Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
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Os autores gostariam de agradecer o apoio do financiamento do Fundo de Alinhamento da Indústria (IAF-PP) (H18/01/a0/021 e H18/AH/a0/001) da A*STAR, Cingapura.

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	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. e J.N. são funcionários da Thermo Fisher Scientific. A.L. e S.O. não têm conflitos de interesse.

Neste trabalho, mostramos a capacidade de fechar e semi-automatizar a dissociação de hMSC e lavar e colher na bancada usando um instrumento de centrifugação contrafluxo. Uma das etapas críticas em todo o fluxo de trabalho é garantir que as tubulações estejam conectadas de acordo com o protocolo predefinido definido no construtor de protocolos do sistema de centrifugação de contrafluxo. A configuração e operação são simples, e o tempo necessário para processar cerca de 2 L de cultura de um frasco de 10 camadas desde a montagem do kit até a colheita celular foi de cerca de 60 min. Uma das etapas limitantes desse fluxo de trabalho é a transferência de fluido do frasco multicamadas para os sacos de transferência conectados ao instrumento de centrifugação em contrafluxo. O kit de uso único de alto fluxo só pode ser executado a uma vazão máxima de 165 mL/min, e isso pode ser um desafio para o processamento, por exemplo, de um frasco de 40 camadas. Para acelerar o processo de transferência de fluidos, bombas externas de alta vazão podem ser usadas para transferir o conteúdo tripsinizado para um saco de transferência primeiro, seguido de lavar/concentrar e colher as células do saco de transferência usando o sistema de centrifugação em contrafluxo. Além disso, este protocolo também pode ser aplicado para células de passagem de frascos multicamadas de 4 camadas para 10 camadas. Mais a montante, o sistema de centrifugação em contrafluxo também pode ser otimizado para a lavagem de hMSCs descongeladas e colheita direta e formulação média em frascos multicamadas para iniciar o trem de sementes. Deve-se notar que o número mínimo de células necessárias para formar o leito fluidizado na câmara de centrifugação em contrafluxo é de aproximadamente 30 milhões de células, e o volume máximo recomendado para processar por lote é de 20 L.
Atualmente, a fixação do conjunto de tubos personalizados ao frasco multicamadas no gabinete de biossegurança e a autoclavagem das partes dos componentes não são desejáveis em uma configuração de GMPc. Como alternativa, um conjunto de tubos esterilizado por gama personalizado poderia ser terceirizado para fornecedores. Os fornecedores que fornecem frascos multicamadas também oferecem a opção de pré-encaixar os frascos com os conjuntos de tubulação desejados, incluindo um filtro de 0,2 μm e esterilização gama de todo o equipamento. Isso garantiria que os frascos de várias camadas e a tubulação anexada fossem realmente fechados, o que significa que o processo poderia ser concluído na bancada em uma configuração de sala limpa Classe C.
Este processo utilizando o sistema de centrifugação em contrafluxo não se limita a células cultivadas com base aderente em um vaso multicamadas e pode ser adaptado a plataformas de expansão de células dinâmicas (tanque agitado ou biorreatores de ondas) e estáticas (permeáveis a gás). Especificamente, para hMSCs expandidas em culturas de microcarreadores 3D, os protocolos podem ser otimizados no sistema de centrifugação de contrafluxo para colher, lavar e formular as hMSCs dissociadas de microportadores. 
Em geral, o crescente interesse no desenvolvimento de terapias celulares translacionais com maior robustez e confiabilidade do processo levou ao desenvolvimento de plataformas de processamento celular fechadas e automatizadas. Esses sistemas são imperativos, pois reduzem o número de etapas de manuseio, evitam possíveis contaminações por conexões estéreis e reduzem os custos de fabricação, reduzindo a mão de obra e aumentando o uso efetivo do espaço da sala limpa21. Em consonância com isso, muitos dos desenvolvedores de produtos de terapia celular que estão buscando aprovação regulatória para traduzir suas terapias estão cientes da importância de fechar o processo e implementar a automação total ou semi-automação já na fase de desenvolvimento do processo 14,31,32.
Com o uso de meio SFM XF de fácil regulamentação e juntamente com reagentes auxiliares em conformidade com 21 CFR GMP Parte 11 e diretrizes internacionais de qualidade, esse processo semi-automatizado seria prontamente adequado para fabricação clínica. Mostramos a reprodutibilidade do processo fechado e a manutenção da qualidade das CTMs-WJ. Melhorar a eficiência e a segurança da cultura de células baseadas em aderentes em frascos multicamadas beneficiaria não apenas o campo da terapia hMSC, mas também empresas no banco de linhagens celulares e produção de vírus aderentes.

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) são uma grande candidata para aplicações clínicas, tanto na engenharia tecidual quanto em terapias celulares, dado seu potencial terapêutico e alto potencial de autorrenovação para crescer in vitro, que são fundamentais para gerar dosagens clinicamente relevantes de células 1,2,3. De acordo com ClinicalTrials.gov, existem mais de 1.000 ensaios clínicos atualmente em investigação para várias condições da doença4. Dado o cenário de crescente interesse no uso de hMSCs, mais ensaios clínicos e aprovações no mercado são iminentes em um futuro próximo 5,6. No entanto, a fabricação de hMSCs tem muitos desafios inerentes em termos de variabilidade lote a lote, o uso de matérias-primas de alto risco, preocupações com relação à contaminação devido a muitos processos abertos e manuais, já que a fabricação envolve múltiplas operações unitárias, custos de mão de obra mais altos, o custo de expansão ou ampliação e obstáculos regulatórios 6,7,8,9,10, 11,12. Estas questões continuam a ser um obstáculo significativo ao acesso actual e futuro ao mercado.
O desenvolvimento de soluções de fabricação fechadas, modulares e automatizadas e o uso de reagentes auxiliares de baixo risco resolveriam esses desafios. Isso também garantiria a qualidade consistente do produto, diminuiria a probabilidade de falhas de lote devido a erro humano, reduziria os custos de mão de obra e melhoraria a padronização do processo e a conformidade regulatória, como em termos de registro digital de lotes 8,12,13,14. Para ser capaz de obter uma dosagem clinicamente relevante de células, seja ela autóloga ou alogênica, a fabricação simplificada que envolve expansão celular a montante e processamento a jusante de forma fechada e automatizada é crucial.
Para expansão hMSC upstream, os dois métodos de fabricação mais comuns atualmente empregados são scale-out (monocamada 2D) e scale-up (sistema de suspensão baseado em microtransportador 3D)15,16,17,18. O método mais tradicional e amplamente adotado para expansão de hMSC é a cultura 2D baseada em monocamadas, devido ao baixo custo de produção e facilidade de instalação19.
Frascos multicamadas compostos por bandejas de superfície plana empilhadas dentro de um recipiente de cultura são comumente utilizados para expandir a produção de hMSC. Esses sistemas normalmente vêm em recipientes de cultura de 1 camada a 40 camadas20 e são manuseados manualmente dentro de gabinetes de biossegurança. As etapas de processamento durante a passagem celular e colheita envolvem a dispensação e decantação manual do meio de expansão, reagente de dissociação e tampão de lavagem por pipetagem ou inclinação física de todo o recipiente. Além disso, o manuseio de várias unidades é desafiador e demorado devido ao seu tamanho e peso.
Posteriormente, a pós-colheita de frascos multicamadas, a centrifugação para troca de meios, a lavagem celular e a redução de volume são etapas essenciais em todo o fluxo de trabalho de fabricação de células21. A centrifugação convencional de bancada é um processo principalmente aberto e manual que envolve uma infinidade de etapas, como transferir a suspensão da célula para tubos tampados ou garrafas dentro de um gabinete de biossegurança, girar as células, aspirar manualmente o sobrenadante, ressuspensão celular com o tampão e lavagens repetidas das células. Isso aumenta drasticamente tanto o risco de contaminação pela abertura e fechamento das tampas quanto as chances de perda do pellet celular durante o processo de aspiração/pipetagem manual22. No contexto do manuseio de sistemas de cultura multicamadas para células baseadas em aderentes, como hMSCs, o operador precisaria passar por um processo trabalhoso de transporte entre a centrífuga e o gabinete de biossegurança repetidamente e manusear uma unidade pesada ao mesmo tempo. Essas etapas manuais são trabalhosas, oferecem riscos em termos de erros humanos e contaminação e devem ser conduzidas em um ambiente de sala limpa Classe B, o que é dispendioso23. Além disso, o processo de centrifugação manual convencional não é escalável e pode causar cisalhamento e tensão celular; Assim, maximizar a recuperação celular, a viabilidade e a eficiência de wash-out de impurezas residuais são outros grandes desafios22. A fabricação comercial de terapias celulares em escala cGMP requer soluções de automação modulares e fechadas para reduzir o risco de contaminação, garantir a qualidade consistente do produto, reduzir os custos de mão de obra e produção e aumentar a confiabilidade do processo24,25. Os frascos multicamadas podem ser manuseados como um sistema fechado por ter um filtro estéril de 0,2 μm em uma das portas para facilitar a troca gasosa estéril e uma segunda porta conectada assepticamente através de conectores ou soldada por tubo diretamente a um instrumento automatizado de processamento de células para colheita de células. Trabalhamos para fechar e automatizar a maioria das etapas de passagem e colheita do WJ-hMSC, avaliando uma centrífuga de contrafluxo fechada inovadora destinada à fabricação de produtos baseados em células, genes ou tecidos. Essa centrífuga de contrafluxo também tem flexibilidade para realizar uma variedade de aplicações de processamento celular, como separação celular baseada em tamanho, troca meio/tampão, concentração e colheita para uma variedade de tipos celulares 8,26,27,28. O instrumento usa um kit fechado de uso único que pode ser conectado estéril usando soldagem de tubo ou conectores assépticos para transferir sacos ou pode ser conectado diretamente a qualquer plataforma de expansão de escolha.
Neste estudo, projetamos um conjunto de tubos personalizado para permitir conexões estéreis fechadas entre o kit de centrifugação contrafluxo de uso único e o frasco multicamadas. Otimizamos um protocolo para separar, lavar e colher enzimaticamente as CTMs WJ do frasco multicamadas de forma totalmente fechada e semi-automatizada em uma única execução. As WJ-hMSCs colhidas foram caracterizadas quanto à pureza (análise de marcadores de superfície) e potência (UFC-F, diferenciação de trilinhagens e perfis de secreção de citocinas) para garantir que o produto final atendesse aos atributos críticos de qualidade (CQAs) para liberação do lote.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) estão sendo exploradas atualmente como uma modalidade terapêutica baseada em células promissora para várias doenças, com mais aprovações de mercado para uso clínico esperadas nos próximos anos. Para facilitar essa transição, é fundamental abordar os gargalos de escala, reprodutibilidade de lote a lote, custo, conformidade regulatória e controle de qualidade. Esses desafios podem ser resolvidos fechando o processo e adotando plataformas automatizadas de fabricação. Neste estudo, desenvolvemos um processo fechado e semi-automatizado para passagem e colheita de hMSCs derivadas da geleia de Wharton (WJ) (WJ-hMSCs) de frascos multicamadas usando centrifugação em contrafluxo. As WJ-hMSCs foram expandidas usando meio livre de xeno livre de soro (SFM XF) compatível com a regulamentação, e mostraram proliferação celular comparável (duplicação populacional) e morfologia às WJ-hMSCs expandidas em meios clássicos contendo soro. Nosso protocolo fechado de colheita semi-automatizada demonstrou alta recuperação celular (~98%) e viabilidade (~99%). As células lavadas e concentradas por centrifugação em contrafluxo mantiveram a expressão do marcador de superfície WJ-hMSC, unidades formadoras de colônias (UFC-F), potencial de diferenciação de trilinhagens e perfis de secreção de citocinas. O protocolo semi-automatizado de colheita de células desenvolvido no estudo pode ser facilmente aplicado para o processamento em pequena a média escala de várias células aderentes e de suspensão, conectando-se diretamente a diferentes plataformas de expansão celular para realizar redução de volume, lavagem e colheita com um baixo volume de produção.

O banco de células mestras (MCB) WJ-hMSC pós-descongelamento foi mantido por três passagens sucessivas (p1-p4) em meio clássico contendo soro para produzir bancos de células de trabalho (WCBs) suficientes para os experimentos. Os WCBs p4 foram descongelados e expandidos em meio contendo soro e SFM XF por mais três passagens (p4-p7) em frascos T-175. As CTMs WJ adaptaram-se bem quando expandidas em meio SFM XF e foram capazes de manter proliferação estável semelhante à do meio contendo soro (Figura 2A). No entanto, as células expandidas no meio SFM XF exibiram morfologia fusiforme semelhante a fibroblastos ligeiramente mais longa, resultando em um tamanho celular ligeiramente maior (Figura 2B) de uma média de ~17 μm em comparação com ~15 μm em meio contendo soro. Em ambas as condições médias ao longo das três passagens, as WJ-hMSCs atingiram consistentemente sua densidade celular máxima de ~2,3 x 104 células/cm2 e um tempo de duplicação populacional de ~34 h (Figura 2C,D).
Para expansão em larga escala de WJ-hMSC em sistema fechado, foi realizada uma expansão em trem de sementes de WJ-hMSCs primeiro em um frasco de 4 camadas e, posteriormente, em um frasco multicamadas de 10 camadas. Em torno de 80%-90% de confluência após 4 dias de cultivo, colhemos 9,6 x 107 ± 0,9 x 107 e 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 células para as pilhas de 4 e 10 camadas, respectivamente. Uma maior densidade celular de 3,6 x 10 4-3,8 x 104 células/cm 2 foi alcançada em comparação com os frascos T-175, o que significa que as pilhas permitiram melhor expansão celular em até sete vezes.
Além disso, as WJ-hMSCs expandidas em recipientes de cultura de 10 camadas foram colhidas diretamente usando centrifugação em contrafluxo. A conexão estéril ao kit de uso único foi fácil de estabelecer para transferência direta de fluidos a uma taxa de fluxo máxima de 165 mL/min usando a bomba peristáltica do instrumento. O processo semi-automatizado de colheita de células foi obtido primeiramente pela colheita das células usando dissociação enzimática, carregando as células na câmara de contrafluxo para redução de volume e concentração e, em seguida, lavando com tampão de lavagem, que era em torno de 3x o volume da câmara de centrifugação de contrafluxo. Em seguida, as células lavadas foram então concentradas e colhidas até o volume de colheita desejado preestabelecido no protocolo. As etapas de processamento usadas para o processamento de células semi-automatizadas foram projetadas para emular o fluxo de trabalho de colheita manual. Obtivemos uma redução de 10 vezes no volume, resultando na geração de concentrações celulares de até 5,3 milhões de células/mL. O protocolo foi capaz de alcançar alta recuperação celular em ~98% e alta viabilidade celular em ~99% consistentemente para todos os três ensaios independentes (Figura 3A-C).
Realizamos extensos ensaios de caracterização celular para determinar os atributos críticos de qualidade da colheita celular usando centrifugação em contrafluxo em comparação com a centrifugação manual. Para testar a identidade das WJ-hMSCs, marcadores de superfície celular foram analisados por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4A, as WJ-hMSCs colhidas usando ambos os métodos apresentaram perfis característicos de marcadores de superfície de acordo com as normas da ISCT, expressão positiva de CD73, CD90 e CD105, bem como expressão negativa de CD34 e CD45. Em seguida, para avaliar o potencial clonogênico das WJ-hMSCs, foram realizados ensaios de UFC-F. Como mostrado na Figura 4B, as células colhidas da centrifugação em contrafluxo apresentaram um potencial CFU-F semelhante em comparação com as células colhidas por centrifugação manual (21% ± 1% vs. 20% ± 1%, respectivamente). Além disso, como mostrado na Figura 4C, as células colhidas por centrifugação pós-contrafluxo mantiveram a capacidade de diferenciação em adipócitos, osteoblastos e condrócitos semelhante às células do método de centrifugação manual. Por fim, investigamos 18 diferentes perfis de secreção de citocinas das células usando imunoensaios multiplex. Como mostrado na Figura 4D, as células lavadas e concentradas por centrifugação pós-contrafluxo mantiveram o perfil de secreção de citocinas, e os perfis foram comparáveis aos da amostra colhida antes da lavagem/concentração das células (centrifugação pré-contrafluxo).
Em geral, demonstramos uma expansão eficiente de hMSC em um sistema de cultura SFM XF, e as células lavadas e concentradas usando o sistema de centrifugação em contrafluxo fechado e automatizado produziram alta recuperação e viabilidade celular pós-lavagem e puderam manter seu fenótipo e funcionalidade. O processo semi-automatizado fechado desenvolvido neste estudo pode fornecer consistência na qualidade do produto em termos de recuperação final do WJ-MSC, como evidenciado a partir de três execuções independentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Figura 1: Configuração e montagem do kit de uso único de alto fluxo para a colheita, lavagem e concentração de hMSCs . (A) Diagrama do kit após os sacos terem sido conectados em linha com a respectiva tubulação. (B) O balão multicamadas de 10 camadas conectado ao kit de uso único de alto fluxo com o conjunto de tubulação personalizado. (C) Visualização do leito celular fluidizado estável formado na câmara de contrafluxo através da função de câmera habilitada na interface gráfica do usuário do software de centrifugação contrafluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Figura 2: Comparação da morfologia celular e expansão das hMSCs em meio contendo soro e meio SFM XF. (A) A morfologia celular representativa das hMSCs em meio sorológico clássico e meio SFM XF. As células expandidas por SFM XF exibiram uma morfologia mais longa, fusiforme e característica semelhante a fibroblastos, enquanto as células crescidas em meio contendo soro exibiram uma morfologia mais achatada. (B) O tamanho médio das CTM entre o meio contendo soro e o meio SFM XF, medido por um contador automático de células (n = 3). É claro ver que as células expandidas por SFM XF eram geralmente maiores do que as células expandidas pelo soro em diferentes passagens. O rendimento celular total em diferentes passagens (n= 3) (C) em termos de células por área de superfície de cultura e (D) níveis de duplicação populacional. Níveis semelhantes de rendimento celular foram obtidos entre o meio SFM XF e o meio contendo soro em diferentes passagens. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Figura 3: Caracterização das células processadas pelo sistema de centrifugação em contrafluxo . (A) Total de células viáveis antes e após a lavagem e concentração. (B) Uma redução de 10x no volume foi obtida após o processamento de centrifugação em contrafluxo. (C) Recuperação total e viabilidade das células. Os dados são calculados em média em três repetições biológicas (n = 3) de lavagens e concentrações de corridas. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Figura 4: Análise crítica dos atributos de qualidade . (A) Dados representativos da citometria de fluxo. (B) Imagens representativas mostrando o total de UFC. (C) Imagens microscópicas representativas da diferenciação da trilinhagem. (D) Resultados da análise da expressão de citocinas antes e após o processamento das células no sistema de centrifugação em contrafluxo (n = 3). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Sequência da colheita das hMSC por protocolo de tripsinização, lavagem e concentração no sistema de centrifugação em contrafluxo, incluindo as etapas iniciais de condicionamento osmótico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

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Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Apresentamos aqui um protocolo para colheita de células aderentes de frascos multicamadas de forma semi-automatizada fechada usando um sistema de centrifugação em contrafluxo. Este protocolo pode ser aplicado para a colheita de células aderentes e em suspensão de outras plataformas de expansão celular com poucas modificações nas etapas existentes.

Processamento de células-tronco mesenquimais humanas para aplicações clínicas usando um fluxo de trabalho semi-automatizado fechado

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

A centrifugação de bancada é um processo aberto e manual que é desafiador de escalar. Nosso protocolo mostra como fechar e automatizar a dissociação, lavagem e coleta de células-tronco mesenquimais, ou CTMs, em uma única execução. A configuração é simples.Todo o processo pode ser realizado fora do gabinete de biossegurança em uma instalação de classe cGMP. O processamento automatizado fechado de células reduz as etapas de manuseio manual que poderiam ser propensas a riscos e permite a conformidade com cGMP. Este método pode ser aplicado a outros tipos celulares expandidos em sistemas de cultura multicamadas.O Sistema de Centrifugação em Contrafluxo permite a modificação de quaisquer etapas do protocolo para diferentes aplicações. Quem demonstrará esse procedimento será o Dr. Alan Lam, cientista da equipe do grupo de bioprocessamento de células-tronco do Instituto de Tecnologia de Bioprocessamento, uma estrela em Cingapura. Para iniciar a montagem do kit de centrifugação de contrafluxo de uso único, conecte o kit de uso único com os sacos de transferência de PVC de uso único por meio de soldagem de tubo, conforme descrito na imagem.Em seguida, dentro de um gabinete de biossegurança, conecte um frasco multicamadas de 10 camadas contendo células-tronco mesenquimais humanas derivadas da Geleia da Wharton ou HMSCs Jelly da Wharton ao conjunto de tubos personalizados. Transfira o recipiente de cultura de 10 camadas anexado com o conjunto de tubulação personalizado para uma bancada e solde-o à linha E do kit de uso único. Também. soldar uma porta de amostra estéril à linha G do kit de uso único de alto fluxo.Em seguida, conecte a linha de colheita H a uma isca estéril, equipada com uma seringa de 50 mililitros. Para configurar o funcionamento do instrumento, ligue o instrumento usando o botão de alternância na parte traseira do instrumento e conecte o laptop à porta USBC do instrumento usando o cabo USBC fornecido. Execute a Centrifugação de Contrafluxo, a Interface Gráfica do Usuário ou o software GUI na área de trabalho ou no menu Iniciar e faça login.Em seguida, carregue o protocolo clicando no botão Selecionar um protocolo na página de boas-vindas principal. Em seguida, pressione o botão azul de destravamento no instrumento e abra a porta de vidro para carregar o kit de uso único montado no Sistema de Centrifugação de Contrafluxo. Comece pendurando os sacos nos ganchos do cabide em uma ordem que os alinhe melhor com as portas do tubo nas tiras do sensor de bolhas com o frasco multicamadas de 10 camadas colocado em um ângulo.Alinhe o kit com os dois botões de localização do kit. Estique a tubulação da bomba ao redor da bomba peristáltica e pressione o conector em forma de bulbo branco no lugar. Conecte a câmara centrífuga levantando a alavanca de prata do suporte da câmara centrífuga de contrafluxo e prendendo-a devolvendo a alavanca à sua posição vertical.Pressione a tubulação de cada porta do kit nas trilhas ao longo das tiras do sensor de bolhas. Feche a porta pressionando a trava da porta. Pressione o botão Iniciar na GUI.Uma lista de verificação será exibida. Os quatro primeiros itens são verificações de instrumentos, enquanto os dois últimos são verificações de usuários. Neste ponto, verifique se as bolsas e conexões correspondem à imagem do kit e se as abraçadeiras manuais estão abertas.Pressione Confirmar para mostrar a tela Entradas de protocolo. Defina o valor da caixa de diálogo de entrada de dados ou volume de colheita como 45 mililitros e pressione Confirmar. Pressione o botão verde Iniciar no instrumento para iniciar a execução do protocolo.Uma vez concluído o priming inicial, certifique-se de que o meio gasto seja completamente bombeado para o saco de resíduos. Nas etapas de pausa marcadas na tabela de fluxo de trabalho, levante o frasco de várias camadas e agite-o para distribuir o buffer igualmente por todas as bandejas. Depois de concluído, coloque o frasco multicamadas de 10 camadas de volta em sua posição original de tração para as próximas etapas.Nas etapas 20 e 23, certifique-se de que as células tripsinizadas sejam transferidas completamente para a bolsa intermediária. Misture bem o saco intermediário, manualmente, no passo 25. Na etapa 26, use uma seringa de isca de dois mililitros para coletar amostras através da porta de amostragem.Nas etapas 29 e 30, verificar a formação estável do leito celular fluidizado. Deve ser como o leito celular fluidizado mostrado aqui. A corrida é concluída na etapa de rampa para parada, e todos os valores de pinça no Sistema de Centrifugação de Contrafluxo serão fechados automaticamente.Após a conclusão da execução do protocolo, pressione o botão azul de desbloqueio no instrumento e abra a porta de vidro. Sele assepticamente a linha de colheita usando um selador de tubo de transporte manual e transfira cuidadosamente a seringa selada preenchida com a colheita de células concentradas para o gabinete de segurança biológica para contagem de células e criopreservação. Desconecte a câmara novamente usando a alavanca.Puxe o conector da lâmpada para fora de seu encaixe e levante cuidadosamente o kit e descarte-o em um saco de risco biológico. Limpe o instrumento com lenços umedecidos a etanol e feche a porta. Finalmente, feche o aplicativo GUI primeiro antes de desligar o interruptor na parte traseira do instrumento.As CTMs de geleia da Wharton proliferaram bem quando expandidas em mídias contendo e sem soro e sem xeno. No entanto, aqueles em meio livre de soro e xeno exibiram morfologia fusiforme semelhante a fibroblastos ligeiramente mais longa, com um tamanho celular médio maior de 17 mícrons, em comparação com 15 mícrons no meio de soro. Em ambas as mídias, nas três passagens, os HMSCs de geleia da Wharton atingiram consistentemente uma densidade celular máxima de cerca de 23.000 células por centímetro quadrado e um tempo de duplicação populacional de 34 horas.Quando os HMSCs de geleia de Wharton foram expandidos em vasos de cultura de 10 camadas usando a centrifugação contrafluxo demonstrada, uma redução de volume de dez vezes foi alcançada, gerando concentrações celulares de até 5,3 milhões de células por mililitro. O protocolo consistentemente alcançou uma alta recuperação celular de cerca de 98% e uma alta viabilidade celular de cerca de 99% para três corridas independentes. Os HMSCs de Geleia da Wharton colhidos usando ambos os métodos exibiram perfis característicos de marcadores de superfície que são CD73, CD90 e CD105 positivos, bem como CD34 e CD45 negativos.As células colhidas da centrifugação em contrafluxo exibiram um ensaio unitário de fibroblastos ou potencial de UFC semelhante à unidade formadora de colônias, em comparação com aquelas colhidas por centrifugação manual. Em ambos os métodos, as células mantiveram a capacidade de se diferenciar em adipócitos, osteoblastos e condrócitos. O perfil de secreção de citocinas das células pós-centrifugação em contrafluxo foi comparável ao da centrifugação pré-contrafluxo.Certifique-se de montar o kit de uso único com referência à configuração da cama, desloque-o neste Construtor de Protocolo de Sistema de Centrifusão de Contrafluxo. O protocolo de lavagem de impurezas residuais do produto final pode ser utilizado em aplicações clínicas para auxiliar os usuários no cumprimento dos critérios de liberação de lotes. Para acelerar o processo de transferência de fluidos para processamento em larga escala, bombas externas podem ser usadas para transferir o conteúdo tripsinizado para um saco de transferência primeiro, em vez de colher diretamente do frasco de várias camadas.

Research

JoVE Journal

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