירות באמצעות צנטריפוגה נגד הזרם. החיבור הסטרילי לערכה החד-פעמית היה קל להעברה ישירה של נוזלים בקצב זרימה מרבי של 165 מ"ל/דקה באמצעות המשאבה הפריסטלטית של המכשיר. תהליך קצירת התאים האוטומטי למחצה הושג על ידי קצירת התאים תחילה באמצעות דיסוציאציה אנזימטית, העמסת התאים לתוך תא הזרימה הנגדית לצורך הפחתת נפח וריכוז, ולאחר מכן שטיפה עם חיץ שטיפה, שהיה בערך פי 3 מנפח תא הצנטריפוגה של הזרימה הנגדית. יתר על כן, התאים שנשטפו רוכזו ונקטפו לנפח הקציר הרצוי שנקבע מראש בפרוטוקול. שלבי העיבוד המשמשים לעיבוד התאים האוטומטי למחצה תוכננו לחקות את זרימת העבודה הידנית של הקציר. השגנו הפחתה של פי 10 בנפח, וכתוצאה מכך נוצרו ריכוזי תאים גבוהים עד 5.3 מיליון תאים/מ"ל. הפרוטוקול הצליח להשיג התאוששות תאים גבוהה ב~98% ויכולת קיום תאים גבוהה ב~99% באופן עקבי בכל שלוש הריצות הבלתי תלויות (איור 3A-C).
ביצענו בדיקות אפיון תאים מקיפות כדי לקבוע את תכונות האיכות הקריטיות של קציר התאים באמצעות צנטריפוגה נגד זרימה בהשוואה לצנטריפוגה ידנית. כדי לבחון את זהותם של WJ-hMSCs, סמני פני השטח של התא נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4A, ה-WJ-hMSCs שנקטפו בשתי השיטות הציגו פרופילי סמן פני שטח אופייניים בהתאם לתקנות ISCT, ביטוי חיובי של CD73, CD90 ו-CD105, כמו גם ביטוי שלילי של CD34 ו-CD45. לאחר מכן, כדי להעריך את הפוטנציאל הקלונוגני של WJ-hMSCs, בוצעו בדיקות CFU-F. כפי שניתן לראות באיור 4B, תאים שנקצרו מצנטריפוגות נגד זרימה הציגו פוטנציאל CFU-F דומה בהשוואה לתאים שנקצרו באמצעות צנטריפוגה ידנית (21% ±-1% לעומת 20% ±-1%, בהתאמה). יתר על כן, כפי שניתן לראות באיור 4C, תאי הצנטריפוגות שנקטפו לאחר הזרימה הנגדית שמרו על היכולת להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים בדומה לתאים בשיטת הצנטריפוגה הידנית. לבסוף, חקרנו 18 פרופילי הפרשת ציטוקינים שונים של התאים באמצעות בדיקות חיסוניות מרובות. כפי שניתן לראות באיור 4D, התאים שנשטפו ורוכזו באמצעות הצנטריפוגה שלאחר הזרימה הנגדית שמרו על פרופילי הפרשת ציטוקינים, והפרופילים היו דומים לאלה של הדגימה שנלקחה לפני שטיפה/ריכוז התאים (צנטריפוגה לפני זרימה נגדית).
בסך הכל, הדגמנו הרחבת hMSC יעילה במערכת תרבית SFM XF, והתאים שנשטפו ורוכזו באמצעות מערכת הצנטריפוגה הסגורה והאוטומטית של זרימה נגדית הניבו התאוששות תאים גבוהה וכדאיות לאחר השטיפה ויכלו לשמור על הפנוטיפ והפונקציונליות שלהם. התהליך החצי-אוטומטי הסגור שפותח במחקר זה יכול לספק עקביות באיכות המוצר במונחים של התאוששות סופית של WJ-MSC, כפי שמעידים שלושה ריצות עצמאיות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> איור 1: תצורה והרכבה של ערכה חד-פעמית בזרימה גבוהה עבור הקציר, השטיפה והריכוז של hMSCs . (A) דיאגרמת הערכה לאחר שהשקיות חוברו בקו אחד עם הצינור המתאים. (B) הבקבוק הרב-שכבתי בעל 10 השכבות המחובר לערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה באמצעות מכלול צינורות מותאם אישית. (C) הדמיה של מצע התא הנוזלי היציב שנוצר בתא הזרימה הנגדית באמצעות פונקציית המצלמה המופעלת בממשק המשתמש הגרפי של תוכנת הצנטריפוגה נגד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> איור 2: השוואה בין המורפולוגיה של התא והתפשטות של hMSCs בתווך המכיל בסרום ובתווך SFM XF. (A) המורפולוגיה התאית המייצגת של hMSCs בתווך סרום קלאסי ובתווך SFM XF. התאים המורחבים SFM XF הציגו מורפולוגיה ארוכה יותר, בצורת ציר ואופיינית לפיברובלסט, בעוד שהתאים שגדלו בתווך המכיל סרום הציגו מורפולוגיה שטוחה יותר. (B) גודל MSC הממוצע בין התווך המכיל סרום לבין מדיום SFM XF, הנמדד על-ידי מונה תאים אוטומטי (n = 3). ניתן לראות בבירור שהתאים המורחבים של SFM XF היו בדרך כלל גדולים יותר מתאים מורחבים בסרום במעברים שונים. תפוקת התא הכוללת במעברים שונים (n=3) (C) במונחים של תאים לכל שטח פנים של תרבית ו-(D) רמות הכפלת האוכלוסייה. רמות דומות של תפוקת תאים התקבלו בין התווך SFM XF לבין התווך המכיל בסרום במעברים שונים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> איור 3: אפיון תאים שעובדו באמצעות מערכת הצנטריפוגות של הזרימה הנגדית . (A) סך כל התאים הקיימים לפני ואחרי השטיפה והריכוז. (B) הפחתת נפח פי 10 הושגה עיבוד צנטריפוגות לאחר זרימה נגדית. (C) התאוששות מלאה ויכולת קיום של התאים. הנתונים ממוצעים על פני שלושה שכפולים ביולוגיים (n = 3) של ריצות כביסה וריכוז. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> איור 4: ניתוח תכונות איכות קריטיות . (A) נתונים מייצגים מציטומטריית זרימה. (B) תמונות מייצגות המציגות את סך כל יחידות ה-CFU. (C) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של התמיינות הטרי-שושלת. (D) תוצאות ניתוח ביטוי ציטוקינים לפני ואחרי עיבוד התאים במערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה (n = 3). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: רצף קציר hMSC לפי פרוטוקול טריפסיניזציה, שטיפה וריכוז במערכת הצנטריפוגות נגד הזרם, כולל שלבי הפריימינג הראשוניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקצירת תאים דבקים מצלוחיות רב-שכבתיות באופן סגור חצי אוטומטי באמצעות מערכת צנטריפוגות נגד הזרמה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור קצירת תאים דבקים ותרחיפים מפלטפורמות הרחבת תאים אחרות עם שינויים מעטים בשלבים הקיימים.

עיבוד תאי גזע מזנכימליים אנושיים ליישומים קליניים באמצעות זרימת עבודה סגורה חצי אוטומטית

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

צנטריפוגת Benchtop היא תהליך פתוח וידני שמאתגר לקנה מידה. הפרוטוקול שלנו מראה כיצד לסגור ולהפוך את הדיסוציאציה, השטיפה והקציר של תאי גזע מזנכימליים, או MSC, לאוטומטיים בריצה אחת. ההתקנה פשוטה.התהליך כולו יכול להתבצע מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית במתקן cGMP (תנאי ייצור נאותים) בכיתה. עיבוד אוטומטי סגור של תאים מפחית את שלבי הטיפול הידניים שעלולים להיות מועדים לסיכונים ומאפשר עמידה בתקני cGMP. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגי תאים אחרים המורחבים במערכות תרבית רב שכבתיות.מערכת הצנטריפוגה Counterflow מאפשרת שינוי של כל שלבי הפרוטוקול עבור יישומים שונים. מי שידגים הליך זה יהיה ד"ר אלן לאם, מדען צוות מקבוצת העיבוד הביולוגי של תאי גזע במכון לטכנולוגיית ביו-עיבוד, כוכב בסינגפור. כדי להתחיל בהרכבת ערכת הצנטריפוגה החד-פעמית נגד הזרם, חבר את הערכה החד-פעמית לשקיות העברת PVC חד-פעמיות באמצעות ריתוך צינורות, כמתואר בתמונה.לאחר מכן, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, חברו בקבוק רב-שכבתי בן 10 שכבות המכיל תאי גזע מזנכימליים אנושיים שמקורם בג'לי של וורטון או ג'לי HMSCs של וורטון למכלול צינורות מותאם אישית. מעבירים את כלי התרבית המחובר בן 10 השכבות עם מכלול הצינור המותאם אישית לספסל ומרתך אותו לקו E של הערכה החד-פעמית. גם. רתכו יציאת דגימה סטרילית לקו G של הערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה.לאחר מכן, חבר את קו הקציר H לפיתיונות סטריליים, מצויד מזרק 50 מיליליטר. כדי להגדיר את הפעלת לוח המחוונים, הפעל את ההתקן באמצעות המתג הדו-מצבי בחלק האחורי של המכשיר וחבר את המחשב הנייד ליציאת ה- USBC במכשיר באמצעות כבל ה- USBC שסופק. הפעל את Counterflow Centrifuge Graphical User Interface, או תוכנת GUI מתפריט שולחן העבודה או ההתחלה והיכנס.לאחר מכן, טען את הפרוטוקול על ידי לחיצה על בחר פרוטוקול כפתור בדף הפתיחה הראשי. לאחר מכן, לחץ על כפתור ביטול הנעילה הכחול במכשיר ופתח את דלת הזכוכית כדי לטעון את הערכה החד-פעמית שהורכבה על מערכת הצנטריפוגה Counterflow. התחל בתליית השקיות על ווי הקולב בסדר המיישר אותן בצורה הטובה ביותר עם יציאות הצינור ברצועות חיישן הבועות עם הבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות הממוקם בזווית.יישרו את הערכה עם שני לחצני המיקום של הערכה. מתחו את צינור המשאבה סביב המשאבה הפריסטלטית ולחצו על המחבר בצורת נורה לבנה למקומו. חבר את תא הצנטריפוגה על ידי הרמת ידית הכסף של מוביל תא הצנטריפוגות נגד הזרימה ואבטחתו על ידי החזרת הידית למקומה הזקוף.לחץ על הצינור מכל יציאה בערכה לתוך המסילות לאורך רצועות חיישן הבועות. סגור את הדלת על ידי לחיצה כלפי מטה על תפס הדלת. הכה את ליזום כפתור בממשק המשתמש הגרפי.תופיע רשימת פעולות לביצוע. ארבעת הפריטים הראשונים הם בדיקות מכשירים, ואילו שני האחרונים הם בדיקות משתמשים. בשלב זה, ודא שהשקיות והחיבורים תואמים לתמונת הערכה והמהדקים הידניים פתוחים.הקש על אישור כדי להציג את מסך הקלט של הפרוטוקול. הגדר את ערך תיבת הדו-שיח של הזנת הנתונים או נפח הקציר כ- 45 מיליליטר ולחץ על אישור. לחץ על לחצן ההפעלה הירוק במכשיר כדי להתחיל את הפעלת הפרוטוקול.לאחר השלמת הפריימינג הראשוני, ודא שהמדיום המשומש נשאב במלואו לתוך שקית האשפה. בשלבי השהיה כפי שמסומנים בטבלת זרימת העבודה, הרם את הבקבוק הרב-שכבתי כלפי מעלה ונער אותו כדי לפזר את המאגר באופן שווה לכל המגשים. לאחר שתסיים, החזירו את הבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות למיקום הציור המקורי שלו לשלבים הבאים.בשלבים 20 ו-23, ודא שתאי הטריפסינציה מועברים במלואם לשקית הביניים. ערבבו היטב את תיק הביניים, ידנית, בשלב 25. בשלב 26, השתמש במזרק פיתוי של שני מיליליטר כדי לדגום דרך יציאת הדגימה.בשלבים 29 ו -30, בדוק את היווצרות יציבה של מיטת התא הנוזלית. זה צריך להיות כמו מיטת התא הנוזלית המוצגת כאן. הריצה הושלמה ברמפה כדי לעצור את המדרגה, וכל ערכי הצביטה במערכת הצנטריפוגה של זרימה נגדית ייסגרו אוטומטית.לאחר השלמת הפעלת הפרוטוקול, לחץ על כפתור ביטול הנעילה הכחול במכשיר ופתח את דלת הזכוכית. אטמו את קו הקציר באמצעות אוטם צינור ידני והעבירו בזהירות את המזרק האטום המלא בקציר התאים המרוכז לארון הבטיחות הביולוגי לצורך ספירת תאים ושימור בהקפאה. נתקו שוב את החדר באמצעות הידית.משוך את מחבר הנורה מההתאמה שלו ובזהירות הרם את הערכה והשלך אותה לשקית מסוכנת ביולוגית. נקו את המכשיר באמצעות מגבוני אתנול וסגרו את הדלת. לבסוף, סגור תחילה את יישום ממשק המשתמש הגרפי לפני כיבוי המתג בחלק האחורי של המכשיר.Jelly MSCs של Wharton's התרבו היטב כאשר הורחבו הן במדיה המכילה סרום והן במדיה נטולת קסנו. עם זאת, אלה בתווך נטול סרום וללא קסנו הציגו מורפולוגיה מעט ארוכה יותר דמוית ציר דמוי פיברובלסט, עם גודל תא ממוצע גדול יותר של 17 מיקרון, בהשוואה ל -15 מיקרון בתווך הסרום. בשני המדיות לאורך שלושת המעברים, הג'לי HMSCs של וורטון הגיעו באופן עקבי לצפיפות תאים מקסימלית של כ -23, 000 תאים לסנטימטר מרובע וזמן הכפלת אוכלוסייה של 34 שעות.כאשר הורחבו הג'לי HMSCs של וורטון בכלי תרבית בעלי 10 שכבות באמצעות צנטריפוגת הזרימה הנגדית שהודגמה, הושגה הפחתת נפח של פי עשרה, ויצרה ריכוזי תאים גבוהים עד 5.3 מיליון תאים למיליליטר. הפרוטוקול השיג באופן עקבי התאוששות תאים גבוהה של כ-98% ויכולת קיום תאים גבוהה של כ-99% עבור שלוש ריצות עצמאיות. הג'לי HMSCs של וורטון שנקטפו בשתי השיטות הציגו פרופילי סמן פני שטח אופייניים שהם CD73, CD90 ו- CD105 חיוביים, כמו גם CD34 ו- CD45 שליליים.התאים שנקצרו מצנטריפוגות נגד זרימה הציגו פוטנציאל דומה של יחידת פיברובלסטים יוצרי מושבה או פוטנציאל CFU, בהשוואה לתאים שנקצרו באמצעות צנטריפוגה ידנית. בשתי השיטות, התאים שמרו על היכולת להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים. פרופילי הפרשת הציטוקינים של תאים לאחר צנטריפוגה של זרימה נגדית היו דומים לצנטריפוגות לפני זרימה נגדית.הקפד להרכיב את הערכה לשימוש חד פעמי תוך התייחסות לסידור המיטה, החלף אותה בבונה פרוטוקולי מערכת צנטריפוזיה זרם נגדי זה. ניתן להשתמש בפרוטוקול לשטיפת שאריות זיהומים מהמוצר הסופי ביישומים קליניים כדי לתמוך במשתמשים בעמידה בקריטריוני שחרור המנה שלהם. כדי לזרז את תהליך העברת הנוזלים לעיבוד בקנה מידה גדול, ניתן להשתמש במשאבות חיצוניות כדי להעביר תחילה את תכולת הטריפסיניז לשקית העברה, במקום לקצור ישירות מהבקבוק הרב-שכבתי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...