Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Författarna vill tacka för stöd från finansieringen från Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 och H18/AH/a0/001) från A*STAR, Singapore.

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. och J.N. är anställda av Thermo Fisher Scientific. A.L. och S.O. har inga intressekonflikter.

I detta arbete har vi visat förmågan att stänga och halvautomatisera hMSC-dissociation och tvätta och skörda på bänken med hjälp av ett motströmscentrifugeringsinstrument. Ett av de kritiska stegen i hela arbetsflödet är att se till att slangarna är anslutna enligt det förinställda protokollet som definierats i protokollbyggaren för motflödescentrifugeringssystemet. Installationen och driften är enkel, och den tid det tog att bearbeta cirka 2 liter kultur från en 10-lagers kolv från kitmontering till cellskörd var cirka 60 minuter. Ett av de begränsande stegen i detta arbetsflöde är vätskeöverföringen från flerskiktskolven till överföringspåsarna anslutna till motströmscentrifugeringsinstrumentet. Högflödessatsen för engångsbruk kan endast köras med en maximal flödeshastighet på 165 ml/min, och detta kan vara utmanande för bearbetning, till exempel en 40-lagers kolv. För att påskynda processen för vätskeöverföring kan externa högflödespumpar användas för att överföra det trypsiniserade innehållet till en överföringspåse först, följt av tvättning / koncentration och skörd av cellerna från överföringspåsen med hjälp av motströmscentrifugeringssystemet. Dessutom kan detta protokoll också tillämpas för att passera celler från 4-lager till 10-lagers flerskiktiga kolvar. Längre uppströms kan motströmscentrifugeringssystemet också optimeras för tvättning av tinade hMSC och direkt skörd och mediumformulering i flerskiktskolvar för att starta såtåget. Det bör noteras att det minsta antalet celler som krävs för att bilda den fluidiserade bädden i motströmscentrifugeringskammaren är cirka 30 miljoner celler och den maximala rekommenderade volymen att bearbeta per sats är 20 liter.
För närvarande är det inte önskvärt att fästa den anpassade slangenheten på flerskiktskolven i biosäkerhetsskåpet och autoklaveringen av komponenternas delar i en cGMP-inställning. Som ett alternativ kan en anpassad gammasteriliserad slangenhet outsourcas till leverantörer. Leverantörer som tillhandahåller flerskiktskolvar erbjuder också möjligheten att förmontera kolvarna med önskade slangaggregat, inklusive ett 0,2 μm filter och gammasterilisering av hela utrustningen. Detta skulle säkerställa att flerskiktskolvarna och tillhörande slangar verkligen är stängda, vilket innebär att processen kan slutföras på bänken i en klass C-renrumsinställning.
Denna process som använder motströmscentrifugeringssystemet är inte begränsad till vidhäftningsbaserade odlade celler i ett flerskiktat kärl och kan anpassas till dynamiska (omrörda tank eller vågbioreaktorer) och statiska (gasgenomsläppliga) suspensionsbaserade cellexpansionsplattformar. Specifikt, för hMSC expanderade i 3D-mikrobärarkulturer, kan protokoll optimeras på motströmscentrifugeringssystemet för att skörda, tvätta och formulera hMSC: erna dissocierade från mikrobärare. 
Sammantaget har det ökande intresset för att utveckla translationella cellulära terapier med förbättrad processrobusthet och tillförlitlighet lett till utvecklingen av slutna, automatiserade cellbehandlingsplattformar. Dessa system är absolut nödvändiga, eftersom de minskar antalet hanteringssteg, förhindrar potentiell kontaminering genom sterila anslutningar och minskar tillverkningskostnaderna genom att minska arbetskraften och förbättra den effektiva användningen av renrumsutrymme21. I linje med detta är många av de cellterapiproduktutvecklare som söker regulatoriskt godkännande för att översätta sina terapier medvetna om vikten av att stänga processen och implementera full automatisering eller halvautomatisering redan i processutvecklingsstadiet 14,31,32.
Med användning av regleringsvänligt SFM XF-medium, och tillsammans med tillhörande reagens som överensstämmer med 21 CFR GMP Part 11 och internationella kvalitetsriktlinjer, skulle denna halvautomatiserade process vara lätt lämplig för klinisk tillverkning. Vi har visat reproducerbarheten av den slutna processen och upprätthållandet av kvaliteten på WJ-MSC. Att förbättra effektiviteten och säkerheten vid odling av vidhäftningsbaserade celler i flerskiktskolvar skulle gynna inte bara hMSC-terapifältet utan även företag inom cellinjebank och vidhäftande virusproduktion.

Humana mesenkymala stamceller (hMSC) är en utmärkt kandidat för kliniska tillämpningar, både inom vävnadsteknik och cellterapier, med tanke på deras terapeutiska potential och höga självförnyelsepotential att växa in vitro, vilket är avgörande för att generera kliniskt relevanta doser av celler 1,2,3. Enligt ClinicalTrials.gov finns det över 1,000 kliniska prövningar som för närvarande undersöks för olika sjukdomstillstånd4. Mot bakgrund av det ökande intresset för att använda hMSC är fler kliniska prövningar och marknadsgodkännanden nära förestående inom en snar framtid 5,6. Tillverkningen av hMSC har dock många inneboende utmaningar när det gäller batch-till-batch-variabilitet, användningen av högriskråvaror, oro för kontaminering på grund av många öppna och manuella processer, eftersom tillverkningen innebär flera enhetsoperationer, högre arbetskraftskostnader, kostnaden för att skala ut eller skala upp och regulatoriska hinder 6,7,8,9,10, 11,12. Dessa frågor utgör fortfarande ett betydande hinder för nuvarande och framtida marknadstillträde.
Utvecklingen av slutna, modulära, automatiserade tillverkningslösningar och användning av lågriskreagens skulle lösa dessa utmaningar. Detta skulle också säkerställa konsekvent produktkvalitet, minska sannolikheten för batchfel på grund av mänskliga fel, minska arbetskraftskostnaderna och förbättra processstandardisering och regelefterlevnad, till exempel när det gäller digital batchregistrering 8,12,13,14. För att kunna erhålla en kliniskt relevant dosering av celler, vare sig det är autolog eller allogen, är strömlinjeformad tillverkning som involverar uppströms cellexpansion och nedströms bearbetning på ett slutet, automatiserat sätt avgörande.
För uppströms hMSC-expansion är de två vanligaste tillverkningsmetoderna som för närvarande används utskalning (2D-monolager) och uppskalning (3D-mikrobärarbaserat upphängningssystem)15,16,17,18. Den mest traditionella och allmänt använda metoden för hMSC-expansion är 2D-monolagerbaserad kultur på grund av den låga produktionskostnaden och enkel installation19.
Flerskiktskolvar bestående av plana ytbrickor staplade i ett odlingskärl används vanligtvis för att skala ut hMSC-produktionen. Dessa system kommer vanligtvis i 1-lager till 40-lagers odlingskärl20 och hanteras manuellt inuti biosäkerhetsskåp. Bearbetningsstegen under cellpassage och skörd innefattar manuell dosering och dekantering av expansionsmediet, dissociationsreagens och tvättbuffert genom pipettering eller fysisk lutning av hela kärlet. Dessutom är hantering av flera enheter utmanande och tidskrävande på grund av deras stora storlek och vikt.
Därefter är efterskörd från flerskiktskolvar, centrifugering för medieutbyte, celltvätt och volymminskning viktiga steg i hela arbetsflödet för celltillverkning21. Konventionell bänkcentrifugering är en mestadels öppen och manuell process som involverar en mängd steg, såsom överföring av cellsuspensionen till täckta rör eller flaskor inuti ett biosäkerhetsskåp, snurrar ner cellerna, manuellt aspirerar supernatanten, cellresuspension med bufferten och upprepade celltvättar. Detta ökar dramatiskt både risken för kontaminering på grund av öppning och stängning av locken och risken att förlora cellpelleten under den manuella aspirations-/pipetteringprocessen22. I samband med hantering av flerskiktade odlingssystem för vidhäftande baserade celler som hMSC, skulle operatören behöva gå igenom en mödosam process med skytteltrafik mellan centrifugen och biosäkerhetsskåpet upprepade gånger och hantera en tung enhet samtidigt. Dessa manuella steg är mödosamma, medför risker i form av mänskliga fel och kontaminering och måste utföras i en renrumsmiljö av klass B, vilket är kostsamt23. Dessutom är den konventionella manuella centrifugeringsprocessen inte skalbar och kan orsaka cellulär skjuvning och spänning; Således är maximering av cellåtervinning, livskraft och tvätteffektivitet av kvarvarande föroreningar andra stora utmaningar22. Kommersiell cGMP-skaltillverkning av cellterapier kräver slutna, modulära automatiseringslösningar för att minska risken för kontaminering, säkerställa konsekvent produktkvalitet, minska arbets- och produktionskostnader och öka processäkerheten24,25. Flerskiktskolvar kan hanteras som ett slutet system genom att ha ett sterilt 0,2 μm-filter i en av portarna för att underlätta sterilt gasutbyte och en andra port aseptiskt ansluten via kontakter eller rörsvetsad direkt till ett automatiserat cellbearbetningsinstrument för cellskörd. Vi arbetade för att stänga och automatisera de flesta stegen i WJ-hMSC-passering och skörd genom att utvärdera en innovativ sluten motströmscentrifug avsedd för tillverkning av cell-, gen- eller vävnadsbaserade produkter. Denna motströmscentrifug har också flexibiliteten att utföra en mängd olika cellbehandlingsapplikationer, såsom cellseparation baserat på storlek, medium / buffertbyte, koncentration och skörd för en mängd olika celltyper 8,26,27,28. Instrumentet använder en sluten engångssats som kan anslutas sterilt med rörsvetsning eller aseptiska kontakter för att överföra påsar eller kan anslutas direkt till valfri expansionsplattform.
I denna studie konstruerade vi en anpassad slangenhet för att möjliggöra slutna sterila anslutningar mellan engångscentrifugeringssatsen för motflöde och flerskiktskolven. Vi optimerade ett protokoll för att enzymatiskt lossa, tvätta och skörda WJ-MSC från flerskiktskolven på ett helt slutet och halvautomatiserat sätt inom en enda körning. De skördade WJ-hMSC: erna karakteriserades för renhet (ytmarköranalys) och styrka (CFU-F, trilineagedifferentiering och cytokinsekretionsprofiler) för att säkerställa att slutprodukten uppfyllde de kritiska kvalitetsattributen (CQA) för partifrisättning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

Humana mesenkymala stamceller (hMSC) undersöks för närvarande som en lovande cellbaserad terapeutisk modalitet för olika sjukdomar, med fler marknadsgodkännanden för klinisk användning som förväntas under de närmaste åren. För att underlätta denna övergång är det viktigt att ta itu med flaskhalsarna i skala, lot-to-lot-reproducerbarhet, kostnad, regelefterlevnad och kvalitetskontroll. Dessa utmaningar kan hanteras genom att stänga processen och anta automatiserade tillverkningsplattformar. I denna studie utvecklade vi en sluten och halvautomatisk process för att passera och skörda Whartons gelé (WJ) -härledda hMSC (WJ-hMSC) från flerskiktiga kolvar med användning av motströmscentrifugering. WJ-hMSC utvidgades med hjälp av regulatoriskt kompatibelt serumfritt xenofritt (SFM XF) medium, och de visade jämförbar cellproliferation (populationsfördubbling) och morfologi med WJ-hMSC expanderade i klassiska seruminnehållande medier. Vårt slutna halvautomatiska skördeprotokoll visade hög cellåtervinning (~ 98%) och livskraft (~ 99%). Cellerna tvättades och koncentrerades med motströmscentrifugering bibehöll WJ-hMSC ytmarköruttryck, kolonibildande enheter (CFU-F), trilineagedifferentieringspotential och cytokinsekretionsprofiler. Det halvautomatiska cellskördeprotokollet som utvecklats i studien kan enkelt tillämpas för liten till medelstor bearbetning av olika vidhäftande celler och suspensionsceller genom att direkt ansluta till olika cellexpansionsplattformar för att utföra volymminskning, tvättning och skörd med låg produktionsvolym.

WJ-hMSC-mastercellbanken (MCB) efter upptining upprätthölls i tre på varandra följande passager (p1-p4) i klassiskt seruminnehållande medium för att producera tillräckligt med arbetscellbanker (WCB) för experimenten. P4 WCB tinades och expanderades i både seruminnehållande medium och SFM XF-medium för ytterligare tre passager (p4-p7) i T-175-kolvar. WJ-MSC anpassade sig väl när de expanderades i SFM XF-medium och kunde upprätthålla stabil proliferation liknande den i seruminnehållande medium (figur 2A). Cellerna expanderade i SFM XF-medium uppvisade dock något längre fibroblastliknande spindelformad morfologi, vilket resulterade i en något större cellstorlek (figur 2B) på i genomsnitt ~17 μm jämfört med ~15 μm i seruminnehållande medium. I båda medelförhållandena över de tre passagerna nådde WJ-hMSC konsekvent sin maximala celldensitet på ~ 2,3 x 104 celler / cm2 och en befolkningsfördubblingstid på ~ 34 h (figur 2C, D).
För storskalig WJ-hMSC-expansion i ett slutet system genomförde vi en såtågsexpansion av WJ-hMSC först i en 4-lagers kolv och därefter i en 10-lagers flerskiktskolv. Vid cirka 80% -90% sammanflöde efter 4 dagars kultur skördade vi 9,6 x 10 7± 0,9 x 107 och 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 celler för 4-lagers respektive 10-lagers staplar. En högre celldensitet på 3,6 x 10 4-3,8 x 104 celler/cm2 uppnåddes jämfört med i T-175-kolvarna, vilket innebär att staplarna möjliggjorde bättre cellexpansion med upp till sju gånger.
Vidare skördades WJ-hMSCs expanderade i 10-lagers odlingskärl direkt med hjälp av motströmscentrifugering. Den sterila anslutningen till engångssatsen var enkel att upprätta för direkt vätskeöverföring med en maximal flödeshastighet på 165 ml/min med hjälp av instrumentets peristaltiska pump. Den halvautomatiserade cellskördsprocessen uppnåddes genom att först skörda cellerna med enzymatisk dissociation, ladda cellerna i motströmskammaren för volymreduktion och koncentration och sedan tvätta med tvättbuffert, vilket var cirka 3x volymen för motströmscentrifugeringskammaren. Vidare koncentrerades de tvättade cellerna och skördades till önskad skördevolym förinställd i protokollet. Bearbetningsstegen som används för den halvautomatiska cellbearbetningen utformades för att efterlikna arbetsflödet för manuell skörd. Vi uppnådde en 10-faldig volymminskning, vilket resulterade i generering av cellkoncentrationer så höga som 5,3 miljoner celler / ml. Protokollet kunde uppnå hög cellåterhämtning vid ~ 98% och hög cellviabilitet vid ~ 99% konsekvent för alla tre oberoende körningar (figur 3A-C).
Vi utförde omfattande cellkarakteriseringsanalyser för att bestämma de kritiska kvalitetsegenskaperna för cellskörden med hjälp av motströmscentrifugering jämfört med manuell centrifugering. För att testa identiteten hos WJ-hMSC analyserades cellytemarkörer med flödescytometri. Som visas i figur 4A uppvisade WJ-hMSC som skördats med båda metoderna karakteristiska ytmarkörprofiler enligt ISCT-föreskrifterna, positivt uttryck av CD73, CD90 och CD105 samt negativt uttryck av CD34 och CD45. För att utvärdera den klonogena potentialen hos WJ-hMSC utfördes CFU-F-analyser. Som visas i figur 4B uppvisade celler som skördats från motströmscentrifugering en liknande CFU-F-potential jämfört med celler som skördats genom manuell centrifugering (21% ± 1% respektive 20% ± 1%). Vidare, som visas i figur 4C, behöll de centrifugeringsskördade cellerna efter motflöde förmågan att differentiera till adipocyter, osteoblaster och kondrocyter som liknar cellerna i den manuella centrifugeringsmetoden. Slutligen undersökte vi 18 olika cytokinsekretionsprofiler av cellerna med hjälp av multiplexa immunanalyser. Som visas i figur 4D upprätthöll cellerna som tvättades och koncentrerades med hjälp av efterflödescentrifugeringen cytokinsekretionsprofilerna, och profilerna var jämförbara med profilerna för det prov som togs före tvättning/koncentration av cellerna (centrifugering före motflöde).
Sammantaget har vi visat effektiv hMSC-expansion i ett SFM XF-odlingssystem, och cellerna som tvättades och koncentrerades med hjälp av det slutna, automatiserade motflödescentrifugeringssystemet gav hög cellåtervinning och livskraft efter tvätt och kunde behålla sin fenotyp och funktionalitet. Den slutna halvautomatiserade processen som utvecklats i denna studie kan leverera produktkvalitetskonsistens när det gäller slutlig WJ-MSC-återhämtning, vilket framgår av tre oberoende körningar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Figur 1: Konfiguration och montering av högflödessatser för engångsbruk för skörd, tvättning och koncentration av hMSC . (A) Kitdiagram efter att säckarna har anslutits i linje med respektive slang. B) 10-lagers flerskiktskolv ansluten till högflödessatsen för engångsbruk med den anpassade slangenheten. (C) Visualisering av den stabila fluidiserade cellbädden som bildas i motströmskammaren via kamerafunktionen aktiverad i det grafiska användargränssnittet för motströmscentrifugeringsprogramvaran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Figur 2: Jämförelse av cellmorfologi och expansion av hMSC i seruminnehållande medium och SFM XF-medium. (A) Den representativa cellmorfologin för hMSC i klassiskt serummedium och SFM XF-medium. De SFM XF-expanderade cellerna uppvisade en längre, spindelformad, karakteristisk fibroblastliknande morfologi, medan cellerna odlade i seruminnehållande medium uppvisade en mer tillplattad morfologi. (B) Den genomsnittliga MSC-storleken mellan det seruminnehållande mediet och SFM XF-mediet, mätt med en automatiserad cellräknare (n = 3). Det är tydligt att se att SFM XF-expanderade celler i allmänhet var större än serumexpanderade celler över olika passager. Det totala cellutbytet i olika passager (n = 3) (C) i termer av celler per odlingsyta och (D) populationsfördubblingsnivåer. Liknande nivåer av cellutbyte erhölls mellan SFM XF-mediet och seruminnehållande medium över olika passager. Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Figur 3: Karakterisering av celler bearbetade med hjälp av motströmscentrifugeringssystemet . a) Totalt antal viabla celler före och efter tvättning och koncentration. (B) En 10x volymreduktion uppnåddes efter centrifugeringsbearbetning efter motflöde. (C) Total återhämtning och livskraft hos cellerna. Data beräknas i genomsnitt över tre biologiska replikat (n = 3) av tvätt- och koncentrationskörningar. Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Figur 4: Analys av kritiska kvalitetsattribut . (A) Representativa data från flödescytometri. (B) Representativa bilder som visar den totala CFU. (C) Representativa mikroskopiska bilder av trelinjedifferentieringen. d) Resultat av analys av cytokinuttryck före och efter bearbetning av cellerna i motströmscentrifugeringssystemet (n = 3). Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tabell 1: Sekvens av hMSC-skörden genom trypsinisering, tvättning och koncentrationsprotokoll på motströmscentrifugeringssystemet, inklusive de inledande grundningsstegen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Här presenterar vi ett protokoll för att skörda vidhäftande celler från flerskiktskolvar på ett slutet halvautomatiserat sätt med hjälp av ett motströmscentrifugeringssystem. Detta protokoll kan tillämpas för att skörda både vidhäftande celler och suspensionsceller från andra cellexpansionsplattformar med få modifieringar av de befintliga stegen.

Mänsklig mesenkymal stamcellsbearbetning för kliniska tillämpningar med hjälp av ett slutet halvautomatiserat arbetsflöde

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

Bänkcentrifugering är en öppen och manuell process som är utmanande att skala. Vårt protokoll visar hur man stänger och automatiserar dissociation, tvättning och skörd av mesenkymala stamceller, eller MSC, i en enda körning. Installationen är enkel.Hela processen kan utföras utanför biosäkerhetsskåpet i en klass cGMP-anläggning. Sluten automatiserad cellbehandling minskar manuella hanteringssteg som kan vara riskutsatta och möjliggör cGMP-efterlevnad. Denna metod kan tillämpas på andra celltyper expanderade i flerskiktiga odlingssystem.Motströmscentrifugeringssystemet tillåter modifiering av alla protokollsteg för olika applikationer. Demonstrerar denna procedur kommer att vara Dr.Alan Lam, personalforskare från stamcellsbioprocessgruppen vid Bioprocessing Technology Institute, en stjärna i Singapore. För att påbörja motflödescentrifugeringssatsen för engångsbruk, anslut engångssatsen med PVC-överföringspåsarna för engångsbruk via rörsvetsning, som beskrivs i bilden.Sedan, inuti ett biosäkerhetsskåp, fäst en 10-lagers flerskiktskolv innehållande sammanflytande, Whartons gelé-härledda humana mesenkymala stamceller eller Whartons Jelly HMSC till den anpassade slangenheten. Överför det bifogade 10-lagers odlingskärlet med den anpassade slangenheten till en bänk och svetsa den till linje E i engångssatsen. Också. svetsa en steril provport till linje G i högflödessatsen för engångsbruk.Anslut sedan skördelinjen H till ett sterilt lock, försett med en 50 ml spruta. För att ställa in instrumentkörningen, slå på instrumentet med vippomkopplaren på baksidan av instrumentet och anslut den bärbara datorn till USBC-porten på instrumentet med den medföljande USBC-kabeln. Kör det grafiska användargränssnittet för motflödescentrifug eller GUI-programvaran från skrivbordet eller startmenyn och logga in.Läs sedan in protokollet genom att klicka på knappen Välj ett protokoll på välkomstsidan på huvudsidan. Tryck sedan på den blå upplåsningsknappen på instrumentet och öppna glasdörren för att ladda det monterade engångspaketet på motflödescentrifugeringssystemet. Börja med att hänga påsarna på hängarkrokarna i en ordning som stämmer bäst överens med rörportarna på bubbelsensorremsorna med den 10-skiktade flerskiktskolven placerad i en vinkel.Rada upp satsen med de två kitplatsknapparna. Sträck pumpslangen runt den peristaltiska pumpen och tryck den vita glödlampeformade kontakten på plats. Fäst centrifugkammaren genom att lyfta silverspaken på motströmscentrifugkammarens bärare och säkra den genom att återställa spaken till upprätt läge.Tryck slangen från varje port på satsen i spåren längs bubbelsensorremsorna. Stäng dörren genom att trycka ner dörrlåset. Tryck på initieringsknappen på GUI.En checklista visas. De första fyra punkterna är instrumentkontroller, medan de två sista är användarkontroller. Se nu till att påsarna och anslutningarna matchar kitbilden och att de manuella klämmorna är öppna.Tryck på Bekräfta för att visa skärmen Protokollindata. Ange värdet för dialogrutan för datainmatning eller skördevolym till 45 milliliter och tryck på Bekräfta. Tryck på den gröna startknappen på instrumentet för att starta protokollkörningen.När den första grundningen är klar, se till att det använda mediet pumpas helt ut i avfallspåsen. I paussteg som markerats i arbetsflödestabellen lyfter du upp kolven i flera lager och skakar den för att fördela bufferten jämnt till alla brickor. När du är klar placerar du 10-lagers flerskiktskolven tillbaka i sitt ursprungliga dragläge för nästa steg.I steg 20 och 23, se till att de trypsiniserade cellerna överförs helt till mellanpåsen. Blanda mellanpåsen väl, manuellt, i steg 25. I steg 26, använd en två milliliter lockspruta för att ta prov genom provtagningsporten.I steg 29 och 30, kontrollera den stabila bildningen av den fluidiserade cellbädden. Det ska vara som den fluidiserade cellbädden som visas här. Körningen är klar vid rampen för att stoppa steget, och alla klämvärden på motströmscentrifugeringssystemet stängs automatiskt.När protokollkörningen är klar trycker du på den blå upplåsningsknappen på instrumentet och öppnar glasdörren. Försegla skördelinjen aseptiskt med en handbärande rörförseglare och överför försiktigt den förseglade sprutan fylld med den koncentrerade cellskörden till det biologiska säkerhetsskåpet för cellräkning och kryokonservering. Lossa kammaren igen med spaken.Dra ut lampkontakten ur kopplingen och lyft försiktigt bort satsen och kassera den i en biohazard-påse. Rengör instrumentet med etanolservetter och stäng luckan. Slutligen stäng GUI-applikationen först innan du stänger av omkopplaren på baksidan av instrumentet.Wharton's Jelly MSC förökade sig väl när de expanderade i både seruminnehållande och serumfria, xenofria medier. De i serumfritt, xenofritt medium uppvisade emellertid något längre fibroblastliknande spindelformad morfologi, med en större genomsnittlig cellstorlek på 17 mikron, jämfört med 15 mikron i serummedium. I båda medierna över de tre passagerna nådde Whartons Jelly HMSC konsekvent en maximal celldensitet på cirka 23 000 celler per kvadratcentimeter och en befolkningsfördubblingstid på 34 timmar.När Whartons Jelly HMSC expanderades i 10-lagers odlingskärl med hjälp av den demonstrerade motströmscentrifugeringen uppnåddes en tiofaldig volymreduktion, vilket genererade cellkoncentrationer så höga som 5,3 miljoner celler per milliliter. Protokollet uppnådde genomgående en hög cellåterhämtning på cirka 98 % och en hög cellviabilitet på cirka 99 % för tre oberoende körningar. Wharton's Jelly HMSCs skördade med båda metoderna visade karakteristiska ytmarkörprofiler som är CD73-, CD90- och CD105-positiva, samt CD34- och CD45-negativa.Cellerna skördade från motströmscentrifugering uppvisade en liknande kolonibildande enhet fibroblastanalys eller CFU-potential, jämfört med de som skördats genom manuell centrifugering. I båda metoderna behöll cellerna förmågan att differentiera till adipocyter, osteoblaster och kondrocyter. Cytokinsekretionsprofilerna för celler efter motströmscentrifugering var jämförbara med centrifugering före motflöde.Se till att montera engångssatsen med hänvisning till sänguppsättningen, förskjut den i denna Counterflow Centrifusion System Protocol Builder. Protokollet för tvättning av kvarvarande föroreningar från slutprodukten kan användas i kliniska tillämpningar för att hjälpa användarna att uppfylla sina kriterier för frisläppande av partier. För att påskynda processen för vätskeöverföring för storskalig bearbetning kan externa pumpar användas för att överföra det trypsiniserade innehållet till en överföringspåse först, istället för att direkt skörda från flerskiktskolven.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkelt att använda arkitekturer i Protein-baserade hydrogeler för Cell kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

En Fluorogenic peptid klyvning analysen till skärmen för den proteolytiska aktiviteten: program för coronavirus spike protein aktivering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...