Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (subsidie RGPIN-2018-06442 aan MMS). We bedanken de dierenfaciliteit van het CRCHUM en Dr. Junzheng Peng van het Cardiovascular Phenotyping Platform.

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care na goedkeuring door het Institutional Animal Care Committee van het CRCHUM. Acht weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen, verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen), werden gebruikt voor deze studie. De dieren kregen gedurende 2 weken voedingssuppletie met 10% inuline wt/wt. Een controlegroep kreeg een vergelijkbaar dieet zonder het inulinesupplement. Muizen hadden ad libitum toegang tot het dieet. Een overzicht van de test is weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de FITC-dextran assay. T-4- 4 uur voorafgaand aan de maagsonde werd de toegang tot voedsel verwijderd. T0- FITC-dextran werd toegediend via orale maagsonde. T1 - 1 h na de maagsonde werd de in vivo fluorescentie geëvalueerd. T4- 4 h na de maagsonde werden de fecale en plasmamonsters verzameld en de fluorescentie werd gemeten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Toediening van FITC-dextran
<ol><li>Voordat u FITC-dextran toedient, moet u de muizen gedurende 4 uur vasten met behoud van ad libitum toegang tot water. OPMERKING: Het vasten moet bij voorkeur worden gestart aan het begin van de lichtcyclus (in de ochtend). De muizen kunnen tijdens het vasten zonder beddengoed naar een nieuwe kooi worden overgebracht om coprofagie te beperken.</li>
	<li>Bereid 200 μL van 80 mg·ml−1 4 kDa FITC-dextran (zie tabel met materialen) verdund in steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (per muis). Bereid de monsters onmiddellijk voor toediening vers voor en bescherm ze tegen licht.</li>
	<li>Dien 200 μL van de FITC-dextran suspensie via orale maagsonde toe aan elke muis met behulp van een 38 mm 22 G gesteriliseerde, gebogen maagnaald met een kogel- of peervormige punt (zie materiaaltabel). Start een timer na de eerste maagsonde en wacht 5-10 minuten voordat u de volgende muis gavagaat om in vivo metingen mogelijk te maken (stap 2), waarbij u altijd 1 uur na de maagsonde behoudt. Houd de resterende FITC-dextran-ophanging voor de standaardcurve. OPMERKING: Onmiddellijk na de maagsonde kan voedsel worden vervangen om de vorming van uitwerpselen te garanderen.</li>
</ol>2. In vivo fluorescentiemeting
<ol><li>Verdoof de muizen 1 uur na de maagsonde met behulp van 2,5% isofluraan of een alternatief verdovingsmiddel. Bevestig dat het dier op de juiste manier wordt verdoofd door in de teen of de staart te knijpen en ervoor te zorgen dat het dier niet reageert.<ol><li>Verwijder de vacht uit de buikstreek met behulp van een elektrisch scheerapparaat en breng royaal oftalmische smeerzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats de muizen vervolgens individueel in de beeldvormingskamer die dorsaal ligt. OPMERKING: Er moet één controlemuis worden meegeleverd die PBS of zoutoplossing ontvangt in plaats van FITC-dextran om rekening te houden met de achtergrond tijdens in vivo beeldvorming.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de muizen in beeld met behulp van een fluorescentiebeeldkamer (zie Materiaaltabel). Verkrijg beelden van de buikstreek, stel de laserlengte in op 470 nm en de resolutie op 2,0 mm.<ol><li>Start het apparaat en de software door op de startknop te klikken en deze ingedrukt te houden. Laat het systeem opwarmen. OPMERKING: Het systeem kan 20 minuten of meer nodig hebben om op te warmen, dus de machine moet vroeg worden gestart om de beeldvorming van de muizen 1 uur na de maagsonde niet te verstoren.</li>
		<li>Klik op Apparaatstatus en zorg ervoor dat alle geconfigureerde apparaten "OK" weergeven voordat u doorgaat.</li>
		<li>Warm indien nodig de juiste laser op door op Laserbesturing te klikken en vervolgens op de knop Lasernaam van de gewenste laser te klikken.</li>
		<li>Start een nieuw onderzoek door op Nieuw onderzoek te klikken. Opslaan onder het juiste bestand met de gewenste naam.</li>
		<li>Klik op Studieopties, voer vervolgens de Specimen ID in en kies de juiste laser en experimenteer.</li>
		<li>Open de beeldkamer en plaats het dier dorsaal op de scanplaat. Zet de ledematen en staart vast met tape en zorg ervoor dat de neus en mond goed in de anesthesiebuis passen, met behoud van 2,5% isofluraan.</li>
		<li>Pas de hoogte van de scanplaat aan zodat het scangebied enigszins ventraal is ten opzichte van de middellijn van het dier. Pas de plaat aan door aan de instelknop in de beeldkamer te draaien. Sluit en vergrendel de deur van de beeldkamer.</li>
		<li>Selecteer het gebied dat u wilt scannen met het gereedschap Tekenen . Neem de hele breedte van de buik op van net boven de lever tot het rectum. Klik op het gereedschap Wijzigen om het gebied aan te passen zodra het is getekend.</li>
		<li>Stel de scanresolutie in op 2,0 mm en klik op Volgende. Zodra de stroomautomatisering is voltooid, controleert u of de instellingen correct zijn en brengt u de nodige aanpassingen aan. Klik op Start om de scan te starten.</li>
		<li>Zodra de scan is voltooid, verwijdert u het dier uit de beeldvormingskamer en plaatst u het in een couveuse om de lichaamstemperatuur te handhaven terwijl u herstelt van anesthesie.</li>
		<li>Klik op Doorgaan met onderzoek om de instellingen te behouden en herhaal stap 2.2.5-2.2.10 totdat alle muizen zijn gescand.</li>
		<li>Klik op de aan / uit-knop en houd deze 3 s ingedrukt om de beeldkamer uit te schakelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Evalueer de fluorescentie door de abdominale fluorescentie van elk dier en de controlemuis te vergelijken op uniform geschaalde beelden met behulp van een software die is gekoppeld aan het gebruikte beeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel).<ol><li>Open de afbeeldingsbestanden door ze te zoeken onder de gekozen bestandsnaam. Open alle bestanden met gesynchroniseerde instellingen tegelijkertijd.</li>
		<li>Gebruik de werkbalk Afbeeldingsinstellingen om de knoppen Afbeelding synchroniseren en Schalen synchroniseren om de instellingen voor de afbeeldingen te synchroniseren, zodat u een nauwkeurige vergelijking kunt maken.</li>
		<li>Sla de afbeeldingen op met hun aangepaste schalen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fluorescentiemeting in fecale monsters en plasma
<ol><li>Verzamel een fecale pellet van elke muis in een steriele buis 4 uur na de maagsonde. Houd de buizen in het donker op ijs.</li>
	<li>Verdoof de muizen via intraperitoneale injectie van 240 mg / ml pentobarbitalnatrium (verdunning, 1:100; zie tabel met materialen). Toedienen in een dosis van 0,03 ml/g lichaamsgewicht.<ol><li>Verzamel bloedmonsters van ten minste 700 μL in een buis die is gemaakt voor plasmaverzameling die heparine of EDTA bevat om stolling te voorkomen (zie tabel met materialen) door een glazen capillaire buis in de retroorbitale plexus14 in te brengen. OPMERKING: Alternatieve methoden voor bloedafname omvatten hartpunctie of terugtrekking uit de staartader. Omdat dit een terminale procedure is, moeten de muizen worden geëuthanaseerd via cervicale dislocatie of een alternatieve humane methode. Volg de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dierenhygiëne voor euthanasie.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeer de bloedmonsters op 9.390 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Breng het plasma over in een nieuwe steriele buis en houd het in het donker op ijs.</li>
	<li>Verdun 50 mg fecale monsters in 200 μL 1x PBS en verdun het plasma 1:2 met 1x PBS. De verdunningsverhouding kan worden aangepast op basis van de intensiteit van het fluorescentiesignaal.</li>
	<li>Genereer een standaardcurve met behulp van seriële verdunningen van FITC-dextran in 1x PBS. Beginnend met de hoogste concentratie van 20 mg·mL−1 FITC dextran, verdunnen met een factor 1:1 serieel 7-10 keer. OPMERKING: De concentraties moeten dus 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2,5 mg·mL−1, 1,25 mg·mL−1, 0,625 mg·ml−1, 0,3125 mg·ml−1, enz.</li>
	<li>Plaat 100 μL monsters en standaarden in een ondoorzichtige zwarte 96-well plaat. Voeg een PBS-lege ruimte toe. Lees de fluorescentie op een fluorescerende plaatlezer (zie Materiaaltabel) met de absorptie bij 530 nm en de excitatie bij 485 nm. OPMERKING: De monsters en normen kunnen in tweevoud of drievoud worden geplaatst en vervolgens worden hun fluorescentiewaarden gemiddeld.</li>
	<li>Bepaal de concentratie FITC-dextran per monster door de fluorescentie te vergelijken met de bekende concentraties van de standaardcurve. Vermenigvuldig in de monsters de concentratie met de verdunningsfactor (stap 3.5).</li>
</ol>

<ol>
	<li>K&#246;nig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+barrier+function+in+health+and+disease.">Human intestinal barrier function in health and disease.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).</li><li>Lorenzo-Zuniga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+I+improves+intestinal+barrier+function+in+cirrhotic+rats.">Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats.</a> Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).</li><li>Schwarz, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIGHT+signals+directly+to+intestinal+epithelia+to+cause+barrier+dysfunction+via+cytoskeletal+and+endocytic+mechanisms.">LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms.</a> Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).</li><li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis.">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li><li>Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+translocation+and+changes+in+the+intestinal+microbiome+in+mouse+models+of+liver+disease.">Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease.</a> Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).</li><li>Galipeau, H. J., Verdu, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+task+of+measuring+intestinal+permeability+in+basic+and+clinical+science.">The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science.</a> Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).</li><li>Bordoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+an+electrolyzed+reduced+water+on+gut+permeability,+fecal+microbiota+and+liver+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease.">Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).</li><li>Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+is+reduced+and+IL-10+levels+are+increased+in+septic+IL-6+knockout+mice.">Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).</li><li>Crapser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+induces+gut+permeability+and+enhances+bacterial+translocation+leading+to+sepsis+in+aged+mice.">Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice.</a> Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).</li><li>Mal Earley, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+alters+the+intestinal+microbiome+and+increases+gut+permeability+and+bacterial+translocation.">Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation.</a> PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut+microbiota+from+autism+spectrum+disorder+promote+behavioral+symptoms+in+mice.">Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice.</a> Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).</li><li>Schroeder, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+or+fiber+protects+against+diet-induced+microbiota-mediated+colonic+mucus+deterioration.">Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).</li><li>Hajjar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+colonic+healing+and+surgical+recovery+with+perioperative+supplementation+of+inulin+and+galacto-oligosaccharides.">Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides.</a> Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Blood+Withdrawal+I.">Lab Animal Research. Blood Withdrawal I.</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Costantini, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+intestinal+injury+using+a+novel+in+vivo,+near-infrared+imaging+technique.">Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique.</a> Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).</li><li>Thevaranjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+microbial+dysbiosis+promotes+intestinal+permeability,+systemic+inflammation,+and+macrophage+dysfunction.">Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+intestinal+permeability.">Alterations in intestinal permeability.</a> Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).</li><li>von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+intestinal+permeability+in+Crohn's+disease+patients+using+orally+administered+52Cr-EDTA.">Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA.</a> PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).</li><li>Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+and+blood+correlates+of+reduced+functional+connectivity+in+mild+cognitive+impairment.">Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment.</a> Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen onthullingen hebben.

De darmbarrièrefunctie is een integraal onderdeel van veel verschillende ziekteprocessen. Het beoordelen van de darmdoorlaatbaarheid op een niet-invasieve, kosteneffectieve en kwantificeerbare manier is dus essentieel voor het nauwkeurig weergeven van deze ziekten in diermodellen. De FITC-dextran assay biedt de mogelijkheid voor deze representatie. Dit protocol omvat echter verschillende kritieke stappen die nauwkeurig moeten worden voltooid om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Ten eerste is het essentieel om ervoor te zorgen dat FITC-dextranten van de juiste grootte worden gebruikt. Voor het onderzoeken van in vivo permeabiliteit is 4 kDa FITC-dextran het optimale molecuulgewicht en naarmate het molecuulgewicht toeneemt, neemt de permeabiliteit af15. Het gebruik van FITC-dextran met een ander molecuulgewicht kan dus verwarrende of onbetrouwbare resultaten opleveren. Daarnaast is het belangrijk om de tijd van elke maagsonde te noteren en de tijdstippen voor in vivo gegevensverzameling en de verzameling van plasma en uitwerpselen dienovereenkomstig aan te passen. Als twee muizen bijvoorbeeld 10 minuten uit elkaar liggen, moeten de in vivo fluorescentiemetingen en het verzamelen van uitwerpselen en plasma ook 10 minuten uit elkaar plaatsvinden. Door de fluorescentie op dezelfde tijdstippen te vergelijken, kunnen de verschillen in permeabiliteit nauwkeuriger worden weergegeven. Bovendien moet de volgorde waarin de dieren uit verschillende groepen worden getest, worden afgewisseld om een clustereffect als gevolg van timing te voorkomen. In plaats van eerst alle dieren in groep A te testen en vervolgens alle dieren in groep B tweede (AAABBB), wordt aanbevolen om de groep na elk dier te wisselen (ABABAB).
Deze test kan worden aangepast om alleen de evaluatie van plasma- en fecale monsters op te nemen als er geen toegang is tot een beeldvormingsmachine. Hoewel directe fluorescentiebeeldvorming in vivo de visualisatie van leverinname en resterende abdominale fluorescentie mogelijk maakt, biedt het evalueren van fluorescentie in de plasma- en fecale monsters nog steeds een kwantitatieve meting van de darmpermeabiliteit. Bovendien, zoals aangetoond door het beschreven experiment, correleren de fluorescentieniveaus in het plasma en de ontlasting goed met de in vivo beeldvorming. Bovendien kan deze test worden aangepast om alleen de in vivo beeldvorming op te nemen. Hierdoor kunnen de dieren in leven worden gehouden om andere parameters te blijven testen of te controleren hoe de darmpermeabiliteit in de loop van de tijd verandert. De mogelijkheid om deze test te wijzigen, maakt het daarom toegankelijk, maar nog steeds kwantitatief. Ten slotte is de dosering van 200 μL van 80 mg·ml−1 FITC-dextran die aan elke muis is gegeven, eerder gebruikt en bleek deze effectief te zijn bij muizen met kleine verschillen in lichaamsgewicht16. Bovendien is het belangrijk op te merken dat alle muizen die in de representatieve resultatensectie werden gebruikt, ongeveer 20 g wogen, waardoor voor elke muis dezelfde dosering kon worden gebruikt. Om rekening te houden met verschillen in lichaamsgewicht, kan FITC-dextran echter worden toegediend in een dosering van 0,6-0,8 mg / g lichaamsgewicht, bijvoorbeeld17. Cruciaal is dat, ongeacht de gebruikte dosering, het belangrijk is om de hoeveelheid die aan elke muis wordt gegeven te beperken tot minder dan 10 ml · kg − 1 om complicaties of ongemak te voorkomen18.
Hoewel de FITC-dextran-test een effectieve methode biedt voor het evalueren van de darmbarrièrefunctie, heeft deze nog steeds enkele beperkingen. Een beperking van dit model is dat het vereist dat de muizen enkele uren worden vast, wat betekent dat het onbetrouwbaar is om deze resultaten te vergelijken met die van muizen die niet zijn gevast. Bovendien kan vasten de uitkomsten beïnvloeden in bepaalde modellen die strikte voedingsschema's vereisen, zoals bij het meten van bloedglucose in diermodellen voor diabetes.
Ondanks deze beperkingen blijft de FITC-dextran-test een effectieve methode voor het analyseren van de darmpermeabiliteit, omdat deze kwantitatief, veelzijdig, kosteneffectief en minder invasief is dan veel klassieke methoden. Veel voorkomende sondes die worden gebruikt voor het meten van de darmdoorlaatbaarheid zijn bijvoorbeeld kleine saccharidesondes of Cr-EDTA, die enkele voordelen hebben19. Sommige saccharidesondes hebben echter alleen regiospecifieke permeabiliteit. Omdat ze in het distale deel van de dunne darm worden gehydrolyseerd, geven ze geen inzicht in de darmpermeabiliteit19. Aan de andere kant kan Cr-EDTA informatie geven over de permeabiliteit van de dikke darm, maar vereist metingen gedurende 24 uur, waardoor de tijdsbelasting van deze methode veel hoger is dan die van de FITC-dextran-assay20. Bovendien biedt geen van deze methoden de directe in vivo beeldvorming van deze test. Daarom biedt de FITC-dextran-test een relatief eenvoudige, directe en effectieve optie in vergelijking met alternatieve methoden voor het meten van de darmpermeabiliteit.
Ten slotte is in ziekteprocessen zoals IBD's4, de ziekte van Alzheimer21 en leverziekte2 de darmpermeabiliteit een belangrijke parameter die kan worden gemeten met behulp van de FITC-dextran-test om studies te verbeteren. Bij het ontwikkelen van nieuwe behandelingen, zoals immunotherapieën voor IBD's, kan deze test bijvoorbeeld worden gebruikt om de werkzaamheid van het therapeutische middel voor het behoud van de integriteit van de darmbarrière te testen. Gezien het feit dat een verminderde darmbarrièrefunctie betrokken kan zijn bij het bestendigen van de chronische ontsteking bij UC, bijvoorbeeld, is het belangrijk om te onderzoeken hoe goed een therapeutisch middel beschermt tegen verhoogde permeabiliteit4. Dit is slechts één voorbeeld, maar de FITC-dextran assay is een toegankelijke en kwantificeerbare manier om de darmpermeabiliteit te meten in veel verschillende gebieden en aspecten van onderzoek.

De darmbarrière speelt een belangrijke rol bij zowel gezondheid als ziekte. Het vereist een complexe balans tussen het laten doordringen van de benodigde voedingsstoffen in de circulatie van het darmlumen en tegelijkertijd het voorkomen van de penetratie van pro-inflammatoire moleculen, zoals pathogenen of antigenen1. Verhoogde permeabiliteit kan worden veroorzaakt door vele gastro-intestinale stoornissen, zoals leverziekte of inflammatoire darmziekten (IBD's)2,3. Bijvoorbeeld, bij colitis ulcerosa (UC), een IBD, leidt chronische ontsteking tot de afbraak van tight junctions, de daaropvolgende verstoring van de darmbarrière en de translocatie van bacteriën, waardoor mogelijk mucosale en systemische ontsteking wordt bestendigd4.
Integriteit van de darmbarrière is daarom een belangrijke marker voor de darmgezondheid. De huidige methoden voor het meten van de darmdoorlaatbaarheid hebben echter veel beperkingen. Methoden die plasma-ontstekingsmarkers of bacteriële translocatie naar de milt en lymfeklieren meten, zijn bijvoorbeeld indirect 5,6. Andere methoden kunnen invasief en tijdsintensief zijn. Dit artikel beschrijft een niet-invasieve en kosteneffectieve test die direct en kwantitatief de darmpermeabiliteit meet. Deze test maakt gebruik van fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran (FITC-dextran) om de darmpermeabiliteit in realtime te volgen door fluorescentie in vivo te meten. Bovendien kwantificeert het meten van FITC-dextranniveaus in het plasma en de ontlasting de darmpermeabiliteit (figuur 1).
De FITC-dextran permeabiliteitstest is eerder gebruikt in veel verschillende contexten, waaronder in diermodellen van de ziekte van Parkinson7, sepsis8, ischemische beroerte9 en brandwond10. Bovendien is deze test onlangs gebruikt om te helpen begrijpen hoe het darmmicrobioom betrokken kan zijn bij verschillende ziekteprocessen en hoe het kan worden gericht of gemanipuleerd als een potentieel therapeutisch middel. Het is bijvoorbeeld gebruikt om het microbioom en op het microbioom gebaseerde therapieën te bestuderen bij veroudering 11, IBD's12, colorectale kanker13 en autismespectrumstoornis11. Omdat de darmbarrièrefunctie betrokken is bij tal van aspecten van gezondheid en ziekte, is deze test op grote schaal gebruikt. De relatieve eenvoud en lage tijdsbelasting maken het ideaal voor het testen van de in vivo omstandigheden waarvan wordt vermoed dat ze de integriteit van de darmbarrière veranderen. De kwantitatieve resultaten zijn nuttig voor het bepalen van de effectiviteit van een mogelijke behandeling.
In deze studie werd het effect van voeding op de darmbarrièrefunctie geëvalueerd met behulp van de FITC-dextran-test. De intestinale permeabiliteit van muizen die een controledieet kregen en de intestinale permeabiliteit van muizen die een inuline-aangevuld dieet kregen, werden vergeleken. Inuline is een gunstig oligosacharide waarvan is aangetoond dat het de darmbarrièrefunctie verbetert12,13. Voor in vivo fluorescentiemetingen (achtergrond) werd één extra onbehandelde muis gebruikt als negatieve controle en kreeg PBS in plaats van FITC-dextran. Dit experiment toont aan dat de FITC-dextran assay een waardevol hulpmiddel is voor het evalueren van de intestinale permeabiliteit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

Integriteit van de darmbarrière is een kenmerk van de darmgezondheid. Terwijl de integriteit van de darmbarrière kan worden beoordeeld met behulp van indirecte markers zoals de meting van plasma-ontstekingsmarkers en bacteriële translocatie naar de milt en lymfeklieren, kwantificeert de gouden standaard direct het vermogen van geselecteerde moleculen om de darmslijmvlieslaag te doorkruisen naar systemische circulatie. Dit artikel maakt gebruik van een niet-invasieve, kosteneffectieve en low-burden techniek om de intestinale permeabiliteit bij muizen te kwantificeren en in realtime te volgen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran (FITC-dextran). Voorafgaand aan orale suppletie met FITC-dextran zijn de muizen nuchter. Vervolgens worden ze voorzien van FITC-dextran verdund in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Een uur na de maagsonde worden de muizen onderworpen aan algemene anesthesie met behulp van isofluraan en wordt de in vivo fluorescentie gevisualiseerd in een beeldvormingskamer. Deze techniek is gericht op het beoordelen van restfluorescentie in de buikholte en de leveropname, wat wijst op portale migratie van de fluorescerende sonde. Bloed- en ontlastingsmonsters worden 4 uur na orale maagsonde verzameld en de muizen worden geofferd. Plasma- en fecale monsters verdund in PBS worden vervolgens verguld en de fluorescentie wordt geregistreerd. De concentratie van FITC-dextran wordt vervolgens berekend met behulp van een standaardcurve. In eerder onderzoek heeft in vivo beeldvorming aangetoond dat fluorescentie zich snel naar de lever verspreidt bij muizen met een zwakkere darmbarrière veroorzaakt door een vezelarm dieet, terwijl bij muizen aangevuld met vezels om de darmbarrière te versterken, het fluorescerende signaal meestal in het maagdarmkanaal wordt vastgehouden. Bovendien hadden controlemuizen in deze studie verhoogde plasmafluorescentie en verminderde fluorescentie in de ontlasting, terwijl omgekeerd aan inuline aangevulde muizen hogere niveaus van fluorescentiesignalen in de darm en lage niveaus in het plasma hadden. Samenvattend biedt dit protocol kwalitatieve en kwantitatieve metingen van intestinale permeabiliteit als een marker voor darmgezondheid.

De analyse van de in vivo fluorescentie toonde aan dat muizen die alleen het controledieet kregen een hogere leverinname van FITC-dextrans en hogere niveaus van restfluorescentie in de buikholte hadden in vergelijking met de muizen die het met inuline aangevulde dieet kregen (figuur 2A). Enige fluorescentie was zichtbaar in het caecum van de muizen die het inulinedieet kregen, maar er was weinig tot geen leverinname, wat aangeeft dat deze diëten beschermden tegen verhoogde darmdoorlaatbaarheid.
De fluorescentieniveaus in plasma- en fecale monsters werken om hun in vivo tegenhangers te versterken en te kwantificeren. De muizen die het met inuline aangevulde dieet kregen, hadden significant lagere niveaus van FITC-dextran in hun plasma in vergelijking met de muizen die alleen het controledieet kregen (figuur 2B). Dit geeft aan dat ze de darmbarrièrefunctie hadden verbeterd omdat minder FITC-dextran de darmbarrière in de bloedsomloop kon doordringen. Overeenstemmend hadden de muizen die het inulinedieet kregen significant hogere niveaus van FITC-dextran in hun ontlasting dan de muizen die alleen het controledieet kregen (figuur 2C). Dit versterkt dat ze een intacte darmbarrièrefunctie hadden, omdat de FITC-dextran in de dikke darm bleef tot uitscheiding, zoals als normaal wordt beschouwd. De lagere niveaus van FITC-dextran in de ontlasting van de controlemuizen geven aan dat het door de darmbarrière in de bloedsomloop is doorgedrongen in plaats van op de juiste manier te worden uitgescheiden. De hoge niveaus van FITC-dextran in het plasma versterken deze bevinding.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Figuur 2: Voedingssuppletie met inuline vermindert de translocatie van FITC-dextran door de darmbarrière . (A) De resterende fluorescentie en leveropname van FITC-dextran. Rood = hoogste intensiteit; donkerpaars = laagste intensiteit. Maximale fluorescentie van 2,15 x 103, minimale fluorescentie van 0,378. (B) De plasmatische concentratie van FITC-dextran. P = 0,010. (C) De fecale concentratie van FITC-dextran. P = 0,00003. N = 4 per groep. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één muis. De t-toets van de ongepaarde student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.

Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Deze methode helpt bij het beantwoorden van vragen over de vraag of een aandoening de integriteit van de darmbarrière verandert of vragen of een mogelijke behandeling de integriteit van de darmbarrière kan behouden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een niet-invasieve, low-burden techniek biedt om de darmpermeabiliteit in vivo te evalueren en te kwantificeren. Om te beginnen, versnel de muizen gedurende vier uur en dien vervolgens 200 microliter van de FITC-dextran suspensie toe via orale maagsonde aan elke muis met behulp van een 38 millimeter 22 gauge gesteriliseerde gebogen maagsonde naald.Start een timer na de eerste maagsonde en wacht vijf tot 10 minuten tussen elke maagsonde om in vivo metingen mogelijk te maken, waarbij een uur na de maagsonde wordt gehandhaafd. Houd de resterende FITC-dextran-ophanging voor de standaardcurve. Start het apparaat en de software door op de startknop te klikken en ingedrukt te houden en het systeem op te warmen.Klik op Apparaatstatus en zorg ervoor dat alle geconfigureerde apparaten OK weergeven voordat u doorgaat. Klik vervolgens op Nieuwe studie en sla het bestand op met de gewenste naam. Klik vervolgens op Studieopties.Voer de monster-ID in en kies de juiste laser en experimenteer. Verwijder vervolgens de vacht uit de buikstreek met behulp van een elektrisch scheerapparaat en breng veterinaire zalf royaal aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Open de beeldkamer en plaats het dier dorsaal op de scanplaat.Zet vervolgens de ledematen en staart vast met tape. Selecteer vervolgens het gebied dat moet worden gescand met het gereedschap Tekenen. Zorg ervoor dat u de hele breedte van de buik van net boven de lever tot het rectum opneemt.Klik vervolgens op de tool Wijzigen om het gebied aan te passen zodra het is getekend. Stel de scanresolutie in op 2,0 millimeter en klik op Start om de scan te starten. Open vervolgens de afbeeldingsbestanden door ze te vinden onder de gekozen bestandsnaam en open tegelijkertijd alle bestanden met gesynchroniseerde instellingen.Gebruik de werkbalk Afbeelding synchroniseren en Schalen synchroniseren om de afbeeldingsinstellingen te synchroniseren voor een nauwkeurige vergelijking. Sla vervolgens de afbeeldingen op met de aangepaste schalen. Vergelijk de buikfluorescentie van elk dier en de controlemuis op uniform geschaalde beelden met behulp van software die is gekoppeld aan het beeldvormingssysteem.Verzamel een fecale pellet van elke muis in een steriele buis vier uur na de maagd. Houd de buizen vervolgens op ijs en plaats ze in het donker. Centrifugeer vervolgens de bloedmonsters op 9, 390 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Breng het plasma vervolgens over naar een nieuwe steriele buis en houd het in het donker op ijs. Verdun 50 milligram fecale monsters in 200 microliter PBS en verdun het plasma met PBS in een verhouding van één tot twee. Plaat 100 microliter monsters en standaarden in een ondoorzichtige zwarte 96-well plaat.Lees de fluorescentie op een fluorescerende plaatlezer met excitatie op 485 nanometer en absorptie op 530 nanometer. Bepaal ten slotte de concentratie van FITC-dextran per monster door de fluorescentie te vergelijken met de bekende concentraties van de standaardcurve. De analyse van de in vivo fluorescentie toonde aan dat muizen die alleen het controledieet kregen een hogere leverinname van FITC-dextran en hogere niveaus van restfluorescentie in de buikholte hadden in vergelijking met de muizen die het met inuline aangevulde dieet kregen.De muizen die het met inuline aangevulde dieet kregen, hadden significant lagere niveaus van FITC-dextran in hun plasma in vergelijking met de muizen die alleen het controledieet kregen. Concluderend hadden de muizen die het inulinedieet kregen significant hogere niveaus van FITC-dextran in hun ontlasting dan de muizen die alleen het controledieet kregen. De lagere niveaus van FITC-dextran in de ontlasting van de gecontroleerde muizen geven aan dat het door de darmbarrière in de bloedsomloop is doorgedrongen in plaats van op de juiste manier te worden uitgescheiden.De hoge niveaus van FITC-dextran in het plasma versterkten deze bevinding. Timing is essentieel bij het proberen van deze procedure. Fluorescentiemeting en monsterverzameling moeten zo dicht mogelijk bij één uur en vier uur na de maagsonde voor elke individuele muis plaatsvinden.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Murine Colitis Modeling met dextraansulfaat Natrium (DSS)

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Een Protocol voor het gebruik van Gene ingesteld verrijking analyse om te identificeren van de juiste diermodel voor translationeel onderzoek

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Een methode om bacterie-cineffecten op de Gut Microbiota van Muizen te beoordelen

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Beoordeling van de metabole effecten van isocaloric 2:1 intermitterende vasten bij muizen

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...