Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
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Gli autori desiderano riconoscere il sostegno del finanziamento Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 e H18/AH/a0/001) di A * STAR, Singapore.

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. e J.N. sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific. A.L. e S.O. non hanno conflitti di interesse.

In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di chiudere e semi-automatizzare la dissociazione hMSC e il lavaggio e la raccolta sul banco utilizzando uno strumento di centrifugazione controcorrente. Uno dei passaggi critici nell'intero flusso di lavoro è assicurarsi che i tubi siano collegati secondo il protocollo preimpostato definito nel generatore di protocolli del sistema di centrifugazione controcorrente. La configurazione e il funzionamento sono semplici e il tempo necessario per elaborare circa 2 litri di coltura da un pallone a 10 strati dall'assemblaggio del kit alla raccolta delle celle è stato di circa 60 minuti. Uno dei passaggi limitanti di questo flusso di lavoro è il trasferimento del fluido dal pallone multistrato ai sacchi di trasferimento collegati allo strumento di centrifugazione controcorrente. Il kit monouso ad alto flusso può essere utilizzato solo a una portata massima di 165 ml/min, e questo potrebbe essere difficile per la lavorazione, ad esempio, di un pallone a 40 strati. Per accelerare il processo di trasferimento del fluido, è possibile utilizzare pompe esterne ad alta portata per trasferire prima il contenuto tripsinizzato in un sacco di trasferimento, quindi lavare/concentrare e raccogliere le celle dal sacco di trasferimento utilizzando il sistema di centrifugazione controcorrente. Inoltre, questo protocollo può essere applicato anche per il passaggio di celle da matraccio multistrato a 4 strati a 10 strati. Più a monte, il sistema di centrifugazione controcorrente potrebbe anche essere ottimizzato per il lavaggio di hMSC scongelate e la raccolta diretta e la formulazione del terreno in palloni multistrato per avviare il treno di semi. Va notato che il numero minimo di celle necessarie per formare il letto fluidizzato nella camera di centrifugazione controcorrente è di circa 30 milioni di celle e il volume massimo raccomandato per il trattamento per lotto è di 20 L.
Attualmente, il fissaggio del gruppo di tubi personalizzati al pallone multistrato nell'armadio di biosicurezza e l'autoclave delle parti dei componenti non sono desiderabili in un ambiente cGMP. In alternativa, un gruppo di tubi personalizzato sterilizzato con raggi gamma potrebbe essere esternalizzato ai fornitori. I fornitori che forniscono palloni multistrato offrono anche la possibilità di pre-montare i palloni con i gruppi di tubi desiderati, incluso un filtro da 0,2 μm e la sterilizzazione gamma dell'intero equipaggiamento. Ciò garantirebbe che i palloni multistrato e i tubi collegati siano veramente chiusi, il che significa che il processo potrebbe essere completato sul banco in una camera bianca di Classe C.
Questo processo che utilizza il sistema di centrifugazione controcorrente non è limitato alle cellule in coltura a base aderente in un recipiente multistrato e potrebbe essere adattato a piattaforme di espansione cellulare basate su sospensioni dinamiche (serbatoio agitato o ad onda) e statiche (permeabili ai gas). In particolare, per le hMSC espanse in colture di microcarrier 3D, i protocolli possono essere ottimizzati sul sistema di centrifugazione controcorrente per raccogliere, lavare e formulare le hMSC dissociate dai microcarrier. 
Nel complesso, il crescente interesse per lo sviluppo di terapie cellulari traslazionali con maggiore robustezza e affidabilità del processo ha portato allo sviluppo di piattaforme di elaborazione cellulare chiuse e automatizzate. Questi sistemi sono fondamentali, in quanto riducono il numero di fasi di movimentazione, prevengono potenziali contaminazioni da connessioni sterili e riducono i costi di produzione riducendo la manodopera e migliorando l'uso efficace dello spazio della camera bianca21. In linea con questo, molti degli sviluppatori di prodotti per terapia cellulare che stanno cercando l'approvazione normativa per tradurre le loro terapie sono consapevoli dell'importanza di chiudere il processo e implementare l'automazione completa o semi-automazione già nella fase di sviluppo del processo 14,31,32.
Con l'uso di un mezzo SFM XF conforme alle normative e insieme a reagenti ausiliari conformi alle 21 CFR GMP Part 11 e alle linee guida internazionali sulla qualità, questo processo semi-automatizzato sarebbe facilmente adatto per la produzione clinica. Abbiamo dimostrato la riproducibilità del processo chiuso e il mantenimento della qualità delle WJ-MSC. Migliorare l'efficienza e la sicurezza della coltura di cellule aderenti in flaconi multistrato andrebbe a beneficio non solo del campo della terapia hMSC, ma anche delle aziende nel settore bancario delle linee cellulari e nella produzione di virus aderenti.

Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) sono un ottimo candidato per applicazioni cliniche, sia nell'ingegneria tissutale che nelle terapie cellulari, dato il loro potenziale terapeutico e l'elevato potenziale di auto-rinnovamento per crescere in vitro, che sono fondamentali per generare dosaggi clinicamente rilevanti delle cellule 1,2,3. Secondo ClinicalTrials.gov, ci sono oltre 1.000 studi clinici attualmente in fase di indagine per varie condizioni di malattia4. Dato il contesto di crescente interesse per l'uso di hMSC, ulteriori studi clinici e approvazioni di mercato sono imminenti nel prossimo futuro 5,6. Tuttavia, la produzione di hMSC presenta molte sfide intrinseche in termini di variabilità da lotto a lotto, l'uso di materie prime ad alto rischio, preoccupazioni relative alla contaminazione dovuta a molti processi aperti e manuali, poiché la produzione comporta operazioni di unità multiple, costi di manodopera più elevati, costi di scalabilità orizzontale o verticale e ostacoli normativi 6,7,8,9,10, 11,12. Questi problemi rimangono un ostacolo significativo all'accesso al mercato attuale e futuro.
Lo sviluppo di soluzioni di produzione chiuse, modulari e automatizzate e l'utilizzo di reagenti ausiliari a basso rischio affronterebbero queste sfide. Ciò garantirebbe anche una qualità costante del prodotto, ridurrebbe la probabilità di guasti dei lotti dovuti a errori umani, ridurrebbe i costi di manodopera e migliorerebbe la standardizzazione dei processi e la conformità normativa, ad esempio in termini di registrazione digitale dei lotti 8,12,13,14. Per essere in grado di ottenere un dosaggio clinicamente rilevante delle cellule, sia esso autologo o allogenico, è fondamentale una produzione semplificata che comporti l'espansione cellulare a monte e l'elaborazione a valle in modo chiuso e automatizzato.
Per l'espansione hMSC upstream, i due metodi di produzione più comuni attualmente utilizzati sono scale-out (monostrato 2D) e scale-up (sistema di sospensione basato su microcarrier 3D)15,16,17,18. Il metodo più tradizionale e ampiamente adottato per l'espansione hMSC è la coltura 2D basata su monostrato a causa del basso costo di produzione e della facilità di configurazione19.
I palloni multistrato composti da vassoi a superficie piatta impilati all'interno di un recipiente di coltura sono comunemente utilizzati per scalare la produzione hMSC. Questi sistemi sono tipicamente disponibili in recipienti di coltura da 1 a 40 strati20 e vengono gestiti manualmente all'interno di armadi di biosicurezza. Le fasi di lavorazione durante il passaggio e la raccolta delle celle comportano l'erogazione e la decantazione manuale del mezzo di espansione, del reagente di dissociazione e del tampone di lavaggio mediante pipettaggio o inclinazione fisica dell'intero serbatoio. Inoltre, la gestione di più unità è impegnativa e richiede tempo a causa delle loro dimensioni e del loro peso.
Successivamente, la post-raccolta da matraccio multistrato, la centrifugazione per lo scambio di supporti, il lavaggio delle cellule e la riduzione del volume sono passaggi essenziali nell'intero flusso di lavoro di produzione delle celle21. La centrifugazione convenzionale da banco è un processo per lo più aperto e manuale che comporta una moltitudine di passaggi, come il trasferimento della sospensione cellulare in tubi o bottiglie tappati all'interno di un armadio di biosicurezza, la rotazione delle cellule, l'aspirazione manuale del surnatante, la risospensione cellulare con il tampone e ripetuti lavaggi cellulari. Ciò aumenta drasticamente sia il rischio di contaminazione dovuto all'apertura e alla chiusura dei tappi sia le possibilità di perdere il pellet cellulare durante il processo manuale di aspirazione/pipettaggio22. Nel contesto della gestione di sistemi di coltura multistrato per cellule aderenti come le hMSC, l'operatore dovrebbe passare ripetutamente attraverso un laborioso processo di spola tra la centrifuga e l'armadio di biosicurezza e maneggiare contemporaneamente un'unità pesante. Queste fasi manuali sono laboriose, comportano rischi in termini di errori umani e contaminazione e devono essere condotte in un ambiente di camera bianca di classe B, che è costoso23. Inoltre, il processo di centrifugazione manuale convenzionale non è scalabile e potrebbe causare taglio cellulare e stress; Pertanto, massimizzare il recupero cellulare, la vitalità e l'efficienza di wash-out delle impurità residue sono altre importanti sfide22. La produzione commerciale su scala cGMP di terapie cellulari richiede soluzioni di automazione chiuse e modulari per ridurre il rischio di contaminazione, garantire una qualità costante del prodotto, ridurre i costi di manodopera e produzione e aumentare l'affidabilità del processo24,25. I palloni multistrato possono essere gestiti come un sistema chiuso avendo un filtro sterile da 0,2 μm in una delle porte per facilitare lo scambio di gas sterile e una seconda porta collegata asetticamente tramite connettori o saldati a tubi direttamente a uno strumento automatizzato per il trattamento delle celle per la raccolta delle cellule. Abbiamo lavorato per chiudere e automatizzare la maggior parte delle fasi di passaggio e raccolta WJ-hMSC valutando un'innovativa centrifuga chiusa in controcorrente destinata alla produzione di prodotti a base di cellule, geni o tessuti. Questa centrifuga controcorrente ha anche la flessibilità di eseguire una varietà di applicazioni di lavorazione cellulare, come la separazione cellulare in base alle dimensioni, allo scambio di mezzi/tamponi, alla concentrazione e alla raccolta per una varietà di tipi di cellule 8,26,27,28. Lo strumento utilizza un kit monouso chiuso che può essere collegato sterile utilizzando saldatura di tubi o connettori asettici per trasferire i sacchi o può essere collegato direttamente a qualsiasi piattaforma di espansione scelta.
In questo studio, abbiamo progettato un gruppo di tubi personalizzato per consentire connessioni sterili chiuse tra il kit di centrifugazione controcorrente monouso e il pallone multistrato. Abbiamo ottimizzato un protocollo per staccare, lavare e raccogliere enzimaticamente le WJ-MSC dal pallone multistrato in modo completamente chiuso e semi-automatizzato all'interno di un singolo ciclo. Le WJ-hMSC raccolte sono state caratterizzate per purezza (analisi dei marcatori di superficie) e potenza (CFU-F, differenziazione del trilineaggio e profili di secrezione di citochine) per garantire che il prodotto finale soddisfacesse gli attributi critici di qualità (CQA) per il rilascio del lotto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente in fase di studio come promettente modalità terapeutica basata su cellule per varie malattie, con ulteriori approvazioni di mercato per uso clinico previste nei prossimi anni. Per facilitare questa transizione, è fondamentale affrontare i colli di bottiglia di scala, riproducibilità da lotto a lotto, costi, conformità normativa e controllo della qualità. Queste sfide possono essere affrontate chiudendo il processo e adottando piattaforme di produzione automatizzate. In questo studio, abbiamo sviluppato un processo chiuso e semi-automatizzato per il passaggio e la raccolta delle hMSC derivate dalla gelatina di Wharton (WJ) (WJ-hMSC) da palloni multistrato utilizzando la centrifugazione controcorrente. Le WJ-hMSC sono state espanse utilizzando un mezzo privo di siero privo di siero (SFM XF) conforme alle normative e hanno mostrato proliferazione cellulare (raddoppio della popolazione) e morfologia comparabili alle WJ-hMSC espanse nei classici mezzi contenenti siero. Il nostro protocollo di raccolta semi-automatico chiuso ha dimostrato un elevato recupero cellulare (~ 98%) e vitalità (~ 99%). Le cellule lavate e concentrate mediante centrifugazione controcorrente hanno mantenuto l'espressione del marcatore di superficie WJ-hMSC, le unità formanti colonie (CFU-F), il potenziale di differenziazione del trilineaggio e i profili di secrezione di citochine. Il protocollo di raccolta delle celle semi-automatizzato sviluppato nello studio può essere facilmente applicato per l'elaborazione su piccola e media scala di varie celle aderenti e in sospensione collegandosi direttamente a diverse piattaforme di espansione cellulare per eseguire la riduzione del volume, il lavaggio e la raccolta con un basso volume di output.

La banca di cellule master (MCB) WJ-hMSC dopo lo scongelamento è stata mantenuta per tre passaggi successivi (p1-p4) nel classico mezzo contenente siero per produrre abbastanza banche di cellule funzionanti (WCB) per gli esperimenti. I WCB p4 sono stati scongelati ed espansi sia nel mezzo contenente siero che nel mezzo SFM XF per altri tre passaggi (p4-p7) nei palloni T-175. Le WJ-MSC si sono adattate bene quando espanse nel mezzo SFM XF e sono state in grado di mantenere una proliferazione stabile simile a quella nel mezzo contenente siero (Figura 2A). Tuttavia, le cellule espanse nel mezzo SFM XF hanno mostrato una morfologia a forma di fuso simile a un fibroblasto leggermente più lunga, risultando in una dimensione cellulare leggermente più grande (Figura 2B) di una media di ~ 17 μm rispetto a ~ 15 μm nel mezzo contenente siero. In entrambe le condizioni medie attraverso i tre passaggi, le WJ-hMSCs hanno costantemente raggiunto la loro massima densità cellulare di ~2,3 x 104 cellule/cm2 e un tempo di raddoppio della popolazione di ~34 h (Figura 2C,D).
Per l'espansione WJ-hMSC su larga scala in un sistema chiuso, abbiamo effettuato un'espansione del treno di semi di WJ-hMSC prima in un pallone a 4 strati e, successivamente, in un matraccio multistrato a 10 strati. A circa l'80% -90% di confluenza dopo 4 giorni di coltura, abbiamo raccolto 9,6 x 10 7 ± 0,9 x 107 e 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 celle rispettivamente per le pile a 4 e 10 strati. È stata raggiunta una densità cellulare più elevata di 3,6 x 10 4-3,8 x 104 celle / cm2 rispetto ai palloni T-175, il che significa che le pile hanno permesso una migliore espansione delle celle fino a sette volte.
Inoltre, i WJ-hMSC espansi in recipienti di coltura a 10 strati sono stati raccolti direttamente utilizzando la centrifugazione controcorrente. Il collegamento sterile al kit monouso è stato facile da stabilire per il trasferimento diretto del fluido a una portata massima di 165 ml / min utilizzando la pompa peristaltica dello strumento. Il processo di prelievo semi-automatico delle cellule è stato ottenuto raccogliendo prima le cellule utilizzando la dissociazione enzimatica, caricando le cellule nella camera di controcorrente per la riduzione del volume e la concentrazione, quindi lavando con tampone di lavaggio, che era circa 3 volte il volume della camera di centrifugazione controcorrente. Inoltre, le cellule lavate sono state poi concentrate e raccolte al volume di raccolta desiderato preimpostato nel protocollo. Le fasi di lavorazione utilizzate per l'elaborazione semi-automatica delle celle sono state progettate per emulare il flusso di lavoro di raccolta manuale. Abbiamo ottenuto una riduzione del volume di 10 volte, con conseguente generazione di concentrazioni cellulari fino a 5,3 milioni di cellule / ml. Il protocollo è stato in grado di ottenere un elevato recupero cellulare a ~ 98% e un'elevata vitalità cellulare a ~ 99% in modo coerente per tutte e tre le esecuzioni indipendenti (Figura 3A-C).
Abbiamo effettuato ampi saggi di caratterizzazione cellulare per determinare gli attributi critici di qualità del prelievo cellulare utilizzando la centrifugazione controcorrente rispetto alla centrifugazione manuale. Per testare l'identità delle WJ-hMSCs, i marcatori della superficie cellulare sono stati analizzati mediante citometria a flusso. Come mostrato nella Figura 4A, le WJ-hMSC raccolte utilizzando entrambi i metodi hanno mostrato profili marcatori superficiali caratteristici secondo le normative ISCT, espressione positiva di CD73, CD90 e CD105, nonché espressione negativa di CD34 e CD45. Successivamente, per valutare il potenziale clonogenico delle WJ-hMSCs, sono stati effettuati saggi CFU-F. Come mostrato nella Figura 4B, le celle raccolte dalla centrifugazione controcorrente hanno mostrato un potenziale CFU-F simile rispetto alle cellule raccolte mediante centrifugazione manuale (21% ± 1% vs. 20% ± 1%, rispettivamente). Inoltre, come mostrato nella Figura 4C, le cellule raccolte con centrifugazione post-controcorrente hanno mantenuto la capacità di differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti simili alle cellule nel metodo di centrifugazione manuale. Infine, abbiamo studiato 18 diversi profili di secrezione di citochine delle cellule utilizzando saggi immunologici multiplex. Come mostrato nella Figura 4D, le cellule lavate e concentrate utilizzando la centrifugazione post-controcorrente hanno mantenuto profili di secrezione di citochine e i profili erano paragonabili a quelli del campione prelevato prima di lavare/concentrare le cellule (centrifugazione pre-controcorrente).
Nel complesso, abbiamo dimostrato un'espansione efficiente di hMSC in un sistema di coltura SFM XF e le cellule lavate e concentrate utilizzando il sistema di centrifugazione controcorrente chiuso e automatizzato hanno prodotto un elevato recupero cellulare e vitalità post-lavaggio e hanno potuto mantenere il loro fenotipo e funzionalità. Il processo semi-automatizzato chiuso sviluppato in questo studio può fornire coerenza qualitativa del prodotto in termini di recupero finale WJ-MSC, come evidenziato da tre cicli indipendenti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Figura 1: Configurazione e assemblaggio del kit monouso ad alto flusso per la raccolta, il lavaggio e la concentrazione delle hMSC. (A) Schema del kit dopo che i sacchi sono stati collegati in linea con i rispettivi tubi. (B) Il pallone multistrato a 10 strati collegato al kit monouso ad alto flusso con il gruppo di tubi personalizzato. (C) Visualizzazione del letto cellulare fluidizzato stabile formatosi nella camera controcorrente tramite la funzione telecamera abilitata nell'interfaccia utente grafica del software di centrifugazione controcorrente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Figura 2: Confronto della morfologia cellulare e dell'espansione delle hMSCs nel mezzo contenente siero e nel mezzo SFM XF. (A) La morfologia cellulare rappresentativa delle hMSCs nel siero classico e nel mezzo SFM XF. Le cellule espanse SFM XF mostravano una morfologia più lunga, a forma di fuso, caratteristica simile ai fibroblasti, mentre le cellule cresciute in mezzo contenente siero mostravano una morfologia più appiattita. (B) La dimensione media MSC tra il mezzo contenente siero e il mezzo SFM XF, misurata da un contatore automatico di celle (n = 3). È chiaro che le cellule espanse SFM XF erano generalmente più grandi delle cellule espanse con siero in diversi passaggi. La resa cellulare totale in diversi passaggi (n = 3) (C) in termini di cellule per superficie di coltura e (D) livelli di raddoppio della popolazione. Livelli simili di resa cellulare sono stati ottenuti tra il mezzo SFM XF e il mezzo contenente siero attraverso diversi passaggi. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Figura 3: Caratterizzazione delle celle trattate mediante il sistema di centrifugazione controcorrente . (A) Totale delle cellule vitali prima e dopo il lavaggio e la concentrazione. (B) Una riduzione di volume di 10 volte è stata ottenuta dopo il processo di centrifugazione controcorrente. (C) Recupero totale e vitalità delle cellule. I dati sono mediati su tre repliche biologiche (n = 3) di cicli di lavaggio e concentrazione. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Figura 4: Analisi degli attributi critici di qualità . (A) Dati rappresentativi dalla citometria a flusso. (B) Immagini rappresentative che mostrano il totale delle CFU. (C) Immagini microscopiche rappresentative della differenziazione del trilineaggio. (D) Risultati dell'analisi dell'espressione delle citochine prima e dopo il trattamento delle cellule sul sistema di centrifugazione controcorrente (n = 3). I dati sono espressi come media ± deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella 1: Sequenza della raccolta hMSC mediante tripsinizzazione, lavaggio e protocollo di concentrazione sul sistema di centrifugazione controcorrente, comprese le fasi iniziali di adescamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

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Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Qui presentiamo un protocollo per raccogliere cellule aderenti da palloni multistrato in modo semi-automatico chiuso utilizzando un sistema di centrifugazione controcorrente. Questo protocollo può essere applicato per la raccolta di celle aderenti e in sospensione da altre piattaforme di espansione cellulare con poche modifiche ai passaggi esistenti.

Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

La centrifugazione da banco è un processo aperto e manuale difficile da scalare. Il nostro protocollo mostra come chiudere e automatizzare la dissociazione, il lavaggio e la raccolta delle cellule staminali mesenchimali, o MSC, in un'unica esecuzione. La configurazione è semplice.L'intero processo può essere eseguito al di fuori dell'armadio di biosicurezza in una struttura di classe cGMP. L'elaborazione automatizzata a celle chiuse riduce le fasi di movimentazione manuale che potrebbero essere soggette a rischi e consente la conformità cGMP. Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di cellule espanse in sistemi di coltura multistrato.Il sistema di centrifugazione controcorrente consente la modifica di qualsiasi fase del protocollo per diverse applicazioni. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Alan Lam, scienziato dello staff del gruppo di bioprocessing delle cellule staminali presso il Bioprocessing Technology Institute, una stella a Singapore. Per iniziare l'assemblaggio del kit di centrifugazione controcorrente monouso, collegare il kit monouso con i sacchetti di trasferimento in PVC monouso tramite saldatura a tubo, come indicato nell'immagine.Quindi, all'interno di un armadio di biosicurezza, attaccare un pallone multistrato a 10 strati contenente confluenti, cellule staminali mesenchimali umane derivate da Jharton o HMSC Jelly di Wharton al gruppo di tubi personalizzati. Trasferire il recipiente di coltura a 10 strati collegato con il gruppo di tubi personalizzato su un banco e saldarlo alla linea E del kit monouso. Anche. saldare una porta campione sterile alla linea G del kit monouso ad alto flusso.Quindi, collegare la linea di raccolta H a un'esca sterile, dotata di una siringa da 50 millilitri. Per impostare la corsa dello strumento, accendere lo strumento utilizzando l'interruttore a levetta sul retro dello strumento e collegare il laptop alla porta USBC dello strumento utilizzando il cavo USBC in dotazione. Eseguire l'interfaccia utente grafica Counterflow Centrifuge o il software GUI dal desktop o dal menu Start ed eseguire l'accesso.Quindi, caricare il protocollo facendo clic sul pulsante Seleziona un protocollo nella pagina di benvenuto principale. Quindi, premere il pulsante di sblocco blu sullo strumento e aprire lo sportello a vetri per caricare il kit monouso assemblato sul sistema di centrifugazione controcorrente. Inizia appendendo i sacchetti ai ganci del gancio in un ordine che li allinea meglio con le porte del tubo sulle strisce del sensore di bolle con il pallone multistrato a 10 strati posizionato ad angolo.Allineare il kit con i due pulsanti di posizione del kit. Allungare il tubo della pompa attorno alla pompa peristaltica e premere il connettore a forma di bulbo bianco in posizione. Collegare la camera della centrifuga sollevando la leva d'argento del supporto della camera della centrifuga controcorrente e fissandola riportando la leva in posizione verticale.Premere il tubo da ciascuna porta del kit nei binari lungo le strisce del sensore di bolle. Chiudere la porta premendo verso il basso sul chiavistello della porta. Premi il pulsante Avvia sulla GUI.Apparirà un elenco di controllo. I primi quattro elementi sono controlli strumentali, mentre gli ultimi due sono controlli utente. A questo punto, assicurarsi che i sacchetti e le connessioni corrispondano all'immagine del kit e che i morsetti manuali siano aperti.Premere Conferma per visualizzare la schermata Input protocollo. Impostare il valore della finestra di dialogo dell'immissione dati o del volume del raccolto su 45 millilitri e premere Conferma. Premere il pulsante verde di avvio sullo strumento per avviare l'esecuzione del protocollo.Una volta completato l'adescamento iniziale, assicurarsi che il mezzo esaurito sia completamente pompato nel sacchetto dei rifiuti. Nei passaggi di pausa, come indicato nella tabella del flusso di lavoro, sollevare il pallone multistrato e agitarlo per distribuire equamente il buffer a tutti i vassoi. Una volta completato, riposizionare il matraccio multistrato a 10 strati nella posizione di estrazione originale per i passaggi successivi.Nei passaggi 20 e 23, assicurarsi che le cellule tripsinizzate siano trasferite completamente nella sacca intermedia. Mescolare bene il sacchetto intermedio, manualmente, nel passaggio 25. Nel passaggio 26, utilizzare una siringa da esca da due millilitri per campionare attraverso la porta di campionamento.Nei passaggi 29 e 30, controllare la formazione stabile del letto cellulare fluidizzato. Dovrebbe essere come il letto cellulare fluidizzato mostrato qui. La corsa è completa al passo di rampa per arrestare e tutti i valori di pizzicamento sul sistema di centrifugazione controcorrente si chiuderanno automaticamente.Al termine dell'esecuzione del protocollo, premere il pulsante di sblocco blu sullo strumento e aprire lo sportello a vetri. Sigillare asetticamente la linea di raccolta utilizzando un sigillante per tubi trasportato a mano e trasferire con cura la siringa sigillata riempita con la raccolta di cellule concentrate nell'armadio di sicurezza biologica per il conteggio delle cellule e la crioconservazione. Staccare nuovamente la camera usando la leva.Estrarre il connettore della lampadina dal raccordo e sollevare con cura il kit e smaltirlo in un sacchetto a rischio biologico. Pulire lo strumento con salviette a bioetanolo e chiudere la porta. Infine, chiudere l'applicazione GUI prima di spegnere l'interruttore sul retro dello strumento.Le MSC Jelly di Wharton sono proliferate bene quando sono state espanse sia in mezzi contenenti siero che senza siero e xeno. Tuttavia, quelli in mezzo privo di siero e xeno mostravano una morfologia a forma di fuso simile a un fibroblasto leggermente più lunga, con una dimensione media delle cellule maggiore di 17 micron, rispetto ai 15 micron nel mezzo sierico. In entrambi i media attraverso i tre passaggi, gli HMSC Jelly di Wharton hanno costantemente raggiunto una densità cellulare massima di circa 23.000 cellule per centimetro quadrato e un tempo di raddoppio della popolazione di 34 ore.Quando gli HMSC Jelly di Wharton sono stati espansi in recipienti di coltura a 10 strati utilizzando la centrifugazione controcorrente dimostrata, è stata ottenuta una riduzione del volume di dieci volte, generando concentrazioni cellulari fino a 5,3 milioni di cellule per millilitro. Il protocollo ha costantemente raggiunto un elevato recupero cellulare di circa il 98% e un'elevata vitalità cellulare di circa il 99% per tre esecuzioni indipendenti. I Wharton's Jelly HMSC raccolti utilizzando entrambi i metodi hanno mostrato profili marcatori di superficie caratteristici che sono CD73, CD90 e CD105 positivi, nonché CD34 e CD45 negativi.Le cellule raccolte dalla centrifugazione controcorrente hanno mostrato un simile test di fibroblasti unitari formanti colonie o potenziale CFU, rispetto a quelli raccolti dalla centrifugazione manuale. In entrambi i metodi, le cellule hanno mantenuto la capacità di differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti. I profili di secrezione di citochine delle cellule dopo la centrifugazione controcorrente erano paragonabili alla centrifugazione pre-controcorrente.Assicurati di assemblare il kit monouso con riferimento alla configurazione del letto, spostalo in questo Counterflow Centrifusion System Protocol Builder. Il protocollo per il lavaggio delle impurità residue dal prodotto finale può essere utilizzato in applicazioni cliniche per supportare gli utenti nel soddisfare i criteri di rilascio del lotto. Per accelerare il processo di trasferimento del fluido per la lavorazione su larga scala, è possibile utilizzare pompe esterne per trasferire prima il contenuto tripsinizzato in un sacchetto di trasferimento, invece di raccogliere direttamente dal pallone multistrato.

Research

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