Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (tilskud RGPIN-2018-06442 til MMS). Vi takker dyreanlægget på CRCHUM og Dr. Junzheng Peng fra den kardiovaskulære fænotypeplatform.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Canadian Council on Animal Care efter godkendelse af CRCHUM's institutionelle dyreplejekomité. Otte uger gamle kvindelige BALB/c-mus, hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel), blev anvendt til denne undersøgelse. Dyrene fik kosttilskud med 10% inulin vægt/vægt i 2 uger. En kontrolgruppe modtog en lignende diæt, der manglede inulintilskuddet. Mus havde ad libitum adgang til kosten. En oversigt over analysen er vist i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over FITC-dextran-assayet. T-4-4 timer før sonde blev adgangen til mad fjernet. T0- FITC-dextran blev administreret via oral sonde. T1 - 1 time efter sonde, blev in vivo fluorescensen evalueret. T4- 4 timer efter sonden blev fækal- og plasmaprøverne opsamlet, og fluorescensen blev målt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
1. Administration af FITC-dextran
<ol><li>Før administration af FITC-dextran skal musene fastes i 4 timer, mens du bevarer adgangen til vand ad libitum . BEMÆRK: Fasten skal helst påbegyndes i begyndelsen af lyscyklussen (om morgenen). Musene kan overføres til et nyt bur uden strøelse under faste for at begrænse coprophagy.</li>
	<li>Forbered 200 μL 80 mg·ml-1 4 kDa FITC-dextran (se materialetabel) fortyndet i sterilt 1x fosfatbufret saltvand (PBS) (pr. Mus). Friskforbered prøverne umiddelbart før administration, og hold dem beskyttet mod lys.</li>
	<li>Hver mus administreres 200 μL FITC-dextran suspension via oral sonde ved hjælp af en steriliseret, buet sondekanyle på 38 mm 22 G med kugle- eller pæreformet spids (se materialetabel). Start en timer efter den første sonde, og vent i 5-10 minutter, før du sprøjter den næste mus for at muliggøre in vivo-målinger (trin 2), og hold altid 1 time efter gavlen. Opbevar den resterende FITC-dextran-affjedring til standardkurven. BEMÆRK: Umiddelbart efter sonden kan mad udskiftes for at sikre dannelse af afføring.</li>
</ol>2. In vivo-fluorescensmåling
<ol><li>Bedøv musene 1 time efter sonden ved hjælp af 2,5% isofluran eller et alternativt bedøvelsesmiddel. Bekræft, at dyret er passende bedøvet ved at klemme tåen eller halen og sikre, at dyret ikke reagerer.<ol><li>Fjern pelsen fra abdominalområdet ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, og påfør generøst oftalmisk smøresalve til øjnene for at forhindre tørring. Placer derefter musene individuelt i billeddannelseskammeret, der ligger dorsalt. BEMÆRK: Der skal medfølge én kontrolmus, der modtager PBS eller saltvand i stedet for FITC-dextran, for at tage højde for baggrunden under in vivo-billeddannelse .</li>
	</ol></li>
	<li>Tag billeder af musene ved hjælp af et fluorescensbilledkammer (se materialetabel). Få billeder af abdominalområdet, indstil laserlængden til 470 nm og opløsningen til 2,0 mm.<ol><li>Start maskinen og softwaren ved at klikke på startknappen og holde den nede. Lad systemet varme op. BEMÆRK: Systemet kan have brug for 20 minutter eller mere til at varme op, så maskinen skal startes tidligt for ikke at forstyrre billeddannelsen af musene 1 time efter sonde.</li>
		<li>Klik på Enhedsstatus , og sørg for, at alle de konfigurerede enheder viser "OK", før du fortsætter.</li>
		<li>Opvarm om nødvendigt den relevante laser ved at klikke på Laserstyring og derefter klikke på knappen Lasernavn på den ønskede laser.</li>
		<li>Start en ny undersøgelse ved at klikke på Ny undersøgelse. Gem under den relevante fil med det ønskede navn.</li>
		<li>Klik på Undersøgelsesindstillinger, indtast derefter prøve-id'et, og vælg den korrekte laser og eksperiment.</li>
		<li>Åbn billeddannelseskammeret, og anbring dyret dorsalt på scanningspladen. Fastgør lemmerne og halen med tape, og sørg for, at næse og mund passer tæt i anæstesirøret og opretholder 2,5% isofluran.</li>
		<li>Juster højden på scanningspladen, så scanningsområdet er let ventralt fra dyrets midterlinje. Juster pladen ved at dreje justeringsknappen inde i billedkammeret. Luk og lås døren til billedbehandlingskammeret.</li>
		<li>Vælg det område, der skal scannes, ved hjælp af tegneværktøjet . Medtag hele bredden af maven fra lige over leveren til endetarmen. Klik på redigeringsværktøjet for at justere området, når det er tegnet.</li>
		<li>Indstil scanningsopløsningen til 2.0 mm, og klik derefter på Næste. Når strømautomatiseringen er fuldført, skal du sikre dig, at indstillingerne er korrekte, og foretage de nødvendige justeringer. Klik på Start for at starte scanningen.</li>
		<li>Når scanningen er afsluttet, skal du fjerne dyret fra billeddannelseskammeret og placere det i en inkubator for at opretholde kropstemperaturen, mens du kommer dig efter anæstesi.</li>
		<li>Klik på Fortsæt undersøgelse for at bevare indstillingerne, og gentag derefter trin 2.2.5-2.2.10, indtil alle musene er scannet.</li>
		<li>Klik på tænd / sluk-knappen, og hold den nede i 3 sekunder for at slukke for billedkammeret.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluer fluorescensen ved at sammenligne abdominal fluorescens for hvert dyr og kontrolmusen på ensartet skalerede billeder ved hjælp af en software, der er forbundet med det anvendte billeddannelsessystem (se materialetabel).<ol><li>Åbn billedfilerne ved at finde dem under det valgte filnavn. Åbn alle de filer, der har synkroniserede indstillinger på samme tid.</li>
		<li>Brug værktøjslinjen til billedindstillinger til at bruge knapperne Synkroniser billede og Synkroniser skalering til at synkronisere indstillingerne for billederne, så du kan foretage en nøjagtig sammenligning.</li>
		<li>Gem billederne med deres justerede skalaer.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fluorescensmåling i fækale prøver og plasma
<ol><li>Saml en fækal pellet fra hver mus i et sterilt rør 4 timer efter sonde. Hold rørene i mørke på is.</li>
	<li>Bedøv musene via intraperitoneal injektion af 240 mg/ml pentobarbitalnatrium (fortynding, 1:100; se materialetabel). Administrer i en dosis på 0,03 ml/g legemsvægt.<ol><li>Der indsamles blodprøver på mindst 700 μL i et rør fremstillet til plasmaopsamling indeholdende heparin eller EDTA for at forhindre koagulation (se materialetabellen) ved at indsætte et glaskapillarrør i plexus14 med retroorbital. BEMÆRK: Alternative metoder til blodindsamling omfatter hjertepunktur eller tilbagetrækning fra halevenen. Da dette er en terminal procedure, skal musene aflives via cervikal dislokation eller en alternativ human metode. Følg den lokale dyreetiske komités anbefalinger for aktiv dødshjælp.</li>
	</ol></li>
	<li>Blodprøverne centrifugeres ved 9.390 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Overfør plasmaet til et nyt sterilt rør, og hold det i mørke på is.</li>
	<li>50 mg fækale prøver fortyndes i 200 μL 1x PBS og plasmaet fortyndes 1:2 med 1x PBS. Fortyndingsforholdet kan ændres baseret på intensiteten af fluorescenssignalet.</li>
	<li>Generer en standardkurve ved hjælp af serielle fortyndinger af FITC-dextran i 1x PBS. Start med den højeste koncentration på 20 mg·ml-1 FITC dextran, fortynd med en faktor på 1:1 serielt 7-10 gange. BEMÆRK: Koncentrationerne skal således læse 20 mg·ml−1, 10 mg·ml−1, 5 mg·ml−1, 2,5 mg·ml−1, 1,25 mg·ml−1, 0,625 mg·ml−1, 0,3125 mg·ml−1 osv.</li>
	<li>Plade 100 μL prøver og standarder i en uigennemsigtig sort 96-brønds plade. Medtag et PBS-tomt. Fluorescensen aflæses på en lysstofrørslæser (se materialetabel) med absorption ved 530 nm og excitation ved 485 nm. BEMÆRK: Prøverne og standarderne kan belægges i to eller tre eksemplarer, og derefter beregnes deres fluorescensværdier gennemsnitligt.</li>
	<li>Koncentrationen af FITC-dextran pr. prøve bestemmes ved at sammenligne fluorescensen med de kendte koncentrationer af standardkurven. I prøverne multipliceres koncentrationen med fortyndingsfaktoren (trin 3.5).</li>
</ol>

<ol>
	<li>K&#246;nig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+barrier+function+in+health+and+disease.">Human intestinal barrier function in health and disease.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).</li><li>Lorenzo-Zuniga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+I+improves+intestinal+barrier+function+in+cirrhotic+rats.">Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats.</a> Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).</li><li>Schwarz, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIGHT+signals+directly+to+intestinal+epithelia+to+cause+barrier+dysfunction+via+cytoskeletal+and+endocytic+mechanisms.">LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms.</a> Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).</li><li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis.">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li><li>Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+translocation+and+changes+in+the+intestinal+microbiome+in+mouse+models+of+liver+disease.">Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease.</a> Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).</li><li>Galipeau, H. J., Verdu, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+task+of+measuring+intestinal+permeability+in+basic+and+clinical+science.">The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science.</a> Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).</li><li>Bordoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+an+electrolyzed+reduced+water+on+gut+permeability,+fecal+microbiota+and+liver+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease.">Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).</li><li>Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+is+reduced+and+IL-10+levels+are+increased+in+septic+IL-6+knockout+mice.">Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).</li><li>Crapser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+induces+gut+permeability+and+enhances+bacterial+translocation+leading+to+sepsis+in+aged+mice.">Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice.</a> Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).</li><li>Mal Earley, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+alters+the+intestinal+microbiome+and+increases+gut+permeability+and+bacterial+translocation.">Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation.</a> PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut+microbiota+from+autism+spectrum+disorder+promote+behavioral+symptoms+in+mice.">Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice.</a> Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).</li><li>Schroeder, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+or+fiber+protects+against+diet-induced+microbiota-mediated+colonic+mucus+deterioration.">Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).</li><li>Hajjar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+colonic+healing+and+surgical+recovery+with+perioperative+supplementation+of+inulin+and+galacto-oligosaccharides.">Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides.</a> Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Blood+Withdrawal+I.">Lab Animal Research. Blood Withdrawal I.</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Costantini, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+intestinal+injury+using+a+novel+in+vivo,+near-infrared+imaging+technique.">Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique.</a> Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).</li><li>Thevaranjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+microbial+dysbiosis+promotes+intestinal+permeability,+systemic+inflammation,+and+macrophage+dysfunction.">Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+intestinal+permeability.">Alterations in intestinal permeability.</a> Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).</li><li>von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+intestinal+permeability+in+Crohn's+disease+patients+using+orally+administered+52Cr-EDTA.">Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA.</a> PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).</li><li>Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+and+blood+correlates+of+reduced+functional+connectivity+in+mild+cognitive+impairment.">Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment.</a> Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen afsløringer.

Tarmbarrierefunktionen er en integreret del af mange forskellige sygdomsprocesser. Derfor er vurdering af tarmpermeabilitet på en ikke-invasiv, omkostningseffektiv og kvantificerbar måde afgørende for nøjagtigt at repræsentere disse sygdomme i dyremodeller. FITC-dextran-analysen giver mulighed for denne repræsentation. Denne protokol involverer dog flere kritiske trin, der skal udføres nøjagtigt for at opnå pålidelige resultater. For det første er det vigtigt at sikre brugen af FITC-dextran i passende størrelse. Til undersøgelse af in vivo-permeabilitet er 4 kDa FITC-dextran den optimale molekylvægt, og når molekylvægten stiger, falder permeabiliteten15. Anvendelse af FITC-dextran med en anden molekylvægt kan således give forvirrende eller upålidelige resultater. Derudover er det vigtigt at notere tidspunktet for hver sonde og justere tidspunkterne for in vivo-dataindsamling og indsamling af plasma og afføring i overensstemmelse hermed. For eksempel, hvis to mus er sondet 10 min fra hinanden, skal in vivo fluorescensaflæsningerne og opsamlingen af afføring og plasma også forekomme 10 min mellemrum. Sammenligning af fluorescensen på samme tidspunkter giver mulighed for en mere nøjagtig repræsentation af forskellene i permeabilitet. Desuden bør den rækkefølge, hvori dyrene fra forskellige grupper testes, skiftes for at undgå en klyngeeffekt på grund af tidspunktet. I stedet for at teste alle dyrene i gruppe A først, derefter alle dyrene i gruppe B anden (AAABBB), anbefales det, at gruppen skiftes efter hvert dyr (ABABAB).
Dette assay kan ændres til kun at omfatte evaluering af plasma- og fækalprøver, hvis der mangler adgang til en billeddannelsesmaskine. Selvom direkte fluorescensbilleddannelse in vivo muliggør visualisering af leverindtag og resterende abdominal fluorescens, giver evaluering af fluorescens i plasma- og fækalprøver stadig en kvantitativ måling af tarmpermeabilitet. Som det beskrevne eksperiment har vist, korrelerer fluorescensniveauerne i plasma og afføring desuden godt med in vivo-billeddannelsen. Derudover kan dette assay ændres til kun at omfatte in vivo-billeddannelsen. Dette gør det muligt for dyrene at blive holdt i live for at fortsætte med at teste andre parametre eller overvåge, hvordan tarmpermeabiliteten ændrer sig over tid. Evnen til at ændre dette assay gør det derfor tilgængeligt, men stadig kvantitativt. Endelig er doseringen på 200 μL 80 mg·ml-1 FITC-dextran , der gives til hver mus, blevet anvendt tidligere og viste sig at være effektiv hos mus med små forskelle i kropsvægt16. Desuden er det vigtigt at bemærke, at alle de mus, der blev brugt i afsnittet om repræsentative resultater, vejede ca. 20 g, hvilket gjorde det muligt at bruge den samme dosis til hver mus. For at tage højde for forskelle i kropsvægt kan FITC-dextran dog administreres i en dosis på 0,6-0,8 mg / g legemsvægt, for eksempel17. Uanset hvilken dosis der anvendes, er det vigtigt at begrænse mængden af gaver til hver mus til mindre end 10 ml · kg − 1 for at forhindre komplikationer eller ubehag18.
Selvom FITC-dextran-analysen giver en effektiv metode til evaluering af tarmbarrierefunktionen, har den stadig nogle begrænsninger. En begrænsning ved denne model er, at den kræver, at musene fastes i flere timer, hvilket betyder, at det er upålideligt at sammenligne disse resultater med dem fra mus, der ikke er blevet fastet. Derudover kan faste påvirke resultaterne i visse modeller, der kræver strenge fodringsplaner, såsom ved måling af blodsukker i dyremodeller for diabetes.
På trods af disse begrænsninger forbliver FITC-dextran-analysen en effektiv metode til analyse af tarmpermeabilitet, da den er kvantitativ, alsidig, omkostningseffektiv og mindre invasiv end mange klassiske metoder. For eksempel er almindelige sonder, der anvendes til måling af tarmpermeabilitet, små saccharidprober eller Cr-EDTA, som har nogle fordele19. Nogle saccharidsonder har dog kun regionsspecifik permeabilitet. Da de hydrolyseres i den distale del af tyndtarmen, giver de ingen indsigt i kolonpermeabilitet19. På den anden side kan Cr-EDTA give information om kolonpermeabilitet, men kræver målinger i 24 timer, hvilket gør tidsbyrden ved denne metode meget højere end FITC-dextran-assay20. Desuden giver ingen af disse metoder direkte in vivo-billeddannelse af dette assay. Derfor giver FITC-dextran-analysen en relativt enkel, direkte og effektiv mulighed sammenlignet med alternative metoder til måling af tarmpermeabilitet.
Endelig er tarmpermeabilitet i sygdomsprocesser som IBD4, Alzheimers sygdom21 og leversygdom2 en vigtig parameter, der kan måles ved hjælp af FITC-dextran-analysen for at forbedre undersøgelserne. For eksempel kan dette assay ved udvikling af nye behandlinger, såsom immunterapier til IBD'er, bruges til at teste effektiviteten af det terapeutiske middel til opretholdelse af tarmbarriereintegritet. I betragtning af at nedsat tarmbarrierefunktion kan være impliceret i at opretholde den kroniske inflammation i UC, for eksempel er det vigtigt at undersøge, hvor godt en terapeutisk beskytter mod øget permeabilitet4. Dette er kun et eksempel, men FITC-dextran-analysen er en tilgængelig og kvantificerbar måde at måle tarmpermeabilitet på mange forskellige områder og aspekter af forskning.

Tarmbarrieren spiller en vigtig rolle i både sundhed og sygdom. Det kræver en kompleks balance mellem at lade de nødvendige næringsstoffer trænge ind i kredsløbet fra tarmens lumen og samtidig forhindre indtrængning af proinflammatoriske molekyler, såsom patogener eller antigener1. Øget permeabilitet kan skyldes mange gastrointestinale lidelser, såsom leversygdom eller inflammatoriske tarmsygdomme (IBD'er)2,3. For eksempel i ulcerøs colitis (UC), en IBD, fører kronisk inflammation til nedbrydning af stramme kryds, den efterfølgende forstyrrelse af tarmbarrieren og translokation af bakterier, hvilket potentielt opretholder slimhinde og systemisk inflammation4.
Tarmbarriereintegritet er derfor en vigtig markør for tarmsundhed. Imidlertid har nuværende metoder til måling af tarmpermeabilitet mange begrænsninger. For eksempel er metoder til måling af plasmainflammatoriske markører eller bakteriel translokation til milt og lymfeknuder indirekte 5,6. Andre metoder kan være invasive og tidskrævende. Denne artikel beskriver et ikke-invasivt og omkostningseffektivt assay, der direkte og kvantitativt måler tarmpermeabilitet. Dette assay bruger fluorescein-isothiocyanatmærket dextran (FITC-dextran) til at følge tarmpermeabilitet i realtid ved at måle fluorescens in vivo. Derudover kvantificerer måling af FITC-dextranniveauer i plasma og afføring tarmpermeabiliteten (figur 1).
FITC-dextranpermeabilitetsanalysen er tidligere blevet brugt i mange forskellige sammenhænge, herunder i dyremodeller af Parkinsons sygdom7, sepsis8, iskæmisk slagtilfælde9 og forbrændingsskade10. Derudover er dette assay for nylig blevet brugt til at hjælpe med at forstå, hvordan tarmmikrobiomet kan være impliceret i forskellige sygdomsprocesser, og hvordan det kan målrettes eller manipuleres som en potentiel terapeutisk. For eksempel er det blevet brugt til at studere mikrobiom og mikrobiombaserede behandlinger i aldring 11, IBD'er 12, kolorektal cancer13 og autismespektrumforstyrrelse11. Da tarmbarrierefunktionen er impliceret i mange aspekter af sundhed og sygdom, er dette assay blevet brugt bredt. Dens relative enkelhed og lave tidsbyrde gør den ideel til test af in vivo-forhold, der mistænkes for at ændre tarmbarriereintegriteten. Dens kvantitative resultater er nyttige til bestemmelse af effektiviteten af en potentiel behandling.
I denne undersøgelse blev effekten af diæt på tarmbarrierefunktionen evalueret ved hjælp af FITC-dextran-assayet. Tarmpermeabiliteten hos mus, der fik en kontroldiæt, og tarmpermeabiliteten hos mus, der fik en inulinsuppleret diæt, blev sammenlignet. Inulin er et gavnligt oligosaccharid, der har vist sig at forbedre tarmbarrierefunktionen12,13. Til in vivo fluorescensmålinger (baggrund) blev yderligere én ubehandlet mus anvendt som negativ kontrol og fik PBS i stedet for FITC-dextran. Dette eksperiment viser, at FITC-dextran-analysen er et værdifuldt værktøj til evaluering af tarmpermeabilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

Tarmbarriereintegritet er et kendetegn ved tarmsundhed. Mens tarmbarriereintegritet kan vurderes ved hjælp af indirekte markører såsom måling af plasmainflammatoriske markører og bakteriel translokation til milt og lymfeknuder, kvantificerer guldstandarden direkte udvalgte molekylers evne til at krydse tarmslimhindelaget mod systemisk cirkulation. Denne artikel bruger en ikke-invasiv, omkostningseffektiv og lavbelastet teknik til at kvantificere og følge i realtid tarmpermeabiliteten hos mus ved hjælp af fluorescein-isothiocyanatmærket dextran (FITC-dextran). Før oral tilskud med FITC-dextran fastes musene. De serveres derefter med FITC-dextran fortyndet i fosfatbufret saltvand (PBS). En time efter sonden udsættes musene for generel anæstesi ved hjælp af isofluran, og in vivo-fluorescensen visualiseres i et billeddannelseskammer. Denne teknik har til formål at vurdere resterende fluorescens i bughulen og leveroptagelsen, hvilket tyder på portalmigration af den fluorescerende sonde. Blod- og afføringsprøver indsamles 4 timer efter oral sonde, og musene ofres. Plasma- og fækalprøver fortyndet i PBS belægges derefter, og fluorescensen registreres. Koncentrationen af FITC-dextran beregnes derefter ved hjælp af en standardkurve. I tidligere forskning har in vivo-billeddannelse vist, at fluorescens hurtigt spredes til leveren hos mus med en svagere tarmbarriere induceret af en fiberfattig kost, mens det fluorescerende signal hos mus suppleret med fiber for at styrke tarmbarrieren bevares mest i mave-tarmkanalen. Derudover havde kontrolmus i denne undersøgelse forhøjet plasmafluorescens og reduceret fluorescens i afføringen, mens inulin-supplerede mus omvendt havde højere niveauer af fluorescenssignaler i tarmen og lave niveauer i plasmaet. Sammenfattende giver denne protokol kvalitative og kvantitative målinger af tarmpermeabilitet som markør for tarmsundhed.

Analysen af in vivo-fluorescensen viste, at mus, der kun fik kontroldiæten, havde et højere leverindtag af FITC-dextran og højere niveauer af resterende fluorescens i bughulen sammenlignet med de mus, der fik inulintilskudskosten (figur 2A). En vis fluorescens var synlig i caecum hos de mus, der modtog inulindiet, men der var lidt eller intet leverindtag, hvilket indikerer, at disse diæter beskyttede mod øget tarmpermeabilitet.
Fluorescensniveauerne i plasma- og fækalprøver arbejder for at forstærke og kvantificere deres in vivo-modstykker . Musene, der modtog inulin-suppleret diæt, havde signifikant lavere niveauer af FITC-dextran i deres plasma sammenlignet med de mus, der kun modtog kontroldiet (figur 2B). Dette indikerer, at de havde forbedret tarmbarrierefunktionen, fordi mindre FITC-dextran kunne gennemtrænge tarmbarrieren i kredsløbet. Tilsvarende havde musene, der modtog inulindiet, signifikant højere niveauer af FITC-dextran i deres afføring end de mus, der kun modtog kontroldiet (figur 2C). Dette forstærker, at de havde intakt tarmbarrierefunktion, da FITC-dextran forblev i tyktarmen indtil udskillelse, som det anses for normalt. De lavere niveauer af FITC-dextran i afføringen hos kontrolmusene indikerer, at det gennemsyrede gennem tarmbarrieren ind i kredsløbet snarere end at blive udskilt korrekt. De høje niveauer af FITC-dextran i plasmaet forstærker dette fund.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Figur 2: Kosttilskud med inulin nedsætter translokationen af FITC-dextran gennem tarmbarrieren . A) Restfluorescens og leveroptagelse af FITC-dextran. Rød = højeste intensitet; mørk lilla = laveste intensitet. Maksimal fluorescens på 2,15 x 103, minimum fluorescens på 0,378. B) Den plasmatiske koncentration af FITC-dextran. P = 0,010. C) Den fækale koncentration af FITC-dextran. P = 0,00003. N = 4 pr. Gruppe. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM. Hver prik repræsenterer en mus. Uparret elevs t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

I denne undersøgelse administreres fluorescein-isothiocyanatmærket (FITC) dextran til mus via oral sonde for at evaluere tarmpermeabilitet både in vivo og i plasma- og fækalprøver. Da tarmbarrierefunktionen påvirkes i mange sygdomsprocesser, kan dette direkte og kvantitative assay anvendes inden for forskellige forskningsområder.

Vurdering af tarmbarriereintegritet hos mus ved hjælp af fluorescein-isothiocyanat-mærket dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Denne metode hjælper med at besvare spørgsmål om, hvorvidt en tilstand ændrer tarmbarriereintegritet eller spørgsmål om, hvorvidt en potentiel behandling kan opretholde tarmbarriereintegritet. Den største fordel ved denne teknik er, at den tilbyder en ikke-invasiv teknik med lav belastning til evaluering og kvantificering af tarmpermeabilitet in vivo. Til at begynde med skal du faste musene i fire timer og derefter administrere 200 mikroliter FITC-dextran-suspensionen via oral sonde til hver mus ved hjælp af en 38 millimeter 22 gauge steriliseret buet sondenål.Start en timer efter den første sonde, og vent fem til 10 minutter mellem hver sonde for at tillade in vivo-målinger, idet du opretholder en time efter sonden. Opbevar den resterende FITC-dextran-affjedring til standardkurven. Start maskinen og softwaren ved at klikke på startknappen og holde den nede, og lad systemet varme op.Klik på Enhedsstatus, og sørg for, at alle de konfigurerede enheder viser OK, før du fortsætter. Klik derefter på Ny undersøgelse og gem filen med det ønskede navn. Klik derefter på Studieindstillinger.Indtast prøve-id'et, og vælg den korrekte laser, og eksperiment. Fjern derefter pelsen fra abdominalområdet ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, og påfør veterinærsalve generøst på øjnene for at forhindre tørring. Åbn billeddannelseskammeret, og anbring dyret dorsalt på scanningspladen.Fastgør derefter lemmerne og halen med tape. Vælg derefter det område, der skal scannes, ved hjælp af tegneværktøjet. Sørg for at inkludere hele bredden af maven fra lige over leveren til endetarmen.Klik derefter på Modify værktøj for at justere området, når det er tegnet. Indstil scanningsopløsningen til 2.0 millimeter, og klik på Start for at starte scanningen. Åbn derefter billedfilerne ved at finde dem under det valgte filnavn og samtidig åbne alle filerne med synkroniserede indstillinger.Brug værktøjslinjen til billedindstillinger til at bruge knapperne Synkroniser billede og Synkroniser skala til at synkronisere billedindstillingerne for at få en nøjagtig sammenligning. Gem derefter billederne med de justerede skalaer. Sammenlign abdominal fluorescens af hvert dyr og kontrolmusen på ensartet skalerede billeder ved hjælp af software forbundet med billeddannelsessystemet.Saml en fækal pellet fra hver mus i et sterilt rør fire timer efter sonde. Hold derefter rørene på is og læg dem i mørket. Derefter centrifugeres blodprøverne ved 9.390 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.Overfør derefter plasmaet til et nyt sterilt rør og hold det på is i mørke. Fortynd 50 mg fækale prøver i 200 mikroliter PBS, og fortynd plasmaet med PBS i et til to forhold. Plade 100 mikroliter prøver og standarder i en uigennemsigtig sort 96-brønd plade.Aflæs fluorescensen på en fluorescerende pladelæser med excitation ved 485 nanometer og absorption ved 530 nanometer. Endelig bestemmes koncentrationen af FITC-dextran pr. prøve ved at sammenligne fluorescensen med de kendte koncentrationer af standardkurven. Analysen af in vivo-fluorescensen viste, at mus, der kun fik kontroldiæten, havde et højere leverindtag af FITC-dextran og højere niveauer af resterende fluorescens i bughulen sammenlignet med de mus, der fik inulintilskudskosten.Musene, der modtog inulintilskudskosten, havde signifikant lavere niveauer af FITC-dextran i deres plasma sammenlignet med de mus, der kun fik kontroldiet. Tilsvarende havde musene, der modtog inulindiet, signifikant højere niveauer af FITC-dextran i deres afføring end de mus, der kun modtog kontroldiet. De lavere niveauer af FITC-dextran i afføringen hos de kontrollerede mus indikerer, at det gennemsyrede gennem tarmbarrieren ind i kredsløbet snarere end at blive udskilt korrekt.De høje niveauer af FITC-dextran i plasmaet forstærkede dette fund. Timing er afgørende, når du forsøger denne procedure. Fluorescensaflæsning og prøveopsamling bør ske så tæt som muligt på en time og fire timer efter sonde for hver enkelt mus.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

En protokol til brug af gen sæt berigelse analyse til at identificere den passende dyremodel for Translationel forskning

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

En metode til vurdering af bakterieocin-virkninger på musens tarmmikrobiotikum

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokol for genetiske Gut indhold analyser af akvatiske Macroinvertebrates brug af gruppe-specifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studere Ribonucleotide vedtægter: Strand-specifik påvisning af Ribonucleotides i gær genom og måling Ribonucleotide-induceret mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Høj overførselshastighed måling af tarm transittid ved hjælp af larve zebrafisk

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Vurdering af Zebrafish linse kerne lokalisering og Sutural integritet

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Vurdering af de metaboliske virkninger af Isokalorisk 2:1 intermitterende faste i mus

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...