Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) finansiering (H18/01/a0/021 og H18/AH/a0/001) fra A * STAR, Singapore.

1. Klargjøring av kulturmediet og belegg av kulturkarene
<ol><li>Media forberedelse<ol><li>Sammensetning av det klassiske serumholdige mediet: Forbered det klassiske serumholdige mediet ved å blande αMEM (445 ml), føtalt bovint serum (FBS) (50 ml) og 100x penicillin-streptomycin (5 ml).</li>
		<li>Forbered hele SFM XF-mediet.<ol><li>Lag en 500 ml flaske ved aseptisk å tilsette 5 ml SFM XF-tilskudd (100x) og 5 ml 100x L-alanyl-L-glutamin (se materialtabeller) til SFM XF basalmedium (500 ml).</li>
			<li>Lag en 2-liters mediepose ved aseptisk å tilsette 20 ml tilpasset MSC SFM XF-tillegg (100x) og 20 ml 100x L-alanyl-L-glutamin (se materialtabeller) til SFM XF pose med basalmedium (2 L) ved å koble en 50 ml sprøyte til riktig port på posen. MERK: Før bruk i kultur, tilsett vekstfaktorer eller cytokiner (følger ikke med mediet) til det komplette SF XF-mediet: PDGF-BB (20 ng / ml), FGF basisk (4 ng / ml) og TGFβ (0,5 ng / ml).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Belegg cellekulturkarene med vitronectin for bruk med serumfrie medier<ol><li>Tine en bestand av vitronectin (VTN-N; 0,9 mg/ml) ved 4 °C.</li>
		<li>Bruk steril Dulbeccos bufrede saltvann uten kalsium og magnesium (DPBS) for å fortynne den tinte VTN-N til en arbeidskonsentrasjon på 5 μg / ml. MERK: Fortynn VTN-N umiddelbart før bruk, og oppbevar ikke den fortynnede vitronektinoppløsningen.</li>
		<li>Tilsett 1 ml / 10 cm2 av den fortynnede VTN-N-oppløsningen til det tilsvarende kulturbeholderen; Den endelige konsentrasjonen er 0,5 μg/cm2. For eksempel, tilsett 7,5 ml fortynnet VTN-N-oppløsning til en T-75-kolbe (75 cm2); tilsett 17,5 ml fortynnet VTN-N-oppløsning til en T-175-kolbe (175 cm2); tilsett 250 ml fortynnet VTN-N-løsning til en standard firelags flerlags kolbe (2.528 cm2); og tilsett 630 ml fortynnet VTN-N-oppløsning til en 10-lags flerlags kolbe (6,320 cm2).</li>
		<li>Under sterile forhold, inkuber karene i 1 time ved romtemperatur (RT). MERK: Det belagte dyrkningskaret kan oppbevares i 4 °C i opptil 1 uke. Pakk inn dyrkningsbeholderen med laboratoriefilm for å forhindre at den tørker ut. Før bruk, forvarm kulturbeholderen til romtemperatur i minst 1 time.</li>
		<li>Aspirer VTN-N-løsningen, kast og tilsett umiddelbart et tilstrekkelig volum kulturmedium for å forhindre at den belagte karoverflaten tørker. NOTAT: Det er ikke nødvendig å skylle av kulturbeholderen etter fjerning av VTN-N.</li>
	</ol></li>
</ol>2. WJ-hMSC-utvidelse
<ol><li>Tine WJ-hMSC (p2) raskt ved å plassere cryovialet i et vannbad på 37 °C. Roter hetteglasset sakte til innholdet begynner å tine.</li>
	<li>Ved tining, frø WJ-hMSCene ved 5000 celler / cm 2 i en T-175 kolbe (uten VTN-N belegg), og inkuber i det klassiske serumholdige mediet ved 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2 for celleutvidelse. Etter to passeringer (p4), bank ned de utvidede cellene i ønsket kryopreserveringsmedium som en fungerende cellebank (WCB).</li>
	<li>Utfør celletelling ved hjelp av en automatisert celleteller etter levedyktighets- og celletellingsmetoden for å bestemme totalt celleantall, cellelevedyktighet og cellestørrelse29.</li>
	<li>Fra p4 dyrker WJ-hMSCene ved 5000 celler/cm2 i T-75-kolber i enten klassisk serumholdig medium eller SFM XF-medium (bruk VTN-N-belagte kolber med SFM XF-medium).</li>
	<li>Opprettholde cellene i begge kulturmedier i totalt tre passasjer (12 dager), og måle celleutvidelsen (foldøkning) ved hver passasje ved å dele antall levedyktige celler telt på slutten av kulturen i hver passasje med antall levedyktige celler i begynnelsen av kulturen (dag for cellesåing).</li>
</ol>3. Utvidelse av utskalering av frøtog
<ol><li>WJ-hMSC ekspansjon i en T-175 kolbe<ol><li>Tine WJ-hMSC raskt på p4 ved å plassere cryovialet i et vannbad på 37 °C. Roter hetteglasset sakte til oppløsningen begynner å tine.</li>
		<li>Frø 5000 celler/cm2 til en VTN-N-belagt T-175 kolbe. La cellene vokse i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.</li>
		<li>Bytt ut det brukte kulturmediet hver 2-3 dag med nytilberedt forvarmet komplett SFM XF-medium for optimal ytelse og cellevekst.</li>
	</ol></li>
	<li>Håndtering av flerlagskolber (figur 1A, B)<ol><li>Alle aseptiske tilkoblinger må gjøres i sterile omgivelser.</li>
		<li>Pakk ut flerlagskolben i et biologisk sikkerhetsskap.</li>
		<li>Koble det presteriliserte luftfilteret (0,2 μm) til en port for å la trykket frigjøres under væskeoverføringen ved hjelp av motstrømsentrifugen.</li>
		<li>Monter kolbekontakten med flere lag fra det egendefinerte slangesettet i den andre porten (figur 1B).</li>
		<li>Sveis PVC-linjen på det tilpassede slangesettet til 2 L PVC-overføringsposen som inneholder komplett SFM XF-medium. NOTAT: Bland mediumposen helt før du legger den til flerlagssystemet ved hjelp av tyngdekraftstrømmen. Forsikre deg om at PVC-overføringsposen henger høyere enn kolben med flere lag.</li>
		<li>Plasser kolben med flere lag på langsiden, med luftfilteret øverst (figur 1B).</li>
		<li>Åpne klemmen på PVC-slangen for å begynne å fylle flerlagskolben. Forsikre deg om at mediet er på nivå mellom skuffene under fylling.</li>
		<li>Når mediet har flatet helt ut i alle skuffene, snur du kolben med flere lag på kortsiden med portene stående.</li>
		<li>Lukk klemmen på PVC-linjen, og fjern overføringsposen ved å bytte ut slangeforbindelsen med MPC blå lukkehette. MERK: Ikke fjern luftfilteret, da dette tillater gassutveksling under celleutvidelse.</li>
		<li>Vri flerskiktskolben inn i inkubasjonsposisjonen. MERK: Filteret og slangeforbindelsen skal vende oppover.</li>
		<li>Tøm kolben med flere lag ved å koble den til en aspiratorflaske; Plasser den over aspiratorflasken, og væsken vil strømme ut. MERK: Vipp kolben med flere lag på siden for å tømme det brukte mediet helt ved hjelp av tyngdekraften. Alternativt kan det brukte mediet helles i en avfallsflaske ved hjelp av en tilpasset rørenhet.</li>
		<li>Gjenta trinn 3.2.5-3.2.11 for å fylle opp det ferske mediet.</li>
	</ol></li>
	<li>Subkultur av WJ-hMSCs i flerlagskolben (T-175 > 4-lags > 10-lags)<ol><li>Forvarm celledissosiasjonsreagens (TrypLE) og komplett SFM XF-medium inne i en 37 °C inkubator før bruk.</li>
		<li>Aspirer det brukte mediet fra T-175-kolben og kast.</li>
		<li>Vask cellemonolaget med forvarmet DPBS, aspirer og kast.</li>
		<li>Tilsett TrypLE til hver kolbe, sørg for fullstendig dekning av cellemonolaget, og inkuber i 5-10 minutter ved 37 °C.</li>
		<li>Overfør suspensjonen til et sterilt 50 ml konisk rør.</li>
		<li>Sentrifuger røret ved 100-200 x g i 5 min ved RT. Aspirer og kast DPBS, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellepelleten.</li>
		<li>Resuspender cellepelleten i et minimalt volum (10 ml) av forvarmet komplett SFM XF-medium for celletelling.</li>
		<li>Fyll et VTN-N-belagt firelags kulturfartøy med ca. 800 ml komplett SFM XF-medium, som nevnt i avsnitt 2 ovenfor. Tilsett 5000 celler/cm2 (dvs. 1,26 x 107 levedyktige celler/kolber). Roter cellesuspensjonen forsiktig for å sikre en jevn fordeling.</li>
		<li>Inkuber i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i en fuktet atmosfære.</li>
		<li>Bytt ut det brukte kulturmediet hver 2-3 dag med friskt, forvarmet komplett SFM XF-medium for optimal cellevekst til cellene når 60% -80% sammenløp eller er klare til å bli subkulturert i 10-lags flerlags kolbe.</li>
		<li>Fyll en VTN-N-belagt 10-lags flerlags kolbe med ca. 2 liter komplett SFM XF-medium, som nevnt i avsnitt 2. Tilsett 5000 celler/cm2 (dvs. 3,1 x 107 celler/kolbe). Roter cellesuspensjonen forsiktig for å sikre en jevn fordeling.</li>
		<li>Inkuber i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i en fuktet atmosfære.</li>
		<li>Bytt ut det brukte dyrkningsmediet hver 2-3 dag med friskt, forvarmet komplett SFM XF-medium for optimal cellevekst til cellene når 60% -80% sammenløp eller er klare til å høstes.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lukket halvautomatisert WJ-hMSC dissosiasjon og høsting ved bruk av lukket motstrømsentrifugering
<ol><li>Montering av motstrømssentrifugeringssett til engangsbruk<ol><li>Koble engangssettet til PVC-overføringsposene til engangsbruk via rørsveising, på samme måte som konfigurasjonen vist i figur 1A. MERK: Standard strømningshastighet for engangssettet er 30–165 ml/min.</li>
		<li>Fest en 10-lags kolbe med flerlags inneholdende WJ-hMSC til den tilpassede rørenheten inne i et biosikkerhetsskap.</li>
		<li>Overfør det vedlagte 10-lags kulturfartøyet med den tilpassede rørenheten til en benk, og sveis til linje E (3/32 i ID PVC) i engangssettet, som vist i figur 1B.</li>
		<li>Sørg for å sveise en steril prøveport til linje G i høystrømningssettet.</li>
		<li>Deretter kobler du høstelinje H til en steril luer utstyrt med en 50 ml sprøyte. MERK: I alle trinnene ovenfor, sørg for at de manuelle klemmene er lukket for å sikre væsken i hver settpose.</li>
	</ol></li>
	<li>Sette opp instrumentkjøringen<ol><li>Slå instrumentet " ON" ved å slå på vippebryteren på baksiden av instrumentet.</li>
		<li>Koble den bærbare datamaskinen til USB-C-porten på instrumentet ved hjelp av den medfølgende USB-C-kabelen (figur 1B).</li>
		<li>Kjør programvaren for motstrømsentrifuge grafisk brukergrensesnitt (GUI) fra skrivebordet eller startmenyen.</li>
		<li>Etter at du har logget på, laster du inn protokollen ved å klikke på Velg en protokoll-knappen på hovedvelkomstsiden. MERK: Motstrømssentrifugeringshøstingsprotokollen (tabell 1) ble opprettet ved hjelp av Protocol Builder-programvaren og lagret lokalt.</li>
		<li>Trykk på den blå opplåsingsknappen på instrumentet, og åpne glassdøren.</li>
		<li>Legg det monterte engangssettet på motstrømssentrifugeringssystemet.</li>
		<li>Start med å henge posene opphengt på hengerkroker i en rekkefølge som best stiller dem opp med rørportene på boblesensorstrimlene, med den 10-lags flerlags kolben plassert i vinkel, som vist i figur 1B.</li>
		<li>Still inn settet med de to knappene for settplassering, strekk pumpeslangen rundt den peristaltiske pumpen, og trykk den hvite pæreformede kontakten på plass. MERK: Kontroller at slangen over trykksensoren er riktig plassert i slangesporet.</li>
		<li>Fest sentrifugekammeret ved å løfte sølvspaken på motstrømssentrifugekammerholderen og feste den ved å returnere spaken til oppreist stilling.</li>
		<li>Trykk slangen fra hver port på settet inn i sporene langs boblesensorstrimlene. MERK: Pass på at posene ikke er sammenflettet, slik at protokollprosessen lett kan følges.</li>
		<li>Lukk døren ved å trykke ned på dørlåsen. MERK: Pumpens klemmearm lukkes, sentrifugekammeret spinner og ventilene lukkes. Uten å lukke døren, vil systemet ikke kunne starte og kjøre protokollen.</li>
		<li>Trykk på Initiere-knappen på GUI-en. En sjekkliste vises; De fire første elementene er instrumentkontroller, og de to siste elementene er brukerkontroller (sørg for at posene og tilkoblingene samsvarer med settbildet, og sørg for at de manuelle klemmene er åpne). MERK: For instrumentkontroller vises røde X-er i stedet for blå haker hvis noe ikke er riktig.</li>
		<li>Trykk på Bekreft for å vise skjermbildet for protokollinnganger.</li>
		<li>Sett verdien for dialogboksen Dataregistrering (Harvest Volume) til 45 ml, og trykk på Bekreft. MERK: Protokollinndataskjermen vil bli bedt om hvis noen variable datainnganger er angitt i den brukeropprettede protokollen. Slaktevolumet er satt som en variabel i denne protokollen, og brukeren kan velge å teste forskjellige volumer avhengig av de endelige celletetthetskravene. Minste høstvolum som systemet tillater er 5 ml. Systemet tillater at maksimalt bare fire datavariabler angis for hver protokoll.</li>
	</ol></li>
	<li>Kjøre protokollen<ol><li>Klikk på Start på GUI-en, og trykk på den grønne Start-knappen på instrumentet for å starte protokollkjøringen (se tabell 1). MERK: Systemet vil starte trinnene i henhold til protokollen som starter med primingsekvensen ved å erstatte luften i systemet med en buffer.</li>
		<li>Når grunningen er fullført (tabell 1, trinn 8), må du sørge for at det brukte mediet pumpes helt ut i avfallsposen. MERK: Når den 10-lags flerlags kolben er tom, vil systemet be brukeren i GUI-en om å bekrefte om fartøyet er tomt. Trykk på "Hopp over" -knappen på instrumentet hvis fartøyet er tomt; hvis ikke, trykk på den grønne "Play / Pause" -knappen for å fortsette å drenere gjenværende væsker fra fartøyet.</li>
		<li>I pausetrinn 15, 19 og 22 (tabell 1) må du løfte opp kolben med flere lag og riste for å fordele bufferen likt til alle brettene. Når du er ferdig, plasserer du den 10-lags flerlags kolben tilbake i sin opprinnelige tegneposisjon for de neste trinnene. MERK: Bare for trinn 19 i tabell 1 , etter risting, sørg for å plassere flerlagskolben flat, og inkuber i 10-15 minutter ved RT for å dissosiere cellene.</li>
		<li>I trinn 20 og trinn 23 (tabell 1) må du sørge for at de trypsiniserte cellene overføres helt til mellomposen.</li>
		<li>Bland mellomposen godt manuelt i trinn 25 (tabell 1).</li>
		<li>I trinn 26 (tabell 1) bruker du en sprøyte på 2 ml Luer til å ta prøver gjennom prøvetakingsporten. MERK: Det anbefales å ta prøver minst tre ganger for nøyaktig antall celler.</li>
		<li>I trinn 29 og trinn 30 (tabell 1), kontroller den stabile dannelsen av den fluidiserte cellesengen; den skal være lik den fluidiserte cellesengen som vist i figur 1C. MERK: Hvis den stabile fluidiserte cellesengen ikke dannes lik den som er vist i figur 1C, er optimalisering av forholdet mellom g-kraften og strømningshastigheten (G / F) avgjørende for å oppnå en stabil fluidisert celleseng (høy celleutvinning) i kammeret under cellelastings- og vasketrinnene. G / F-forholdet avhenger av størrelsen på cellene og tettheten av mediet. Et høyt G / F-forhold er nødvendig for en prøve-/vaskebuffer med høy tetthet, mens et lavt G / F-forhold kan brukes til en prøve-/vaskebuffer med lav tetthet.</li>
		<li>Kjøringen er fullført i trinnet Rampe til stopp (trinn 35 i tabell 1), og alle knipeverdiene på motstrømssentrifugeringssystemet lukkes automatisk. NOTAT: Til slutt, sørg for at de manuelle klemmene er lukket for å sikre væsken i hver settpose før du åpner døren.</li>
		<li>Etter at protokollkjøringen er fullført, trykker du på den blå opplåsingsknappen på instrumentet og åpner glassdøren. Ta engangssettet med det høstede konsentratet ut av instrumentet.</li>
		<li>Forsegle høstelinjen aseptisk ved hjelp av en håndbærende rørforsegler. Overfør forsiktig den forseglede sprøyten fylt med konsentrert cellehøsting til det biologiske sikkerhetsskapet for celletelling og kryopreservering.</li>
		<li>Løsne kammeret igjen ved hjelp av spaken, trekk pærekontakten ut av beslaget og løft settet forsiktig bort, og kast det i en biohazard-pose.</li>
		<li>Rengjør instrumentet med etanolservietter, og sørg for å lukke døren.</li>
		<li>Lukk GUI-applikasjonen først før du slår av bryteren på baksiden av instrumentet. MERK: Cellehøstingsprotokollen ble testet i biologiske triplikater (n = 3).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Vurdering av kritiske kvalitetsattributter (CQA)
<ol><li>Celleidentitetsoverflatemarkører (CD73, CD90 og CD105) og ikke-stromale markører (CD34 og CD45)<ol><li>Fortynn den høstede WJ-hMSC-cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 1 x 106 levedyktige celler/ml ved å tilsette et passende volum flowcytometribuffer (DPBS med 1 % BSA eller 2 % FBS).</li>
		<li>Tilsett 100 μL av cellesuspensjonen til hvert mikrosentrifugerør eller 96-brønnplate. Forsikre deg om at minst 0,1 x 106 celler er tilstede per 100 μl cellesuspensjon.</li>
		<li>Legg fluoroforkonjugert antistoff til prøven ved en passende fortynning, som anbefalt av antistoffleverandøren.</li>
		<li>Inkuber i 20 minutter i mørket.</li>
		<li>Etter inkubasjonen, tilsett 100 μL flowcytometribuffer for å vaske prøvene ved sentrifugering ved 380 x g i 3 minutter.</li>
		<li>Kast supernatanten, og la pelleten bli igjen.</li>
		<li>Resuspendere cellepelleten i 200 μL flowcytometribuffer, og gjenstand for flowcytometrianalyse30.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolonidannende enheter fibroblastisk analyse (CFU-F)<ol><li>Fortynn cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 1000 levedyktige celler / ml komplett kulturmedium.</li>
		<li>Plate ~ 500 celler per brønn i en 6-brønns vevskulturplate i komplett kulturmedium.</li>
		<li>Inkuber i 10-14 dager ved 37 °C i 5% fuktet CO2, vask med PBS og beis med 0,5% krystallfiolett i metanol i 30 min ved RT.</li>
		<li>List opp koloniene i hver brønn.</li>
		<li>Beregn CFU-F-effektiviteten: Del antall kolonier dannet av det opprinnelige såtallet for å oppnå prosentvis effektivitet av kolonidannelse, og uttrykk det som en prosentandel.</li>
	</ol></li>
	<li>Potensial for trilineage differensiering<ol><li>Frø 5 x 103 celler / cm2 i osteogenese og adipogenese differensieringsmedium i 12-brønnsplater i henhold til produsentens protokoll. For kondrogenese, klargjør 1,6 x 107 levedyktige celler / ml, og generer mikromassekulturer ved å så 5 μL dråper av celleoppløsningen i sentrene av brønnene på 96-brønnplater, i henhold til produsentens protokoll.</li>
		<li>Under differensiering, gjør komplette middels endringer hver 3-4 dager.</li>
		<li>Etter 14 dager (for adipogenese) eller 21 dager (for osteogenese og kondrogenese), overvåke kulturen for differensiering ved å bruke avstamningsspesifikke biologiske flekker i henhold til produsentens protokoll. For adipogen differensiering, flekk kulturen med 0,5% olje rød O-løsning. For osteogenese, utfør farging ved å bruke en 2% Alizarin Red S-løsning. For kondrogen differensiering, flekker mikromassepellets med 1% Alcian Blue.</li>
	</ol></li>
	<li>Cytokin sekresjon profiler<ol><li>Tine de kryopreserverte cellene høstet manuelt eller ved hjelp av motstrømssentrifugeringssystemet, og frø 5000 celler / cm2 i en T-175-kolbe med SFM XF-medier.</li>
		<li>Etter 4 dager, samle det brukte dyrkningsmediet, og oppbevar det ved -80 °C til analyse.</li>
		<li>Kvantifisere ekspresjonen av cytokiner ved hjelp av et cytokin ekspresjonsprofiler 19-plex panelsett på en multiplex leser.</li>
		<li>Utfør multiplex immunoassays i henhold til produsentens anbefalinger.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. og J.N. er ansatte i Thermo Fisher Scientific. A.L. og S.O. har ingen interessekonflikter.

I dette arbeidet har vi vist evnen til å lukke og halvautomatisere hMSC-dissosiasjon og vaske og høste på benken ved hjelp av et motstrømssentrifugeringsinstrument. Et av de kritiske trinnene i hele arbeidsflyten er å sørge for at slangene er koblet til i henhold til den forhåndsinnstilte protokollen som er definert i protokollbyggeren for motstrømssentrifugeringssystemet. Oppsettet og driften er enkel, og tiden det tok å behandle rundt 2 liter kultur fra en 10-lags kolbe fra settmontering til cellehøsting var rundt 60 minutter. Et av de begrensende trinnene i denne arbeidsflyten er væskeoverføringen fra flerlagskolben til overføringsposene som er koblet til motstrømssentrifugeringsinstrumentet. Engangssettet med høy strømning kan bare kjøres med en maksimal strømningshastighet på 165 ml / min, og dette kan være utfordrende for behandling av for eksempel en 40-lags kolbe. For å fremskynde prosessen med væskeoverføring, kan eksterne høystrømningshastighetspumper brukes til å overføre det trypsiniserte innholdet til en overføringspose først, etterfulgt av vasking / konsentrasjon og høsting av cellene fra overføringsposen ved hjelp av motstrømssentrifugeringssystemet. Videre kan denne protokollen også brukes for passerende celler fra 4-lags til 10-lags flerlags kolber. Lenger oppstrøms kan sentrifugeringssystemet for motstrøm også optimaliseres for vasking av tinte hMSC-er og direkte høsting og middels formulering i flerlagskolber for å starte frøtoget. Det skal bemerkes at det minste antall celler som kreves for å danne fluidisert seng i motstrømssentrifugeringskammeret, er ca. 30 millioner celler, og det maksimale anbefalte volumet som skal behandles per batch er 20 L.
For tiden er vedlegget av den tilpassede rørenheten til flerlagskolben i biosikkerhetsskapet og autoklaveringen av delene av komponentene ikke ønskelig i en cGMP-innstilling. Som et alternativ kan en tilpasset gamma-sterilisert rørmontering settes ut til leverandører. Leverandører som tilbyr flerlagskolber tilbyr også muligheten til å forhåndsmontere kolbene med ønskede rørenheter, inkludert et 0,2 μm filter, og gamma-sterilisering av hele antrekket. Dette vil sikre at flerlagskolbene og de vedlagte slangene virkelig er lukket, noe som betyr at prosessen kan fullføres på benken i et rent rom i klasse C.
Denne prosessen som benytter motstrømssentrifugeringssystemet er ikke begrenset til adherentbaserte dyrkede celler i et flerlagsbeholder og kan tilpasses dynamiske (omrøringstank- eller bølgebioreaktorer) og statiske (gasspermeable) suspensjonsbaserte celleekspansjonsplattformer. Spesielt for hMSC-er utvidet i 3D-mikrobærerkulturer, kan protokoller optimaliseres på motstrømssentrifugeringssystemet for å høste, vaske og formulere hMSCene som er dissosiert fra mikrobærere. 
Samlet sett har økende interesse for å utvikle translasjonelle cellulære terapier med forbedret prosessrobusthet og pålitelighet ført til utviklingen av lukkede, automatiserte cellebehandlingsplattformer. Disse systemene er avgjørende, da de reduserer antall håndteringstrinn, forhindrer potensiell forurensning av sterile tilkoblinger og reduserer produksjonskostnadene ved å redusere arbeidskraft og øke effektiv bruk av renromsplass21. I tråd med dette er mange av produktutviklerne av celleterapi som søker regulatorisk godkjenning for å oversette terapiene sine, klar over viktigheten av å lukke prosessen og implementere full automatisering eller semi-automatisering så tidlig som prosessutviklingsstadiet 14,31,32.
Ved bruk av regulatorisk vennlig SFM XF-medium, og sammen med tilleggsreagenser som er kompatible med 21 CFR GMP Part 11 og internasjonale kvalitetsretningslinjer, vil denne semi-automatiserte prosessen være lett egnet for klinisk produksjon. Vi har vist reproduserbarheten til den lukkede prosessen og opprettholdelsen av kvaliteten på WJ-MSC-ene. Forbedring av effektiviteten og sikkerheten ved dyrking av adherentbaserte celler i flerlagskolber vil ikke bare være til nytte for hMSC-terapifeltet, men også selskaper innen cellelinjebank og tilhørende virusproduksjon.

Humane mesenkymale stamceller (hMSCs) er en god kandidat for kliniske anvendelser, både i vevsteknikk og i celleterapier, gitt deres terapeutiske potensial og høye selvfornyelsespotensial for å vokse in vitro, som er kritiske for å generere klinisk relevante doser av celler 1,2,3. Ifølge ClinicalTrials.gov er det over 1000 kliniske studier som for tiden undersøkes for ulike sykdomstilstander4. Gitt bakteppet av økende interesse for å bruke hMSCs, er flere kliniske studier og markedsgodkjenninger nært forestående i nær fremtid 5,6. Produksjonen av hMSC-er har imidlertid mange iboende utfordringer når det gjelder variasjon fra parti til parti, bruk av høyrisikoråvarer, bekymringer angående forurensning på grunn av mange åpne og manuelle prosesser, ettersom produksjonen involverer flere enhetsoperasjoner, høyere lønnskostnader, kostnadene ved utskalering eller oppskalering og regulatoriske hindringer 6,7,8,9,10, 11,12. Disse problemene er fortsatt en betydelig barriere for nåværende og fremtidig markedsadgang.
Utviklingen av lukkede, modulære, automatiserte produksjonsløsninger og bruk av lavrisiko tilleggsreagenser vil løse disse utfordringene. Dette vil også sikre konsistent produktkvalitet, redusere sannsynligheten for batchfeil på grunn av menneskelige feil, redusere lønnskostnader og forbedre prosessstandardisering og overholdelse av forskrifter, for eksempel når det gjelder digital batchjournalføring 8,12,13,14. For å kunne oppnå en klinisk relevant dosering av celler, det være seg autolog eller allogen, er strømlinjeformet produksjon som involverer oppstrøms celleutvidelse og nedstrøms prosessering på en lukket, automatisert måte avgjørende.
For oppstrøms hMSC-utvidelse er de to vanligste produksjonsmetodene som for tiden brukes, utskalering (2D monolayer) og oppskalering (3D mikrobærerbasert fjæringssystem)15,16,17,18. Den mest tradisjonelle og utbredte metoden for hMSC-utvidelse er 2D monolayer-basert kultur på grunn av lave produksjonskostnader og enkel oppsett19.
Flerlags kolber sammensatt av flate overflatebrett stablet i et kulturfartøy brukes ofte til å skalere ut hMSC-produksjonen. Disse systemene kommer vanligvis i 1-lags til 40-lags kulturfartøy20 og håndteres manuelt inne i biosikkerhetsskap. Behandlingstrinnene under cellepassasje og høsting involverer manuell dispensering og dekantering av ekspansjonsmediet, dissosiasjonsreagens og vaskebuffer ved å pipettere eller fysisk vippe hele beholderen. Dessuten er håndtering av flere enheter utfordrende og tidkrevende på grunn av deres store størrelse og vekt.
Deretter er etterhøsting fra flerlagskolber, sentrifugering for medieutveksling, cellevask og volumreduksjon viktige trinn på tvers av hele arbeidsflyten for celleproduksjon21. Konvensjonell stasjonær sentrifugering er en stort sett åpen og manuell prosess som involverer en rekke trinn, for eksempel å overføre cellesuspensjonen til kappede rør eller flasker inne i et biosikkerhetsskap, spinne ned cellene, manuelt aspirere supernatanten, celleresuspensjon med bufferen og gjentatte cellevasker. Dette øker dramatisk både risikoen for kontaminering på grunn av åpning og lukking av lokkene og sjansene for å miste cellepelleten under den manuelle aspirasjons-/pipetteringsprosessen22. I sammenheng med håndtering av flerlags kultursystemer for adherentbaserte celler som hMSCs, må operatøren gå gjennom en møysommelig prosess med skytteltrafikk mellom sentrifugen og biosikkerhetsskapet gjentatte ganger og håndtere en tung enhet samtidig. Disse manuelle trinnene er arbeidskrevende, utgjør en risiko i form av menneskelige feil og forurensning, og må utføres i et rent rommiljø i klasse B, noe som er kostbart23. I tillegg er den konvensjonelle manuelle sentrifugeringsprosessen ikke skalerbar og kan forårsake cellulær skjær og stress; Dermed er maksimering av celleutvinning, levedyktighet og utvaskingseffektivitet av gjenværende urenheter andre store utfordringer22. Kommersiell cGMP-skalaproduksjon av celleterapier krever lukkede, modulære automatiseringsløsninger for å redusere risikoen for forurensning, sikre konsistent produktkvalitet, redusere arbeidskraft og produksjonskostnader og øke prosesspåliteligheten24,25. Flerlagskolber kan håndteres som et lukket system ved å ha et sterilt 0,2 μm filter i en av portene for å lette steril gassutveksling og en annen port aseptisk koblet til via kontakter eller rørsveiset direkte til et automatisert cellebehandlingsinstrument for cellehøsting. Vi jobbet mot å lukke og automatisere de fleste trinnene i WJ-hMSC-passering og høsting ved å evaluere en innovativ lukket motstrømsentrifuge beregnet for produksjon av celle-, gen- eller vevsbaserte produkter. Denne motstrømssentrifugen har også fleksibiliteten til å utføre en rekke cellebehandlingsapplikasjoner, for eksempel celleseparasjon basert på størrelse, medium/bufferutveksling, konsentrasjon og høsting for en rekke celletyper 8,26,27,28. Instrumentet bruker et lukket engangssett som kan kobles sterilt til ved hjelp av rørsveising eller aseptiske kontakter for å overføre poser eller kan kobles direkte til en hvilken som helst ekspansjonsplattform etter eget valg.
I denne studien designet vi en tilpasset rørenhet for å tillate lukkede sterile forbindelser mellom sentrifugeringssettet for motstrøm til engangsbruk og kolben med flere lag. Vi optimaliserte en protokoll for enzymatisk å løsne, vaske og høste WJ-MSC-er fra flerlagskolben på en helt lukket og halvautomatisk måte i løpet av en enkelt kjøring. De høstede WJ-hMSCene ble karakterisert for renhet (overflatemarkøranalyse) og styrke (CFU-F, trilineardifferensiering og cytokinsekresjonsprofiler) for å sikre at sluttproduktet oppfylte de kritiske kvalitetsattributtene (CQA) for partifrigjøring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

Humane mesenkymale stamceller (hMSCs) blir for tiden undersøkt som en lovende cellebasert terapeutisk modalitet for ulike sykdommer, med flere markedsgodkjenninger for klinisk bruk forventet i løpet av de neste årene. For å lette denne overgangen er det avgjørende å adressere flaskehalsene i skala, reproduserbarhet av partier, kostnader, overholdelse av forskrifter og kvalitetskontroll. Disse utfordringene kan løses ved å lukke prosessen og ta i bruk automatiserte produksjonsplattformer. I denne studien utviklet vi en lukket og halvautomatisert prosess for passering og høsting av Whartons gelé (WJ) -avledede hMSCs (WJ-hMSCs) fra flerlags kolber ved hjelp av motstrømssentrifugering. WJ-hMSCene ble utvidet ved hjelp av regulatorisk kompatibel serumfritt xenofritt (SFM XF) medium, og de viste sammenlignbar celleproliferasjon (populasjonsdobling) og morfologi til WJ-hMSC utvidet i klassiske serumholdige medier. Vår lukkede halvautomatiserte høstingsprotokoll viste høy celleutvinning (~ 98%) og levedyktighet (~ 99%). Cellene vasket og konsentrert ved hjelp av motstrømssentrifugering opprettholdt WJ-hMSC overflatemarkøruttrykk, kolonidannende enheter (CFU-F), trilineage differensieringspotensial og cytokinsekresjonsprofiler. Den halvautomatiserte cellehøstingsprotokollen utviklet i studien kan enkelt brukes til små- til mellomskala behandling av forskjellige adherent- og suspensjonsceller ved direkte tilkobling til forskjellige celleekspansjonsplattformer for å utføre volumreduksjon, vasking og høsting med lavt utgangsvolum.

WJ-hMSC master cell bank (MCB) etter tining ble opprettholdt i tre påfølgende passasjer (p1-p4) i klassisk serumholdig medium for å produsere nok fungerende cellebanker (WCB) for eksperimentene. P4 WCB ble tint og utvidet i både serumholdig medium og SFM XF-medium for ytterligere tre passasjer (p4-p7) i T-175-kolber. WJ-MSC tilpasset seg godt når de ble utvidet i SFM XF-medium og var i stand til å opprettholde stabil spredning lik den i serumholdig medium (figur 2A). Imidlertid viste cellene ekspandert i SFM XF-medium litt lengre fibroblastlignende spindelformet morfologi, noe som resulterte i en litt større cellestørrelse (figur 2B) på et gjennomsnitt på ~ 17 μm sammenlignet med ~ 15 μm i serumholdig medium. I begge middels forhold over de tre passasjene nådde WJ-hMSCene konsekvent sin maksimale celletetthet på ~ 2,3 x 104 celler / cm2 og en populasjonsdoblingstid på ~ 34 h (figur 2C, D).
For storskala WJ-hMSC-utvidelse i et lukket system, utførte vi en frøtogutvidelse av WJ-hMSC først i en 4-lags kolbe og deretter i en 10-lags flerlags kolbe. Ved rundt 80%-90% samløp etter 4 dager med kultur, høstet vi 9,6 x 10 7 ± 0,9 x 107 og 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 celler for henholdsvis 4-lags og 10-lags stabler. En høyere celletetthet på 3,6 x 10 4-3,8 x 104 celler / cm2 ble nådd sammenlignet med i T-175-kolber, noe som betyr at stablene tillot bedre celleutvidelse med opptil syv ganger.
Videre ble WJ-hMSCene utvidet i 10-lags kulturfartøy høstet direkte ved hjelp av motstrømssentrifugering. Den sterile tilkoblingen til engangssettet var enkel å etablere for direkte væskeoverføring med en maksimal strømningshastighet på 165 ml/min ved hjelp av instrumentets peristaltiske pumpe. Den semi-automatiserte cellehøstingsprosessen ble oppnådd ved først å høste cellene ved hjelp av enzymatisk dissosiasjon, laste cellene inn i motstrømskammeret for volumreduksjon og konsentrasjon, og deretter vaske med vaskebuffer, som var rundt 3x volumet av motstrømssentrifugeringskammeret. Videre ble de vaskede cellene konsentrert og høstet til ønsket høstvolum forhåndsinnstilt i protokollen. Behandlingstrinnene som ble brukt til den halvautomatiserte cellebehandlingen ble designet for å etterligne den manuelle arbeidsflyten for høsting. Vi oppnådde en volumreduksjon på 10 ganger, noe som resulterte i generering av cellekonsentrasjoner så høye som 5,3 millioner celler/ml. Protokollen var i stand til å oppnå høy celleutvinning ved ~ 98% og høy celle levedyktighet ved ~ 99% konsekvent for alle tre uavhengige kjøringer (figur 3A-C).
Vi utførte omfattende cellekarakteriseringsanalyser for å bestemme de kritiske kvalitetsegenskapene til cellehøstingen ved hjelp av motstrømssentrifugering sammenlignet med manuell sentrifugering. For å teste identiteten til WJ-hMSCene ble celleoverflatemarkører analysert ved flowcytometri. Som vist i figur 4A viste WJ-hMSCene høstet ved hjelp av begge metodene karakteristiske overflatemarkørprofiler i henhold til ISCT-forskriftene, positivt uttrykk for CD73, CD90 og CD105, samt negativt uttrykk for CD34 og CD45. Deretter, for å evaluere det klonogene potensialet til WJ-hMSC-ene, ble CFU-F-analyser utført. Som vist i figur 4B viste celler høstet fra motstrømssentrifugering et lignende CFU-F-potensial sammenlignet med celler høstet ved manuell sentrifugering (henholdsvis 21% ± 1% vs. 20% ± 1%). Videre, som vist i figur 4C, beholdt de post-motstrøms sentrifugasjonshøstede cellene evnen til å differensiere til adipocytter, osteoblaster og kondrocytter som ligner cellene i den manuelle sentrifugeringsmetoden. Til slutt undersøkte vi 18 forskjellige cytokinsekresjonsprofiler av cellene ved hjelp av multiplex immunoassays. Som vist i figur 4D opprettholdt cellene som ble vasket og konsentrert ved hjelp av sentrifugeringen etter motstrømssentrifugeringen, cytokinsekresjonsprofiler, og profilene var sammenlignbare med prøven tatt før vasking/konsentrering av cellene (sentrifugering før motstrøm).
Samlet sett har vi demonstrert effektiv hMSC-ekspansjon i et SFM XF-kultursystem, og cellene vasket og konsentrert ved hjelp av det lukkede, automatiserte motstrømssentrifugeringssystemet ga høy cellegjenoppretting og levedyktighet etter vask og kunne opprettholde fenotypen og funksjonaliteten. Den lukkede halvautomatiserte prosessen utviklet i denne studien kan levere konsistens i produktkvaliteten når det gjelder endelig WJ-MSC-utvinning, som det fremgår av tre uavhengige kjøringer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Figur 1: Høystrømnings engangssettkonfigurasjon og montering for høsting, vasking og konsentrasjon av hMSC-er . (A) Settdiagram etter at posene er koblet til i tråd med de respektive slangene. (B) Den 10-lags flerlags kolben som er koblet til engangssettet med høy strømning med den tilpassede rørenheten. (C) Visualisering av den stabile fluidiserte cellesengen dannet i motstrømskammeret via kamerafunksjonen aktivert i det grafiske brukergrensesnittet til motstrømssentrifugeringsprogramvaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Figur 2 Sammenligning av cellemorfologi og ekspansjon av hMSC i serumholdig medium og SFM XF medium. (A) Den representative cellemorfologien til hMSC i klassisk serummedium og SFM XF medium. SFM XF-utvidede celler viste en lengre, spindelformet, karakteristisk fibroblastlignende morfologi, mens cellene dyrket i serumholdig medium viste en mer flatt morfologi. (B) Den gjennomsnittlige MSC-størrelsen mellom det serumholdige mediet og SFM XF-mediet, målt med en automatisert celleteller (n = 3). Det er tydelig å se at SFM XF-utvidede celler generelt var større enn serumutvidede celler over forskjellige passasjer. Det totale celleutbyttet i forskjellige passasjer (n = 3) (C) i form av celler per dyrkningsoverflateareal og (D) populasjonsdoblingsnivåer. Tilsvarende nivåer av celleutbytte ble oppnådd mellom SFM XF-mediet og serumholdig medium over forskjellige passasjer. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Figur 3: Karakterisering av celler behandlet ved hjelp av motstrømssentrifugeringssystemet . (A) Totalt levedyktige celler før og etter vask og konsentrasjon. (B) En 10x volumreduksjon ble oppnådd sentrifugeringsbehandling etter motstrøm. (C) Total utvinning og levedyktighet av cellene. Data er gjennomsnittet over tre biologiske replikater (n = 3) av vask og konsentrasjonskjøringer. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Figur 4: Analyse av kritiske kvalitetsattributter . (A) Representative data fra flowcytometri. (B) Representative bilder som viser total CFU. (C) Representative mikroskopiske bilder av trilineagedifferensieringen. (D) Cytokinekspresjonsanalyseresultater før og etter prosessering av cellene på motstrømssentrifugeringssystemet (n = 3). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Sekvens av hMSC-høsten ved trypsinisering, vasking og konsentrasjonsprotokoll på motstrømssentrifugeringssystemet, inkludert de første grunningstrinnene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Her presenterer vi en protokoll for å høste adherente celler fra flerlags kolber på en lukket halvautomatisert måte ved hjelp av et motstrømssentrifugeringssystem. Denne protokollen kan brukes til høsting av både adherente og suspensjonsceller fra andre celleekspansjonsplattformer med få modifikasjoner av de eksisterende trinnene.

Human mesenkymal stamcellebehandling for kliniske applikasjoner ved bruk av en lukket, halvautomatisk arbeidsflyt

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

Stasjonær sentrifugering er en åpen og manuell prosess som er utfordrende å skalere. Vår protokoll viser hvordan du lukker og automatiserer dissosiasjon, vasking og høsting av mesenkymale stamceller, eller MSC, i en enkelt kjøring. Oppsettet er enkelt.Hele prosessen kan utføres utenfor biosikkerhetsskapet i et klasse cGMP-anlegg. Lukket automatisert cellebehandling reduserer manuelle håndteringstrinn som kan være utsatt for risiko og muliggjør cGMP-samsvar. Denne metoden kan brukes på andre celletyper utvidet i flerlagskultursystemer.Counterflow Centrifugation System tillater endring av protokolltrinn for forskjellige applikasjoner. Demonstrere denne prosedyren vil være Dr.Alan Lam, stab forsker fra stamcelle bioprocessing gruppe ved Bioprocessing Technology Institute, en stjerne i Singapore. For å starte monteringen av motstrømssentrifugeringssettet til engangsbruk, kobler du engangssettet til engangsposene for PVC-overføring via rørsveising, som beskrevet på bildet.Deretter, inne i et biosikkerhetsskap, fest en 10-lags flerlags kolbe som inneholder sammenflytende, Whartons Jelly-avledede humane mesenkymale stamceller eller Wharton's Jelly HMSCs til den tilpassede rørenheten. Overfør det vedlagte 10-lags kulturfartøyet med den tilpassede rørenheten til en benk og sveis den til linje E i engangssettet. Også. sveis en steril prøveport til linje G i høyflyt-engangssettet.Deretter kobler du høstelinjen H til en steril lokke, utstyrt med en 50 ml sprøyte. For å konfigurere instrumentkjøringen, slå på instrumentet ved hjelp av vippebryteren på baksiden av instrumentet og koble den bærbare datamaskinen til USBC-porten på instrumentet ved hjelp av den medfølgende USBC-kabelen. Kjør Counterflow Centrifuge Graphical User Interface, eller GUI-programvaren fra skrivebordet eller startmenyen, og logg på.Last deretter inn protokollen ved å klikke på Velg en protokoll-knappen på hovedvelkomstsiden. Deretter trykker du på den blå opplåsingsknappen på instrumentet og åpner glassdøren for å laste det monterte engangssettet på motstrømssentrifugeringssystemet. Start med å henge posene på hengerkrokene i en rekkefølge som passer dem best opp med rørportene på boblesensorstrimlene med den 10-lags flerlags kolben plassert i vinkel.Still inn settet med de to knappene for settplassering. Strekk pumpeslangen rundt den peristaltiske pumpen og trykk den hvite pæreformede kontakten på plass. Fest sentrifugekammeret ved å løfte sølvspaken på motstrømssentrifugekammerholderen og feste den ved å returnere spaken til oppreist stilling.Trykk slangen fra hver port på settet inn i sporene langs boblesensorstrimlene. Lukk døren ved å trykke ned på dørlåsen. Trykk på Initiere-knappen på GUI-en.En sjekkliste vises. De fire første elementene er instrumentkontroller, mens de to siste er brukerkontroller. På dette tidspunktet må du sørge for at posene og tilkoblingene samsvarer med settbildet og at de manuelle klemmene er åpne.Trykk på Bekreft for å vise skjermbildet Protokollinnganger. Sett verdien for dialogboksen for dataregistrering eller høstvolum til 45 milliliter, og trykk på Bekreft. Trykk på den grønne startknappen på instrumentet for å starte protokollkjøringen.Når den første grunningen er fullført, må du sørge for at det brukte mediet pumpes helt ut i avfallsposen. I pausetrinn som markert i arbeidsflyttabellen, løfter du kolben med flere lag opp og rister den for å fordele bufferen likt til alle skuffene. Når du er ferdig, plasserer du den 10-lags flerlags kolben tilbake i sin opprinnelige tegneposisjon for de neste trinnene.I trinn 20 og 23 må du sørge for at de trypsiniserte cellene overføres helt til mellomposen. Bland mellomposen godt, manuelt, i trinn 25. I trinn 26, bruk en to milliliter lokkesprøyte for å prøve gjennom prøvetakingsporten.I trinn 29 og 30 kontrollerer du den stabile dannelsen av den fluidiserte cellesengen. Det skal være som den fluidiserte cellesengen vist her. Kjøringen fullføres ved trinnet for å stoppe rampen, og alle knipeverdiene på motstrømssentrifugeringssystemet lukkes automatisk.Etter at protokollkjøringen er fullført, trykker du på den blå opplåsingsknappen på instrumentet og åpner glassdøren. Forsegle slaktelinjen aseptisk ved hjelp av en håndbærende rørforsegler og overfør forsiktig den forseglede sprøyten fylt med konsentrert cellehøsting til det biologiske sikkerhetsskapet for celletelling og kryopreservering. Løsne kammeret igjen ved hjelp av spaken.Trekk pærekontakten ut av beslaget og løft settet forsiktig bort og kast det i en biohazard-pose. Rengjør instrumentet med etanolservietter og lukk døren. Til slutt lukker du GUI-applikasjonen først før du slår av bryteren på baksiden av instrumentet.Wharton's Jelly MSCs spredte seg godt når de ble utvidet i både serumholdige og serumfrie, xenofrie medier. Imidlertid viste de i serumfritt, xenofritt medium litt lengre fibroblastlignende spindelformet morfologi, med en større gjennomsnittlig cellestørrelse på 17 mikron, sammenlignet med 15 mikron i serummedium. I begge medier på tvers av de tre passasjene nådde Whartons Jelly HMSCs konsekvent en maksimal celletetthet på ca. 23 000 celler per kvadratcentimeter og en populasjonsdoblingstid på 34 timer.Når Whartons Jelly HMSC-er ble utvidet i 10-lags kulturbeholdere ved bruk av demonstrert motstrømssentrifugering, ble det oppnådd en ti ganger volumreduksjon, og genererte cellekonsentrasjoner så høye som 5, 3 millioner celler per milliliter. Protokollen oppnådde konsekvent en høy celleutvinning på ca. 98 % og en høy cellelevedyktighet på ca. 99 % for tre uavhengige kjøringer. Wharton's Jelly HMSCs høstet ved hjelp av begge metodene viste karakteristiske overflatemarkørprofiler som er CD73, CD90 og CD105 positive, samt CD34 og CD45 negative.Cellene høstet fra motstrømssentrifugering viste en lignende kolonidannende enhetsfibroblastanalyse eller CFU-potensial, sammenlignet med de som ble høstet ved manuell sentrifugering. I begge metodene beholdt cellene evnen til å differensiere til adipocytter, osteoblaster og kondrocytter. Cytokinsekresjonsprofilene til celler etter motstrømssentrifugering var sammenlignbare med sentrifugering før motstrøm.Sørg for å montere engangssettet med referanse til sengeoppsettet, forskyv det i denne protokollbyggeren for motstrømssentrifusjonssystem. Protokollen for vasking av resturenheter fra sluttproduktet kan brukes i kliniske applikasjoner for å støtte brukerne i å oppfylle kriteriene for partifrigjøring. For å fremskynde prosessen med væskeoverføring for storskala prosessering, kan eksterne pumper brukes til å overføre trypsinisert innhold til en overføringspose først, i stedet for direkte høsting fra flerlagskolben.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkel manipulering av arkitekturer i Protein-basert Hydrogels for celle kultur programmer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Disseksjon av Human netthinnen og RPE-akkord for Proteomic analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

En Fluorogenic peptid Cleavage analysen til skjermen for proteolytiske: programmer for coronavirus pigge protein aktivisering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatisert fluorescerende måling av luftveiene overflaten flytende pH av primær menneskelige Luftveisepitel celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...