Name: human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Yazarlar, Singapur'un A * STAR kentinden Endüstri Uyum Fonu Ön Konumlandırma (IAF-PP) fonundan (H18/01/a0/021 ve H18/AH / a0/001) gelen desteği kabul etmek ister.

<ol>
	<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 24 (2021).</li><li>Garc&#237;a-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells:+Controversies,+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy.">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).</li><li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal/stem+cells:+Concise+review.">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy.">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li><li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials:+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process.">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320 (2021).</li><li>Fern&#225;ndez-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+(MSC)+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome.">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).</li><li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale:+Process+and+regulatory+challenges.">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li><li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing.">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li><li>Fri&#269;ov&#225;, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).</li><li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products.">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells:+The+AUTOSTEM+robotic+platform.">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li><li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Chen, A. K. -. L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li><li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Strategies for Regenerative Medicine. , 33-71 (2020).</li><li>Tsai, A. -. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing.">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).</li><li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization.">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration.">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li><li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing.">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, 101 (2014).</li><li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy:+cGMP+facilities+and+manufacturing.">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li><li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+From+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gibco&#8482;+CTS&#8482;+Rotea&#8482;+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration.">The Gibco&#8482; CTS&#8482; Rotea&#8482; system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation.">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing.">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).</li><li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes.">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li><li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells.">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li><li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies.">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li><li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+cell+therapy+manufacturing;+it's+not+for+everyone.">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).</li></ol>

P.J., A.B., R.L. ve J.N. Thermo Fisher Scientific'in çalışanlarıdır. A.L. ve S.O.'nun çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmada, hMSC ayrışmasını kapatma ve yarı otomatik hale getirme ve bir ters akış santrifüj cihazı kullanarak tezgahta yıkama ve hasat etme yeteneğini gösterdik. Tüm iş akışındaki kritik adımlardan biri, boruların karşı akış santrifüj sistemi protokol oluşturucusunda tanımlanan önceden ayarlanmış protokole göre bağlandığından emin olmaktır. Kurulum ve kullanım basittir ve kit montajından hücre hasadına kadar 10 katmanlı bir şişeden yaklaşık 2 L kültürün işlenmesi için geçen süre yaklaşık 60 dakikaydı. Bu iş akışındaki sınırlayıcı adımlardan biri, çok katmanlı şişeden karşı akışlı santrifüj cihazına bağlı transfer torbalarına sıvı transferidir. Yüksek akışlı tek kullanımlık kit yalnızca maksimum 165 mL/dak akış hızında çalıştırılabilir ve bu, örneğin 40 katmanlı bir şişenin işlenmesi için zor olabilir. Sıvı transferi işlemini hızlandırmak için, tripsinize edilmiş içerikleri önce bir transfer torbasına aktarmak için harici yüksek akış hızlı pompalar kullanılabilir, ardından karşı akışlı santrifüjleme sistemi kullanılarak hücrelerin transfer torbasından yıkanması/konsantre edilmesi ve toplanması yapılabilir. Ayrıca, bu protokol 4 katmanlı ila 10 katmanlı çok katmanlı şişelerden geçen hücreler için de uygulanabilir. Daha da yukarı akışta, karşı akışlı santrifüjleme sistemi, çözülmüş hMSC'lerin yıkanması ve tohum trenini başlatmak için çok katmanlı şişelere doğrudan hasat ve orta formülasyon için optimize edilebilir. Karşı akışlı santrifüjleme odasındaki akışkan yatağı oluşturmak için gereken minimum hücre sayısının yaklaşık 30 milyon hücre olduğu ve parti başına işlenmesi önerilen maksimum hacmin 20 L olduğu belirtilmelidir.
Şu anda, özel boru tertibatının biyogüvenlik kabinindeki çok katmanlı şişeye tutturulması ve bileşenlerin parçalarının otoklavlanması bir cGMP ayarında arzu edilmemektedir. Alternatif olarak, özel bir gama sterilize boru tertibatı tedarikçilere dış kaynak olarak sağlanabilir. Çok katmanlı şişeler sağlayan tedarikçiler ayrıca, şişeleri 0,2 μm filtre ve tüm kıyafetin gama sterilizasyonu dahil olmak üzere istenen boru tertibatlarıyla önceden takma seçeneği de sunar. Bu, çok katmanlı şişelerin ve ekli boruların gerçekten kapalı olmasını sağlayacaktır, bu da işlemin C Sınıfı temiz oda ortamında tezgahta tamamlanabileceği anlamına gelir.
Karşı akışlı santrifüjleme sistemini kullanan bu işlem, çok katmanlı bir kaptaki yapışkan bazlı kültürlü hücrelerle sınırlı değildir ve dinamik (karıştırılmış tank veya dalga biyoreaktörleri) ve statik (gaz geçirgen) süspansiyon bazlı hücre genleşme platformlarına uyarlanabilir. Spesifik olarak, 3D mikrotaşıyıcı kültürlerde genişletilmiş hMSC'ler için, mikrotaşıyıcılardan ayrışmış hMSC'leri toplamak, yıkamak ve formüle etmek için karşı akış santrifüj sisteminde protokoller optimize edilebilir. 
Genel olarak, gelişmiş proses sağlamlığı ve güvenilirliği ile translasyonel hücresel tedavilerin geliştirilmesine olan ilginin artması, kapalı, otomatik hücre işleme platformlarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu sistemler, elleçleme adımlarının sayısını azalttıkları, steril bağlantılarla olası kontaminasyonu önledikleri ve işçiliği azaltarak ve temiz oda alanının etkin kullanımını artırarak üretim maliyetlerini düşürdükleri için zorunludur21. Buna paralel olarak, tedavilerini tercüme etmek için düzenleyici onay arayan hücre terapisi ürün geliştiricilerinin çoğu, süreci kapatmanın ve süreç geliştirme aşaması 14,31,32 kadar erken bir zamanda tam otomasyon veya yarı otomasyon uygulamanın öneminin farkındadır.
Düzenleyici dostu SFM XF ortamının kullanımı ve 21 CFR GMP Bölüm 11 ve uluslararası kalite yönergelerine uygun yardımcı reaktiflerle birlikte, bu yarı otomatik süreç klinik üretim için kolayca uygun olacaktır. Çok katmanlı şişelerde yapışkan bazlı hücrelerin kültürlenmesinin verimliliğini ve güvenliğini artırmak, sadece hMSC tedavi alanına değil, aynı zamanda hücre hattı bankacılığı ve yapışkan virüs üretimindeki şirketlere de fayda sağlayacaktır.

İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler), terapötik potansiyelleri ve klinik olarak ilgili hücre dozlarını üretmek için kritik olan in vitro olarak büyümek için yüksek kendini yenileme potansiyelleri göz önüne alındığında, hem doku mühendisliğinde hem de hücre terapilerinde klinik uygulamalar için mükemmel bir adaydır 1,2,3. ClinicalTrials.gov'ye göre, şu anda çeşitli hastalık koşulları için araştırılmakta olan 1.000'den fazla klinik çalışma bulunmaktadır4. hMSC'lerin kullanımına olan ilginin artması göz önüne alındığında, yakın gelecekte daha fazla klinik çalışma ve pazar onayı yakındır 5,6. Bununla birlikte, hMSC'lerin üretimi, partiden partiye değişkenlik, yüksek riskli hammaddelerin kullanımı, birçok açık ve manuel işlem nedeniyle kontaminasyonla ilgili endişeler açısından birçok doğal zorluğa sahiptir, çünkü üretim birden fazla birim operasyonu, daha yüksek işçilik maliyetleri, ölçeklendirme veya ölçeklendirme maliyeti ve düzenleyici engeller 6,7,8,9,10, 11,12. Bu sorunlar, mevcut ve gelecekteki pazar erişiminin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir.
Kapalı, modüler, otomatik üretim çözümlerinin geliştirilmesi ve düşük riskli yardımcı reaktiflerin kullanılması bu zorlukların üstesinden gelecektir. Bu aynı zamanda tutarlı ürün kalitesi sağlayacak, insan hatasından kaynaklanan parti arızası olasılığını azaltacak, işçilik maliyetlerini düşürecek ve dijital partikaydı tutma 8,12,13,14 gibi süreç standardizasyonunu ve mevzuata uygunluğu iyileştirecektir. Klinik olarak ilgili bir hücre dozu elde edebilmek için, otolog veya allojenik olsun, yukarı akış hücre genişlemesini ve kapalı, otomatik bir şekilde aşağı akış işlemeyi içeren aerodinamik üretim çok önemlidir.
Yukarı akış hMSC genişlemesi için, şu anda kullanılan en yaygın iki üretim yöntemi, ölçek genişletme (2D tek katmanlı) ve ölçek büyütme (3D mikrotaşıyıcı tabanlı süspansiyon sistemi)15,16,17,18'dir. hMSC genişletme için en geleneksel ve yaygın olarak benimsenen yöntem, düşük üretim maliyeti ve kurulum kolaylığı nedeniyle 2D tek katmanlı tabanlı kültürdür19.
Bir kültür kabı içinde istiflenmiş düz yüzey tepsilerinden oluşan çok katmanlı şişeler, hMSC üretimini ölçeklendirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu sistemler tipik olarak 1 katmanlı ila 40 katmanlı kültür kapları20 olarak gelir ve biyogüvenlik kabinlerinin içinde manuel olarak kullanılır. Hücre geçişi ve hasadı sırasındaki işleme adımları, genleşme ortamının, ayrışma reaktifinin ve yıkama tamponunun pipetleme veya fiziksel olarak eğilerek tüm kabın manuel olarak dağıtılmasını ve boşaltılmasını içerir. Ayrıca, birden fazla üniteyi kullanmak, boyutları ve ağırlıkları nedeniyle zorlu ve zaman alıcıdır.
Daha sonra, çok katmanlı şişelerden hasat sonrası, ortam değişimi için santrifüjleme, hücre yıkama ve hacim azaltma, tüm hücre üretim iş akışı21 boyunca temel adımlardır. Geleneksel tezgah üstü santrifüjleme, hücre süspansiyonunun bir biyogüvenlik kabini içindeki kapaklı tüplere veya şişelere aktarılması, hücrelerin döndürülmesi, süpernatanın manuel olarak aspire edilmesi, tamponla hücre yeniden süspansiyonu ve tekrarlanan hücre yıkamaları gibi çok sayıda adımı içeren çoğunlukla açık ve manuel bir işlemdir. Bu, hem kapakların açılıp kapanması nedeniyle kontaminasyon riskini hem de manuel aspirasyon/pipetleme işlemi sırasında hücre peletini kaybetme olasılığını önemli ölçüde artırır22. hMSC'ler gibi yapışkan tabanlı hücreler için çok katmanlı kültür sistemlerinin elleçlenmesi bağlamında, operatörün santrifüj ve biyogüvenlik kabini arasında tekrar tekrar durma ve aynı anda ağır bir üniteyi kullanma zahmetli bir süreçten geçmesi gerekecektir. Bu manuel adımlar zahmetlidir, insan hataları ve kontaminasyon açısından risk oluşturur ve23 maliyetli olan B Sınıfı temiz oda ortamında gerçekleştirilmelidir. Ek olarak, geleneksel manuel santrifüjleme işlemi ölçeklenebilir değildir ve hücresel kayma ve strese neden olabilir; Bu nedenle, hücre geri kazanımını, canlılığını ve artık safsızlıkların yıkanma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak diğer önemli zorluklardır22. Hücre terapilerinin ticari cGMP ölçekli üretimi, kontaminasyon riskini azaltmak, tutarlı ürün kalitesi sağlamak, işçilik ve üretim maliyetlerini azaltmak ve proses güvenilirliğini artırmak için kapalı, modüler otomasyon çözümleri gerektirir24,25. Çok katmanlı şişeler, steril gaz değişimini kolaylaştırmak için portlardan birinde steril 0,2 μm filtreye ve konektörler aracılığıyla aseptik olarak bağlanmış veya hücre hasadı için doğrudan otomatik bir hücre işleme cihazına tüp kaynaklı ikinci bir porta sahip olarak kapalı bir sistem olarak kullanılabilir. Hücre, gen veya doku bazlı ürünlerin üretimine yönelik yenilikçi bir kapalı karşı akış santrifüjünü değerlendirerek WJ-hMSC geçiş ve hasadının çoğu adımını kapatmak ve otomatikleştirmek için çalıştık. Bu karşı akışlı santrifüj ayrıca, çeşitlihücre tipleri 8,26,27,28 için boyut, orta/tampon değişimi, konsantrasyon ve hasat gibi hücre ayırma gibi çeşitli hücre işleme uygulamalarını gerçekleştirme esnekliğine sahiptir. Cihaz, torbaları aktarmak için boru kaynağı veya aseptik konektörler kullanılarak steril olarak bağlanabilen veya doğrudan tercih edilen herhangi bir genişletme platformuna bağlanabilen kapalı, tek kullanımlık bir kit kullanır.
Bu çalışmada, tek kullanımlık karşı akışlı santrifüjleme kiti ile çok katmanlı şişe arasında kapalı steril bağlantılara izin vermek için özel bir boru tertibatı tasarladık. WJ-MSC'leri çok katmanlı şişeden tek bir çalıştırmada tamamen kapalı ve yarı otomatik bir şekilde enzimatik olarak ayırmak, yıkamak ve hasat etmek için bir protokolü optimize ettik. Hasat edilen WJ-hMSC'ler, nihai ürünün lot salınımı için kritik kalite özelliklerini (CQA'lar) karşıladığından emin olmak için saflık (yüzey belirteci analizi) ve potens (CFU-F, trilineage farklılaşması ve sitokin sekresyon profilleri) için karakterize edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2L PVC transfer bag</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>BB*B200TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue solution, pH 2.5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin-Red Staining Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TMS-008-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterflow Centrifugation System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A47679</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom tubing assembly</td>
			<td>Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gamma-sterilized 3/32&#8221; ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8&#8221; barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8&#8221; barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emflon II capsule (0.2um filter)</td>
			<td>Pall</td>
			<td>KM5V002P2G100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12662029</td>
			<td>Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flow Single Use Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A46575</td>
			<td>Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 &#8211; 165 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-layered systems&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140360 (4-layers); 140410 (10-layers)</td>
			<td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-3000</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O staining solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProcartaPlex Multiplex Immunoassays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&#945;, MIP-1&#946;, MIP-3&#945;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&#945;, TGF&#945;, TNF-alpha, VEGF-A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample port</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50111</td>
			<td>Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrocyte Differentiation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ME20236L1</td>
			<td>Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Nunc EasYFlask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG9204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ MSCs&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>(#C12971; Germany)</td>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12571063</td>
			<td>With nucleosides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human mesenchymal stem cell processing for clinical applications using a closed semi-automated workflow

İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler) şu anda çeşitli hastalıklar için umut verici bir hücre bazlı terapötik yöntem olarak araştırılmaktadır ve önümüzdeki birkaç yıl içinde klinik kullanım için daha fazla pazar onayı beklenmektedir. Bu geçişi kolaylaştırmak için ölçek, partiden partiye tekrarlanabilirlik, maliyet, mevzuata uygunluk ve kalite kontrolünün darboğazlarını ele almak kritik öneme sahiptir. Bu zorluklar, süreci kapatarak ve otomatik üretim platformlarını benimseyerek ele alınabilir. Bu çalışmada, ters akış santrifüjleme kullanarak çok katmanlı şişelerden Wharton'un jöle (WJ) türevi hMSC'lerin (WJ-hMSC'ler) geçirilmesi ve toplanması için kapalı ve yarı otomatik bir süreç geliştirdik. WJ-hMSC'ler, düzenleyici uyumlu serumsuz kseno içermeyen (SFM XF) ortam kullanılarak genişletildi ve klasik serum içeren ortamlarda genişletilen WJ-hMSC'lerle karşılaştırılabilir hücre proliferasyonu (popülasyonun iki katına çıkması) ve morfolojisi gösterdi. Kapalı yarı otomatik hasat protokolümüz yüksek hücre geri kazanımı (~% 98) ve canlılık (~% 99) göstermiştir. Karşı akış santrifüjleme kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, WJ-hMSC yüzey belirteci ekspresyonunu, koloni oluşturan birimleri (CFU-F), trilineaj farklılaşma potansiyelini ve sitokin sekresyon profillerini korudu. Çalışmada geliştirilen yarı otomatik hücre toplama protokolü, düşük çıktı hacmiyle hacim azaltma, yıkama ve hasat gerçekleştirmek için farklı hücre genişletme platformlarına doğrudan bağlanarak çeşitli yapışkan ve süspansiyon hücrelerinin küçük ila orta ölçekli işlenmesi için kolayca uygulanabilir.

WJ-hMSC ana hücre bankası (MCB) çözülme sonrası, deneyler için yeterli çalışan hücre bankası (WCB) üretmek için klasik serum içeren ortamda üç ardışık geçiş (p1-p4) için korunmuştur. P4 WCB'ler, T-175 şişelerinde üç geçiş daha (p4-p7) için hem serum içeren ortamda hem de SFM XF ortamında çözüldü ve genişletildi. WJ-MSC'ler SFM XF ortamında genleştirildiklerinde iyi adapte olmuşlar ve serum içeren ortamdakine benzer stabil proliferasyonu koruyabilmişlerdir (Şekil 2A). Bununla birlikte, SFM XF ortamında genişleyen hücreler, biraz daha uzun fibroblast benzeri iğ şeklindeki morfoloji sergiledi ve serum içeren ortamda ~15 μm'ye kıyasla ortalama ~17 μm'lik biraz daha büyük bir hücre boyutu (Şekil 2B) ile sonuçlandı. Üç pasaj boyunca her iki ortam koşulunda da, WJ-hMSC'ler sürekli olarak ~ 2.3 x 104 hücre /cm2'lik maksimum hücre yoğunluğuna ve ~ 34 saatlik bir popülasyon iki katına çıkma süresine ulaştı (Şekil 2C, D).
Kapalı bir sistemde büyük ölçekli WJ-hMSC genişletmesi için, WJ-hMSC'lerin tohum treni genişletmesini önce 4 katmanlı bir şişede ve daha sonra 10 katmanlı çok katmanlı bir şişede gerçekleştirdik. 4 günlük kültürden sonra% 80 -% 90 akıcılıkta, 4 katmanlı ve 10 katmanlı yığınlar için sırasıyla 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 ve 2.3 x 10 8 ± 0.2 x 108 hücre hasat ettik. T-175 şişelerine kıyasla 3.6 x 10 4-3.8 x 104 hücre /cm2'lik daha yüksek bir hücre yoğunluğuna ulaşıldı, yani yığınlar yedi kata kadar daha iyi hücre genişlemesine izin verdi.
Ayrıca, 10 katmanlı kültür kaplarında genişleyen WJ-hMSC'ler, karşı akış santrifüjleme kullanılarak doğrudan hasat edildi. Cihazın peristaltik pompası kullanılarak maksimum 165 mL/dak akış hızında doğrudan sıvı transferi için tek kullanımlık kit ile steril bağlantı kurmak kolaydı. Yarı otomatik hücre toplama işlemi, önce enzimatik ayrışma kullanarak hücrelerin toplanması, hücrelerin hacim azaltma ve konsantre etme için karşı akış odasına yüklenmesi ve daha sonra karşı akış santrifüjleme odasının hacminin yaklaşık 3 katı olan yıkama tamponu ile yıkanmasıyla elde edildi. Ayrıca, yıkanan hücreler daha sonra konsantre edildi ve protokolde önceden ayarlanmış istenen hasat hacmine hasat edildi. Yarı otomatik hücre işleme için kullanılan işleme adımları, manuel hasat iş akışını taklit etmek için tasarlanmıştır. 10 kat hacim azalması elde ettik, bu da 5.3 milyon hücre / mL'ye kadar yüksek hücre konsantrasyonlarının üretilmesiyle sonuçlandı. Protokol, her üç bağımsız çalışma için tutarlı bir şekilde ~% 98'de yüksek hücre geri kazanımı ve ~% 99'da yüksek hücre canlılığı elde edebildi (Şekil 3A-C).
Manuel santrifüjlemeye kıyasla ters akışlı santrifüjleme kullanarak hücre hasadının kritik kalite özelliklerini belirlemek için kapsamlı hücre karakterizasyon testleri gerçekleştirdik. WJ-hMSC'lerin kimliğini test etmek için, hücre yüzey belirteçleri akış sitometrisi ile analiz edildi. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, her iki yöntem kullanılarak hasat edilen WJ-hMSC'ler, ISCT düzenlemelerine göre karakteristik yüzey işaretleyici profilleri, CD73, CD90 ve CD105'in pozitif ifadesinin yanı sıra CD34 ve CD45'in negatif ekspresyonunu göstermiştir. Daha sonra, WJ-hMSC'lerin klonojenik potansiyelini değerlendirmek için CFU-F testleri yapıldı. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, karşı akışlı santrifüjlemeden toplanan hücreler, manuel santrifüjleme ile toplanan hücrelere kıyasla benzer bir CFU-F potansiyeli göstermiştir (sırasıyla% 21 ±% 1'e karşı% 20 ±% 1). Ayrıca, Şekil 4C'de gösterildiği gibi, karşı akış sonrası santrifüjleme ile hasat edilen hücreler, manuel santrifüjleme yöntemindeki hücrelere benzer adipositlere, osteoblastlara ve kondrositlere farklılaşma yeteneğini korumuştur. Son olarak, multipleks immünoassayler kullanarak hücrelerin 18 farklı sitokin sekresyon profilini araştırdık. Şekil 4D'de gösterildiği gibi, karşı akış sonrası santrifüjleme kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, sitokin sekresyon profillerini korudu ve profiller, hücreleri yıkamadan / konsantre etmeden önce alınan numuneninkilerle karşılaştırılabilir (karşı akış öncesi santrifüjleme).
Genel olarak, bir SFM XF kültür sisteminde etkili hMSC genişlemesi gösterdik ve kapalı, otomatik karşı akışlı santrifüj sistemi kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, yıkama sonrası yüksek hücre geri kazanımı ve canlılığı sağladı ve fenotiplerini ve işlevlerini koruyabildi. Bu çalışmada geliştirilen kapalı yarı otomatik süreç, üç bağımsız çalışmadan kanıtlandığı gibi, nihai WJ-MSC geri kazanımı açısından ürün kalitesi tutarlılığı sağlayabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> Şekil 1: hMSC'lerin toplanması, yıkanması ve konsantrasyonu için yüksek akışlı tek kullanımlık kit konfigürasyonu ve montajı . (A) Torbalar ilgili boruya uygun olarak bağlandıktan sonra kit diyagramı. (B) Özel boru tertibatı ile yüksek akışlı tek kullanımlık kite bağlı 10 katmanlı çok katmanlı şişe. (C) Karşı akış santrifüj yazılımının grafik kullanıcı arayüzünde etkinleştirilen kamera fonksiyonu aracılığıyla karşı akış odasında oluşan kararlı akışkan hücre yatağının görselleştirilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> Şekil 2: Serum içeren besiyeri ve SFM XF besiyerinde hMSC'lerin hücre morfolojisi ve genişlemesinin karşılaştırılması. (A) Klasik serum besiyerinde ve SFM XF besiyerinde hMSC'lerin temsili hücre morfolojisi. SFM XF genişlemiş hücreler daha uzun, iğ şeklinde, karakteristik fibroblast benzeri bir morfoloji sergilerken, serum içeren ortamda yetiştirilen hücreler daha düzleştirilmiş bir morfoloji sergiledi. (B) Serum içeren ortam ile SFM XF ortamı arasındaki ortalama MSC boyutu, otomatik bir hücre sayacı ile ölçülür (n = 3). SFM XF ile genişlemiş hücrelerin genellikle farklı pasajlarda serum ile genişlemiş hücrelerden daha büyük olduğu açıktır. Farklı pasajlardaki toplam hücre verimi (n = 3) (C) kültür yüzey alanı başına düşen hücre cinsinden ve (D) popülasyon iki katına çıkan seviyeler açısından. SFM XF ortamı ile serum içeren ortam arasında farklı pasajlarda benzer hücre verimi seviyeleri elde edildi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> Şekil 3: Karşı akışlı santrifüjleme sistemi kullanılarak işlenen hücrelerin karakterizasyonu . (A) Yıkama ve konsantrasyondan önce ve sonra toplam canlı hücreler. (B) Karşı akış santrifüjleme işleminden sonra 10 kat hacim azalması sağlanmıştır. (C) Hücrelerin toplam iyileşmesi ve yaşayabilirliği. Veriler, yıkama ve konsantrasyon işlemlerinin üç biyolojik replikası (n = 3) üzerinden ortalamalandırılır. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> Şekil 4: Kritik kalite öznitelikleri analizi . (A) Akış sitometrisinden elde edilen temsili veriler. (B) Toplam CFU'yu gösteren temsili resimler. (C) Trilineage farklılaşmasının temsili mikroskobik görüntüleri. (D) Sitokin ekspresyon analizi, karşı akış santrifüjleme sistemindeki hücrelerin işlenmesinden önce ve sonra sonuçlanır (n = 3). Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: İlk astarlama adımları da dahil olmak üzere karşı akış santrifüjleme sisteminde tripsinizasyon, yıkama ve konsantrasyon protokolü ile hMSC hasadının sırası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow at JoVE.com

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Burada, bir ters akış santrifüjleme sistemi kullanarak çok katmanlı şişelerden yapışkan hücreleri kapalı yarı otomatik bir şekilde toplamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, mevcut adımlarda birkaç değişiklikle diğer hücre genişletme platformlarından hem yapışkan hem de süspansiyon hücrelerini toplamak için uygulanabilir.

Kapalı Yarı Otomatik İş Akışı Kullanarak Klinik Uygulamalar için İnsan Mezenkimal Kök Hücre İşleme

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

Masaüstü santrifüjleme, ölçeklendirilmesi zor olan açık ve manuel bir prosestir. Protokolümüz, mezenkimal kök hücrelerin veya MSC'lerin ayrışmasını, yıkanmasını ve toplanmasını tek bir seferde nasıl kapatacağımızı ve otomatikleştireceğinizi gösterir. Kurulum basittir.Tüm süreç, biyogüvenlik kabininin dışında, cGMP sınıfı bir tesiste gerçekleştirilebilir. Kapalı otomatik hücre işleme, riske açık olabilecek manuel taşıma adımlarını azaltır ve cGMP uyumluluğunu sağlar. Bu yöntem, çok katmanlı kültür sistemlerinde genişlemiş diğer hücre tiplerine uygulanabilir.Karşı Akış Santrifüjleme Sistemi, farklı uygulamalar için herhangi bir protokol adımının değiştirilmesine izin verir. Bu prosedürü gösteren, Singapur'daki bir yıldız olan Biyoişleme Teknolojisi Enstitüsü'ndeki kök hücre biyoişleme grubundan personel bilim adamı Dr. Alan Lam olacaktır. Tek kullanımlık karşı akışlı santrifüj kiti montajına başlamak için, tek kullanımlık kiti resimde belirtildiği gibi boru kaynağı yoluyla tek kullanımlık PVC transfer torbalarına bağlayın.Daha sonra, bir biyogüvenlik kabininin içine, özel boru tertibatına confluent, Wharton'un Jelly türevi insan mezenkimal kök hücreleri veya Wharton'un Jelly HMSC'lerini içeren 10 katmanlı çok katmanlı bir şişe takın. Ekli 10 katmanlı kültür kabını özel boru tertibatı ile bir tezgaha aktarın ve tek kullanımlık kitin E hattına kaynak yapın. De. yüksek akışlı tek kullanımlık kitin G hattına steril bir numune portu kaynaklayın.Daha sonra, hasat hattı H'yi 50 mililitrelik bir şırınga ile donatılmış steril bir cazibeye bağlayın. Cihazın çalışmasını ayarlamak için, cihazın arkasındaki geçiş düğmesini kullanarak cihazı açın ve sağlanan USBC kablosunu kullanarak dizüstü bilgisayarı cihazdaki USBC bağlantı noktasına bağlayın. Counterflow Santrifüj Grafik Kullanıcı Arabirimi'ni veya GUI yazılımını masaüstünden veya başlat menüsünden çalıştırın ve oturum açın.Ardından, ana karşılama sayfasındaki Bir protokol seçin düğmesini tıklatarak protokolü yükleyin. Ardından, cihazdaki mavi kilit açma düğmesine basın ve monte edilmiş tek kullanımlık kiti Karşı Akış Santrifüj Sistemine yüklemek için cam kapıyı açın. Torbaları, bir açıyla yerleştirilmiş 10 katmanlı çok katmanlı şişe ile kabarcık sensörü şeritlerindeki tüp bağlantı noktalarıyla en iyi şekilde hizalayacak şekilde askı kancalarına asarak başlayın.Kiti iki kit konum düğmesiyle hizalayın. Pompa borusunu peristaltik pompanın etrafına gerin ve beyaz ampul şeklindeki konektörü yerine bastırın. Santrifüj odasını, ters akışlı santrifüj odası taşıyıcısının gümüş kolunu kaldırarak ve kolu dik konumuna getirerek sabitleyerek takın.Kit üzerindeki her bir bağlantı noktasından boruyu kabarcık sensörü şeritleri boyunca uzanan izlere bastırın. Kapı mandalına bastırarak kapıyı kapatın. GUI'deki Başlat düğmesine basın.Bir kontrol listesi görünecektir. İlk dört öğe cihaz kontrolleri, son ikisi ise kullanıcı kontrolleridir. Bu noktada, çantaların ve bağlantıların kit görüntüsüyle eşleştiğinden ve manuel kelepçelerin açık olduğundan emin olun.Protokol girişleri ekranını göstermek için Onayla'ya basın. Veri girişi veya hasat hacmi iletişim kutusu değerini 45 mililitre olarak ayarlayın ve Onayla'ya basın. Protokol çalışmasını başlatmak için cihazdaki yeşil başlat düğmesine basın.İlk astarlama tamamlandıktan sonra, harcanan ortamın tamamen atık torbasına pompalandığından emin olun. İş akışı tablosunda işaretlenen duraklatma adımlarında, çok katmanlı şişeyi yukarı kaldırın ve arabelleği tüm tepsilere eşit olarak dağıtmak için sallayın. Tamamlandığında, sonraki adımlar için 10 katmanlı çok katmanlı şişeyi orijinal çizim konumuna geri yerleştirin.20. ve 23. adımlarda, tripsinize edilen hücrelerin tamamen ara torbaya aktarıldığından emin olun. Ara torbayı adım 25'te manuel olarak iyice karıştırın. 26. adımda, örnekleme portundan numune almak için iki mililitrelik bir yem şırıngası kullanın.29. ve 30. adımlarda, akışkanlaştırılmış hücre yatağının kararlı oluşumunu kontrol edin. Burada gösterilen akışkanlaştırılmış hücre yatağı gibi olmalıdır. Durdurma adımını durdurmak için rampada koşu tamamlanır ve Karşı Akış Santrifüj Sistemindeki tüm sıkıştırma değerleri otomatik olarak kapanır.Protokol çalışması tamamlandıktan sonra, cihazdaki mavi kilit açma düğmesine basın ve cam kapıyı açın. Hasat hattını elle taşınan bir tüp kapatıcı kullanarak aseptik olarak kapatın ve konsantre hücre hasadı ile doldurulmuş kapalı şırıngayı hücre sayımı ve kriyoprezervasyon için biyolojik güvenlik kabinine dikkatlice aktarın. Kolu kullanarak odayı tekrar ayırın.Ampul konektörünü bağlantı parçasından çekin ve kiti dikkatlice kaldırın ve biyolojik tehlike torbasına atın. Cihazı etanol mendiller kullanarak temizleyin ve kapıyı kapatın. Son olarak, cihazın arkasındaki anahtarı kapatmadan önce GUI uygulamasını kapatın.Wharton'un Jelly MSC'leri, hem serum içeren hem de serum içermeyen, kseno içermeyen ortamlarda genişletildiğinde iyi çoğaldı. Bununla birlikte, serumsuz, kseno içermeyen ortamdakiler, serum ortamındaki 15 mikrona kıyasla, 17 mikronluk daha büyük bir ortalama hücre boyutuna sahip, biraz daha uzun fibroblast benzeri iğ şeklinde morfoloji sergilediler. Üç pasajdaki her iki ortamda da, Wharton'un Jöle HMSC'leri sürekli olarak santimetre kare başına yaklaşık 23.000 hücrelik maksimum hücre yoğunluğuna ve 34 saatlik bir popülasyon ikiye katlanma süresine ulaştı.Wharton'un Jelly HMSC'leri, gösterilen karşı akış santrifüjlemesi kullanılarak 10 katmanlı kültür kaplarında genişletildiğinde, mililitre başına 5.3 milyon hücre kadar yüksek hücre konsantrasyonları üreterek on kat hacim azalması sağlandı. Protokol, üç bağımsız çalışma için sürekli olarak yaklaşık% 98'lik yüksek bir hücre iyileşmesi ve yaklaşık% 99'luk yüksek bir hücre canlılığı elde etti. Her iki yöntem kullanılarak toplanan Wharton's Jelly HMSC'leri, CD73, CD90 ve CD105 pozitif, CD34 ve CD45 negatif olan karakteristik yüzey işaretleyici profilleri sergiledi.Karşı akış santrifüjlemesinden toplanan hücreler, manuel santrifüjleme ile toplananlara kıyasla, benzer bir koloni oluşturan birim fibroblast testi veya CFU potansiyeli gösterdi. Her iki yöntemde de, hücreler adipositlere, osteoblastlara ve kondrositlere farklılaşma yeteneğini korudu. Karşı akış santrifüjleme sonrası hücrelerin sitokin sekresyon profilleri, karşı akış öncesi santrifüjleme ile karşılaştırılabilirdi.Tek kullanımlık kiti yatak kurulumuna göre monte ettiğinizden emin olun, bu Counterflow Santriffusion Sistem Protokol Oluşturucu'da değiştirin. Nihai üründen kalan safsızlıkların yıkanmasına yönelik protokol, kullanıcıların lot salım kriterlerini karşılamalarını desteklemek için klinik uygulamalarda kullanılabilir. Büyük ölçekli işleme için sıvı transferi sürecini hızlandırmak amacıyla, tripnize edilmiş içerikleri doğrudan çok katmanlı şişeden hasat etmek yerine önce bir transfer torbasına aktarmak için harici pompalar kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

İnsan Retina ve RPE koroid diseksiyon proteomik analizi için

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...