Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
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Los autores desean agradecer el apoyo de la financiación del Fondo de Alineación de la Industria (IAF-PP) (H18/01/a0/021 y H18/AH/a0/001) de A*STAR, Singapur.

<ol>
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P.J., A.B., R.L. y J.N. son empleados de Thermo Fisher Scientific. A.L. y S.O. no tienen conflictos de intereses.

En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de cerrar y semiautomatizar la disociación de hMSC y lavar y cosechar en el banco utilizando un instrumento de centrifugación de contraflujo. Uno de los pasos críticos en todo el flujo de trabajo es asegurarse de que los tubos estén conectados de acuerdo con el protocolo preestablecido definido en el generador de protocolos del sistema de centrifugación de contraflujo. La configuración y el funcionamiento son sencillos, y el tiempo necesario para procesar alrededor de 2 L de cultivo desde un matraz de 10 capas desde el montaje del kit hasta la cosecha de células fue de unos 60 minutos. Uno de los pasos limitantes en este flujo de trabajo es la transferencia de fluido desde el matraz multicapa a las bolsas de transferencia conectadas al instrumento de centrifugación de contraflujo. El kit de un solo uso de alto caudal solo puede funcionar a un caudal máximo de 165 ml/min, y esto podría ser un reto para el procesamiento, por ejemplo, de un matraz de 40 capas. Para acelerar el proceso de transferencia de fluidos, se pueden usar bombas externas de alto caudal para transferir primero el contenido tripsinizado a una bolsa de transferencia, seguido de lavar / concentrar y recolectar las células de la bolsa de transferencia utilizando el sistema de centrifugación de contraflujo. Además, este protocolo también se puede aplicar para pasar celdas de matraces multicapa de 4 capas a 10 capas. Más arriba, el sistema de centrifugación de contraflujo también podría optimizarse para el lavado de hMSC descongelados y la cosecha directa y la formulación media en matraces de varias capas para iniciar el tren de semillas. Cabe señalar que el número mínimo de células necesarias para formar el lecho fluidizado en la cámara de centrifugación de contraflujo es de aproximadamente 30 millones de células, y el volumen máximo recomendado para procesar por lote es de 20 L.
Actualmente, la fijación del conjunto de tubos personalizado al matraz multicapa en el gabinete de bioseguridad y el esterilizado en autoclave de las partes de los componentes no son deseables en un entorno cGMP. Como alternativa, un conjunto de tubos esterilizado gamma personalizado podría subcontratarse a proveedores. Los proveedores que proporcionan matraces multicapa también ofrecen la opción de preajustar los matraces con los conjuntos de tubos deseados, incluido un filtro de 0,2 μm, y la esterilización gamma de todo el equipo. Esto aseguraría que los matraces de varias capas y los tubos conectados estén realmente cerrados, lo que significa que el proceso podría completarse en el banco en un entorno de sala limpia de Clase C.
Este proceso que utiliza el sistema de centrifugación de contraflujo no se limita a células cultivadas basadas en adherentes en un recipiente de múltiples capas y podría adaptarse a plataformas de expansión de celdas dinámicas (biorreactores de tanque agitado o de onda) y estáticas (permeables al gas). Específicamente, para hMSC expandidos en cultivos de microportadores 3D, los protocolos se pueden optimizar en el sistema de centrifugación de contraflujo para cosechar, lavar y formular los hMSC disociados de los microportadores. 
En general, el creciente interés en el desarrollo de terapias celulares traslacionales con una mayor robustez y fiabilidad del proceso ha llevado al desarrollo de plataformas de procesamiento celular cerradas y automatizadas. Estos sistemas son imprescindibles, ya que reducen el número de pasos de manipulación, evitan la contaminación potencial por conexiones estériles y reducen los costos de fabricación al reducir la mano de obra y mejorar el uso efectivo del espacio de la sala limpia21. En línea con esto, muchos de los desarrolladores de productos de terapia celular que buscan la aprobación regulatoria para traducir sus terapias son conscientes de la importancia de cerrar el proceso e implementar la automatización completa o semiautomatización ya en la etapa de desarrollo del proceso 14,31,32.
Con el uso de un medio SFM XF respetuoso con la regulación, y junto con reactivos auxiliares que cumplen con 21 CFR GMP Parte 11 y las pautas internacionales de calidad, este proceso semiautomatizado sería fácilmente adecuado para la fabricación clínica. Hemos demostrado la reproducibilidad del proceso cerrado y el mantenimiento de la calidad de los WJ-MSC. Mejorar la eficiencia y la seguridad del cultivo de células basadas en adherentes en matraces multicapa beneficiaría no solo al campo de la terapia hMSC, sino también a las empresas en bancos de líneas celulares y producción de virus adherentes.

Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) son un gran candidato para aplicaciones clínicas, tanto en ingeniería tisular como en terapias celulares, dado su potencial terapéutico y su alto potencial de autorrenovación para crecer in vitro, que son críticos para generar dosis clínicamente relevantes de células 1,2,3. Según ClinicalTrials.gov, hay más de 1.000 ensayos clínicos actualmente bajo investigación para diversas enfermedades4. Dado el telón de fondo del creciente interés en el uso de hMSCs, más ensayos clínicos y aprobaciones de mercado son inminentes en un futuro próximo 5,6. Sin embargo, la fabricación de hMSC tiene muchos desafíos inherentes en términos de variabilidad de lote a lote, el uso de materias primas de alto riesgo, preocupaciones con respecto a la contaminación debido a muchos procesos abiertos y manuales, ya que la fabricación implica múltiples operaciones unitarias, mayores costos de mano de obra, el costo de escalar o ampliar y obstáculos regulatorios 6,7,8,9,10, 11,12. Estas cuestiones siguen siendo un obstáculo importante para el acceso actual y futuro a los mercados.
El desarrollo de soluciones de fabricación cerradas, modulares y automatizadas y el uso de reactivos auxiliares de bajo riesgo abordarían estos desafíos. Esto también garantizaría una calidad constante del producto, disminuiría la probabilidad de fallas de lotes debido a errores humanos, reduciría los costos de mano de obra y mejoraría la estandarización del proceso y el cumplimiento normativo, como en términos de mantenimiento de registros digitales de lotes 8,12,13,14. Para poder obtener una dosis clínicamente relevante de células, ya sea autóloga o alogénica, es crucial una fabricación simplificada que implique la expansión celular ascendente y el procesamiento posterior de manera cerrada y automatizada.
Para la expansión hMSC aguas arriba, los dos métodos de fabricación más comunes empleados actualmente son el escalamiento horizontal (monocapa 2D) y el escalado vertical (sistema de suspensión basado en microportadores 3D)15,16,17,18. El método más tradicional y ampliamente adoptado para la expansión de hMSC es el cultivo monocapa 2D debido al bajo costo de producción y la facilidad de configuración19.
Los matraces multicapa compuestos de bandejas de superficie plana apiladas dentro de un recipiente de cultivo se utilizan comúnmente para escalar la producción de hMSC. Estos sistemas generalmente vienen en recipientes de cultivo de 1 capa a 40 capas20 y se manejan manualmente dentro de los gabinetes de bioseguridad. Los pasos de procesamiento durante el paso y la recolección de células implican la dispensación y decantación manual de los medios de expansión, el reactivo de disociación y el tampón de lavado mediante pipeteo o inclinación física de todo el recipiente. Además, manejar múltiples unidades es desafiante y requiere mucho tiempo debido a su gran tamaño y peso.
Posteriormente, la poscosecha de matraces multicapa, la centrifugación para el intercambio de medios, el lavado celular y la reducción de volumen son pasos esenciales en todo el flujo de trabajo de fabricación de células21. La centrifugación convencional de sobremesa es un proceso mayormente abierto y manual que implica una multitud de pasos, como transferir la suspensión celular a tubos o botellas tapados dentro de un gabinete de bioseguridad, girar las células, aspirar manualmente el sobrenadante, resuspensión celular con el tampón y lavados celulares repetidos. Esto aumenta dramáticamente tanto el riesgo de contaminación debido a la apertura y cierre de las tapas como las posibilidades de perder el pellet de la celda durante el proceso manual de aspiración/pipeteo22. En el contexto del manejo de sistemas de cultivo multicapa para células basadas en adherentes, como las hMSC, el operador tendría que pasar por un laborioso proceso de transporte entre la centrífuga y el gabinete de bioseguridad repetidamente y manejar una unidad pesada al mismo tiempo. Estos pasos manuales son laboriosos, plantean riesgos en términos de errores humanos y contaminación, y deben llevarse a cabo en un entorno de sala limpia de Clase B, que es costoso23. Además, el proceso de centrifugación manual convencional no es escalable y podría causar cizallamiento celular y estrés; Por lo tanto, maximizar la recuperación celular, la viabilidad y la eficiencia de lavado de las impurezas residuales son otros desafíos importantes22. La fabricación comercial a escala cGMP de terapias celulares requiere soluciones de automatización cerradas y modulares para reducir el riesgo de contaminación, garantizar una calidad constante del producto, reducir los costos de mano de obra y producción, y aumentar la confiabilidad del proceso24,25. Los matraces multicapa se pueden manejar como un sistema cerrado al tener un filtro estéril de 0,2 μm en uno de los puertos para facilitar el intercambio de gases estériles y un segundo puerto conectado asépticamente a través de conectores o soldado por tubo directamente a un instrumento automatizado de procesamiento celular para la recolección de células. Trabajamos para cerrar y automatizar la mayoría de los pasos de paso y cosecha de WJ-hMSC mediante la evaluación de una innovadora centrífuga de contraflujo cerrado destinada a la fabricación de productos basados en células, genes o tejidos. Esta centrífuga de contraflujo también tiene la flexibilidad de realizar una variedad de aplicaciones de procesamiento celular, como la separación celular basada en el tamaño, el intercambio medio/tampón, la concentración y la recolección para una variedad de tipos de células 8,26,27,28. El instrumento utiliza un kit cerrado de un solo uso que se puede conectar estéril mediante soldadura de tubos o conectores asépticos para transferir bolsas o se puede conectar directamente a cualquier plataforma de expansión de su elección.
En este estudio, diseñamos un conjunto de tubos personalizado para permitir conexiones estériles cerradas entre el kit de centrifugación de contraflujo de un solo uso y el matraz multicapa. Optimizamos un protocolo para separar, lavar y cosechar enzimáticamente WJ-MSC del matraz multicapa de una manera completamente cerrada y semiautomatizada en una sola ejecución. Las WJ-hMSC cosechadas se caracterizaron por su pureza (análisis de marcadores de superficie) y potencia (UFC-F, diferenciación trilinaje y perfiles de secreción de citoquinas) para garantizar que el producto final cumpliera con los atributos críticos de calidad (CQA) para la liberación del lote.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se están explorando actualmente como una modalidad terapéutica prometedora basada en células para diversas enfermedades, y se esperan más aprobaciones de mercado para uso clínico en los próximos años. Para facilitar esta transición, es fundamental abordar los cuellos de botella de la escala, la reproducibilidad de lote a lote, el costo, el cumplimiento normativo y el control de calidad. Estos desafíos se pueden abordar cerrando el proceso y adoptando plataformas de fabricación automatizadas. En este estudio, desarrollamos un proceso cerrado y semiautomatizado para el paso y la recolección de hMSC derivadas de la jalea de Wharton (WJ) (WJ-hMSC) de matraces de varias capas mediante centrifugación de contraflujo. Las WJ-hMSC se expandieron utilizando un medio libre de xeno-sin suero (SFM XF) que cumple con las regulaciones, y mostraron una proliferación celular (duplicación de la población) y morfología comparables a las WJ-hMSC expandidas en medios clásicos que contienen suero. Nuestro protocolo cerrado de recolección semiautomatizada demostró una alta recuperación celular (~ 98%) y viabilidad (~ 99%). Las células lavadas y concentradas mediante centrifugación de contraflujo mantuvieron la expresión del marcador de superficie WJ-hMSC, las unidades formadoras de colonias (UFC-F), el potencial de diferenciación de trilinaje y los perfiles de secreción de citoquinas. El protocolo de recolección celular semiautomatizado desarrollado en el estudio se puede aplicar fácilmente para el procesamiento a pequeña y mediana escala de varias células adherentes y de suspensión conectándose directamente a diferentes plataformas de expansión celular para realizar la reducción de volumen, lavado y recolección con un bajo volumen de salida.

El banco de células maestras (MCB) WJ-hMSC después de la descongelación se mantuvo durante tres pasajes sucesivos (p1-p4) en un medio clásico que contiene suero para producir suficientes bancos de células de trabajo (WCB) para los experimentos. Los WCB p4 se descongelaron y expandieron tanto en medio que contenía suero como en medio SFM XF durante tres pasajes más (p4-p7) en matraces T-175. Las WJ-MSC se adaptaron bien cuando se expandieron en medio SFM XF y fueron capaces de mantener una proliferación estable similar a la del medio que contiene suero (Figura 2A). Sin embargo, las células expandidas en medio SFM XF exhibieron una morfología en forma de huso similar a fibroblastos ligeramente más larga, lo que resultó en un tamaño celular ligeramente mayor (Figura 2B) de un promedio de ~ 17 μm en comparación con ~ 15 μm en medio que contiene suero. En ambas condiciones medias a través de los tres pasajes, las WJ-hMSCs alcanzaron consistentemente su densidad celular máxima de ~2.3 x 104 células/cm2 y un tiempo de duplicación de la población de ~34 h (Figura 2C, D).
Para la expansión a gran escala de WJ-hMSC en un sistema cerrado, llevamos a cabo una expansión del tren de semillas de WJ-hMSC primero en un matraz de 4 capas y, posteriormente, en un matraz multicapa de 10 capas. Con una confluencia de alrededor del 80% -90% después de 4 días de cultivo, cosechamos 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 y 2.3 x 10 8± 0.2 x 108 celdas para las pilas de 4 y 10 capas, respectivamente. Se alcanzó una densidad celular más alta de 3.6 x 10 4-3.8 x 104 celdas / cm2 en comparación con los matraces T-175, lo que significa que las pilas permitieron una mejor expansión celular hasta siete veces.
Además, los WJ-hMSCs expandidos en recipientes de cultivo de 10 capas se cosecharon directamente mediante centrifugación de contraflujo. La conexión estéril al kit de un solo uso fue fácil de establecer para la transferencia directa de fluido a un caudal máximo de 165 ml / min utilizando la bomba peristáltica del instrumento. El proceso semiautomático de recolección celular se logró recolectando primero las células utilizando disociación enzimática, cargando las células en la cámara de contraflujo para reducir el volumen y concentrarlas, y luego lavándolas con tampón de lavado, que era aproximadamente 3 veces el volumen de la cámara de centrifugación de contraflujo. Además, las células lavadas se concentraron y cosecharon al volumen de cosecha deseado preestablecido en el protocolo. Los pasos de procesamiento utilizados para el procesamiento celular semiautomatizado se diseñaron para emular el flujo de trabajo de recolección manual. Logramos una reducción de volumen de 10 veces, lo que resultó en la generación de concentraciones celulares tan altas como 5.3 millones de células / ml. El protocolo fue capaz de lograr una alta recuperación celular a ~98% y una alta viabilidad celular a ~99% consistentemente para las tres ejecuciones independientes (Figura 3A-C).
Llevamos a cabo extensos ensayos de caracterización celular para determinar los atributos críticos de calidad de la recolección celular utilizando centrifugación de contraflujo en comparación con la centrifugación manual. Para probar la identidad de las WJ-hMSCs, los marcadores de superficie celular se analizaron mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4A, las WJ-hMSCs recolectadas utilizando ambos métodos mostraron perfiles característicos de marcadores de superficie de acuerdo con las regulaciones ISCT, expresión positiva de CD73, CD90 y CD105, así como expresión negativa de CD34 y CD45. A continuación, para evaluar el potencial clonogénico de las WJ-hMSCs, se realizaron ensayos CFU-F. Como se muestra en la Figura 4B, las células recolectadas de la centrifugación por contraflujo mostraron un potencial de UFC-F similar en comparación con las células recolectadas por centrifugación manual (21% ± 1% vs. 20% ± 1%, respectivamente). Además, como se muestra en la Figura 4C, las células recolectadas por centrifugación posterior al contraflujo conservaron la capacidad de diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y condrocitos similares a las células en el método de centrifugación manual. Por último, investigamos 18 perfiles diferentes de secreción de citoquinas de las células utilizando inmunoensayos multiplex. Como se muestra en la Figura 4D, las células lavadas y concentradas utilizando la centrifugación post-contraflujo mantuvieron perfiles de secreción de citoquinas, y los perfiles fueron comparables a los de la muestra tomada antes de lavar/concentrar las células (centrifugación pre-contraflujo).
En general, hemos demostrado una expansión eficiente de hMSC en un sistema de cultivo SFM XF, y las células lavadas y concentradas utilizando el sistema de centrifugación de contraflujo cerrado y automatizado produjeron una alta recuperación celular y viabilidad después del lavado y pudieron mantener su fenotipo y funcionalidad. El proceso semiautomatizado cerrado desarrollado en este estudio puede ofrecer consistencia en la calidad del producto en términos de recuperación final de WJ-MSC, como se evidencia en tres ejecuciones independientes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Figura 1: Configuración y montaje del kit de un solo uso de alto flujo para la cosecha, lavado y concentración de hMSC . (A) Diagrama del kit después de que las bolsas se hayan conectado en línea con el tubo respectivo. (B) El matraz multicapa de 10 capas conectado al kit de un solo uso de alto flujo con el conjunto de tubos personalizado. (C) Visualización del lecho celular fluidizado estable formado en la cámara de contraflujo a través de la función de cámara habilitada en la interfaz gráfica de usuario del software de centrifugación de contraflujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Figura 2: Comparación de la morfología celular y expansión de hMSCs en medio que contiene suero y medio SFM XF. (A) La morfología celular representativa de hMSCs en medio sérico clásico y medio SFM XF. Las células expandidas SFM XF mostraron una morfología más larga, en forma de huso, característica similar a un fibroblasto, mientras que las células cultivadas en medio que contenía suero mostraron una morfología más aplanada. (B) El tamaño medio de la MSC entre el medio que contiene suero y el medio SFM XF, medido por un contador celular automatizado (n = 3). Está claro que las células expandidas XF de SFM eran generalmente más grandes que las células expandidas en suero en diferentes pasajes. El rendimiento celular total en diferentes pasajes (n = 3) (C) en términos de células por área de superficie de cultivo y (D) niveles de duplicación de la población. Se obtuvieron niveles similares de rendimiento celular entre el medio SFM XF y el medio que contenía suero en diferentes pasajes. Los datos se expresan como la media ± la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Figura 3: Caracterización de células procesadas mediante el sistema de centrifugación por contraflujo . (A) Total de células viables antes y después del lavado y concentración. (B) Se logró una reducción de volumen de 10 veces después del procesamiento de centrifugación de contraflujo. (C) Recuperación total y viabilidad de las células. Los datos se promedian en tres réplicas biológicas (n = 3) de series de lavado y concentración. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Figura 4: Análisis de atributos críticos de calidad . (A) Datos representativos de la citometría de flujo. (B) Imágenes representativas que muestren el total de UFC. (C) Imágenes microscópicas representativas de la diferenciación del trilinaje. (D) Resultados del análisis de expresión de citoquinas antes y después de procesar las células en el sistema de centrifugación de contraflujo (n = 3). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Secuencia de la cosecha de hMSC por tripsinización, lavado y protocolo de concentración en el sistema de centrifugación de contraflujo, incluyendo los pasos iniciales de cebado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Aquí, presentamos un protocolo para cosechar células adherentes de matraces multicapa de manera semiautomatizada cerrada utilizando un sistema de centrifugación de contraflujo. Este protocolo se puede aplicar para recolectar células adherentes y de suspensión de otras plataformas de expansión celular con pocas modificaciones a los pasos existentes.

Procesamiento de células madre mesenquimales humanas para aplicaciones clínicas utilizando un flujo de trabajo semiautomatizado cerrado

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

La centrifugación de sobremesa es un proceso abierto y manual que es difícil de escalar. Nuestro protocolo muestra cómo cerrar y automatizar la disociación, el lavado y la recolección de células madre mesenquimales, o MSC, en una sola ejecución. La configuración es simple.Todo el proceso se puede realizar fuera del gabinete de bioseguridad en una instalación cGMP de clase. El procesamiento automatizado cerrado de celdas reduce los pasos de manipulación manual que podrían ser propensos a riesgos y permite el cumplimiento de cGMP. Este método se puede aplicar a otros tipos de células expandidas en sistemas de cultivo multicapa.El sistema de centrifugación de contraflujo permite la modificación de cualquier paso del protocolo para diferentes aplicaciones. Demostrando este procedimiento estará el Dr. Alan Lam, científico del grupo de bioprocesamiento de células madre en el Instituto de Tecnología de Bioprocesamiento, una estrella en Singapur. Para comenzar el ensamblaje del kit de centrifugación de contraflujo de un solo uso, conecte el kit de un solo uso con las bolsas de transferencia de PVC de un solo uso mediante soldadura de tubos, como se describe en la imagen.A continuación, dentro de un armario de bioseguridad, conecte un matraz multicapa de 10 capas que contenga células madre mesenquimales humanas derivadas de la gelatina de Wharton o HMSC Jelly de Wharton al conjunto de tubos personalizado. Transfiera el recipiente de cultivo de 10 capas adjunto con el conjunto de tubos personalizado a un banco y suéldelo a la línea E del kit de un solo uso. Además. suelde un puerto de muestra estéril a la línea G del kit de un solo uso de alto flujo.A continuación, conecte la línea de cosecha H a un señuelo estéril, equipado con una jeringa de 50 mililitros. Para configurar el funcionamiento del instrumento, encienda el instrumento con el interruptor de palanca en la parte posterior del instrumento y conecte la computadora portátil al puerto USBC del instrumento con el cable USBC provisto. Ejecute la interfaz gráfica de usuario de Counterflow Centrifuge, o el software GUI desde el escritorio o el menú de inicio e inicie sesión.A continuación, cargue el protocolo haciendo clic en el botón Seleccionar un protocolo en la página de bienvenida principal. A continuación, presione el botón azul de desbloqueo en el instrumento y abra la puerta de vidrio para cargar el kit de un solo uso ensamblado en el sistema de centrifugación de contraflujo. Comience colgando las bolsas en los ganchos de la percha en un orden que las alinee mejor con los puertos de tubo en las tiras del sensor de burbujas con el matraz multicapa de 10 capas colocado en ángulo.Alinee el kit con los dos botones de ubicación del kit. Estire el tubo de la bomba alrededor de la bomba peristáltica y presione el conector blanco en forma de bombilla en su lugar. Acople la cámara de centrífuga levantando la palanca de plata del portador de la cámara de centrífuga de contraflujo y asegurándola devolviendo la palanca a su posición vertical.Presione el tubo de cada puerto del kit en las pistas a lo largo de las tiras del sensor de burbujas. Cierre la puerta presionando el pestillo de la puerta. Presione el botón Iniciar en la GUI.Aparecerá una lista de comprobación. Los primeros cuatro elementos son verificaciones de instrumentos, mientras que los dos últimos son verificaciones de usuario. En este punto, asegúrese de que las bolsas y las conexiones coincidan con la imagen del kit y que las abrazaderas manuales estén abiertas.Pulse Confirmar para mostrar la pantalla de entradas de protocolo. Establezca el valor del cuadro de diálogo de entrada de datos o volumen de cosecha como 45 mililitros y presione Confirmar. Presione el botón verde de inicio en el instrumento para iniciar la ejecución del protocolo.Una vez que se complete el cebado inicial, asegúrese de que el medio gastado se bombee completamente a la bolsa de residuos. En los pasos de pausa indicados en la tabla de flujo de trabajo, levante el matraz multicapa y agítelo para distribuir el búfer por igual a todas las bandejas. Una vez completado, vuelva a colocar el matraz multicapa de 10 capas en su posición de dibujo original para los siguientes pasos.En los pasos 20 y 23, asegúrese de que las células tripsinizadas se transfieran completamente a la bolsa intermedia. Mezclar bien la bolsa intermedia, manualmente, en el paso 25. En el paso 26, use una jeringa de señuelo de dos mililitros para tomar muestras a través del puerto de muestreo.En los pasos 29 y 30, verifique la formación estable del lecho celular fluidizado. Debería ser como el lecho celular fluidizado que se muestra aquí. La carrera se completa en el paso de rampa para detenerse, y todos los valores de pellizco en el sistema de centrifugación de contraflujo se cerrarán automáticamente.Una vez completado el protocolo, presione el botón azul de desbloqueo en el instrumento y abra la puerta de vidrio. Selle asépticamente la línea de cosecha con un sellador de tubo de transporte manual y transfiera cuidadosamente la jeringa sellada llena con la cosecha de células concentrada al gabinete de seguridad biológica para el recuento de células y la criopreservación. Vuelva a separar la cámara con la palanca.Saque el conector de la bombilla de su accesorio y levante con cuidado el kit y deséchelo en una bolsa de riesgo biológico. Limpie el instrumento con toallitas de etanol y cierre la puerta. Finalmente, cierre primero la aplicación GUI antes de apagar el interruptor en la parte posterior del instrumento.Las MSC Jelly de Wharton proliferaron bien cuando se expandieron tanto en medios que contienen suero como en medios sin suero y xeno. Sin embargo, aquellos en medio libre de suero y xeno-exhibieron una morfología en forma de huso similar a fibroblastos ligeramente más larga, con un tamaño celular promedio más grande de 17 micras, en comparación con 15 micrones en medio sérico. En ambos medios a lo largo de los tres pasajes, los HMSC de gelatina de Wharton alcanzaron consistentemente una densidad celular máxima de aproximadamente 23.000 células por centímetro cuadrado y un tiempo de duplicación de la población de 34 horas.Cuando las HMSC Jelly de Wharton se expandieron en recipientes de cultivo de 10 capas utilizando la centrifugación de contraflujo demostrada, se logró una reducción de volumen de diez veces, generando concentraciones celulares de hasta 5,3 millones de células por mililitro. El protocolo logró consistentemente una alta recuperación celular de aproximadamente el 98% y una alta viabilidad celular de aproximadamente el 99% durante tres ejecuciones independientes. Las HMSC de gelatina de Wharton recolectadas con ambos métodos mostraron perfiles característicos de marcadores de superficie que son CD73, CD90 y CD105 positivos, así como CD34 y CD45 negativos.Las células recolectadas de la centrifugación de contraflujo mostraron un ensayo de fibroblastos de unidad formadora de colonias similar o potencial de UFC, en comparación con las cosechadas por centrifugación manual. En ambos métodos, las células conservaron la capacidad de diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y condrocitos. Los perfiles de secreción de citoquinas de las células después de la centrifugación por contraflujo fueron comparables a la centrifugación previa al contraflujo.Asegúrese de montar el kit de un solo uso con referencia a la configuración de la cama, desplácelo en este Generador de protocolos del sistema de centrifusión de contraflujo. El protocolo para lavar las impurezas residuales del producto final se puede utilizar en aplicaciones clínicas para ayudar a los usuarios a cumplir con los criterios de liberación de su lote. Para acelerar el proceso de transferencia de fluidos para el procesamiento a gran escala, se pueden usar bombas externas para transferir primero el contenido tripsinizado a una bolsa de transferencia, en lugar de cosechar directamente del matraz de varias capas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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