Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (sovvenzione RGPIN-2018-06442 a MMS). Ringraziamo la struttura per animali presso il CRCHUM e il Dr. Junzheng Peng della Cardiovascular Phenotyping Platform.

Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida del Canadian Council on Animal Care dopo l'approvazione da parte del Comitato istituzionale per la cura degli animali del CRCHUM. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina BALB/c di otto settimane, ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Gli animali hanno ricevuto un'integrazione alimentare con il 10% di inulina in peso / peso per 2 settimane. Un gruppo di controllo ha ricevuto una dieta simile priva del supplemento di inulina. I topi avevano accesso ad libitum alla dieta. Una panoramica del test è mostrata nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Figura 1: Schema del saggio FITC-destrano. T-4- 4 ore prima della gavage, l'accesso al cibo è stato rimosso. T0- FITC-destrano è stato somministrato tramite sonda gastrica orale. T1 - 1 h post gavage, è stata valutata la fluorescenza in vivo . T4- 4 h dopo il gavage, sono stati raccolti i campioni fecali e di plasma ed è stata misurata la fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
1. Somministrazione del CICT-destrano
<ol><li>Prima di somministrare FITC-destrano, digiunare i topi per 4 ore mantenendo l'accesso ad libitum all'acqua. NOTA: Il digiuno deve preferibilmente essere iniziato all'inizio del ciclo di luce (al mattino). I topi possono essere trasferiti in una nuova gabbia senza lettiera durante il digiuno per limitare la coprofagia.</li>
	<li>Preparare 200 μL di 80 mg·mL−1 4 kDa FITC-destrano (vedi tabella dei materiali) diluiti in soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x (PBS) (per topo). Preparare i campioni appena prima della somministrazione e tenerli al riparo dalla luce.</li>
	<li>Somministrare 200 μL della sospensione FITC-destrano tramite sonda orale a ciascun topo utilizzando un ago da 38 mm e 22 G sterilizzato con sonda curva sterilizzata da 22 G con punta a forma di sfera o pera (vedere Tabella dei materiali). Avviare un timer dopo il primo gavage e attendere 5-10 minuti prima di gavagare il mouse successivo per consentire misurazioni in vivo (passaggio 2), mantenendo sempre 1 h post gavage. Mantenere le restanti sospensioni FITC-destrano per la curva standard. NOTA: Immediatamente dopo il gavage, il cibo può essere sostituito per garantire la formazione di feci.</li>
</ol>2. Misurazione della fluorescenza in vivo
<ol><li>Anestetizzare i topi 1 ora dopo il gavage usando isoflurano al 2,5% o un anestetico alternativo. Confermare che l'animale sia adeguatamente anestetizzato pizzicando la punta o la coda e assicurandosi che l'animale non reagisca.<ol><li>Rimuovere la pelliccia dalla zona addominale usando un rasoio elettrico e applicare generosamente un unguento lubrificante oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione. Quindi, posizionare i topi individualmente nella camera di imaging sdraiata dorsalmente. NOTA: deve essere incluso un mouse di controllo che riceve PBS o soluzione salina anziché FITC-destrano per tenere conto dello sfondo durante l'imaging in vivo .</li>
	</ol></li>
	<li>Immagina i topi usando una camera di imaging a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali). Acquisire immagini della regione addominale, impostando la lunghezza del laser a 470 nm e la risoluzione a 2,0 mm.<ol><li>Avviare la macchina e il software facendo clic e tenendo premuto il pulsante di avvio . Lasciare che il sistema si riscaldi. NOTA: il sistema potrebbe richiedere 20 minuti o più per riscaldarsi, quindi la macchina deve essere avviata presto in modo da non interferire con l'imaging dei topi a 1 ora dopo il gavage.</li>
		<li>Fare clic su Stato dispositivo e assicurarsi che tutti i dispositivi configurati mostrino "OK" prima di procedere.</li>
		<li>Se necessario, riscaldare il laser appropriato facendo clic su Controllo laser e quindi facendo clic sul pulsante Nome laser del laser desiderato.</li>
		<li>Inizia un nuovo studio facendo clic su Nuovo studio. Salva sotto il file appropriato con il nome desiderato.</li>
		<li>Fare clic su Opzioni di studio, quindi immettere l'ID del campione, scegliere il laser corretto ed esperire.</li>
		<li>Aprire la camera di imaging e posizionare l'animale dorsalmente sulla piastra di scansione. Fissare gli arti e la coda con del nastro adesivo e assicurarsi che il naso e la bocca si adattino perfettamente al tubo dell'anestesia, mantenendo il 2,5% di isoflurano.</li>
		<li>Regolare l'altezza della piastra di scansione in modo che la regione di scansione sia leggermente ventrale rispetto alla linea mediana dell'animale. Regolare la piastra ruotando la manopola di regolazione all'interno della camera di imaging. Chiudere e bloccare lo sportello della camera di imaging.</li>
		<li>Selezionare l'area da sottoporre a scansione utilizzando lo strumento Disegno . Includere l'intera larghezza dell'addome da appena sopra il fegato al retto. Fare clic sullo strumento Modifica per regolare l'area una volta disegnata.</li>
		<li>Impostare la risoluzione di scansione su 2,0 mm, quindi fare clic su Avanti. Una volta completata l'automazione dell'alimentazione, assicurati che le impostazioni siano corrette e apporta le modifiche necessarie. Fare clic su Start per iniziare la scansione.</li>
		<li>Una volta completata la scansione, rimuovere l'animale dalla camera di imaging e metterlo in un'incubatrice per mantenere la temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia.</li>
		<li>Fare clic su Continua lo studio per mantenere le impostazioni, quindi ripetere i passaggi 2.2.5-2.2.10 fino a quando tutti i topi sono stati scansionati.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante di accensione e tenerlo premuto per 3 secondi per spegnere la camera di imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutare la fluorescenza confrontando la fluorescenza addominale di ciascun animale e del mouse di controllo su immagini in scala uniforme utilizzando un software associato al sistema di imaging utilizzato (vedi Tabella dei materiali).<ol><li>Aprire i file di immagine trovandoli sotto il nome del file scelto. Apri tutti i file che hanno impostazioni sincronizzate contemporaneamente.</li>
		<li>Utilizzando la barra degli strumenti delle impostazioni dell'immagine, utilizzare i pulsanti Sincronizza immagine e Sincronizza scala per sincronizzare le impostazioni delle immagini, consentendo un confronto accurato.</li>
		<li>Salva le immagini con le loro scale regolate.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Misurazione della fluorescenza in campioni fecali e plasma
<ol><li>Raccogliere un pellet fecale da ciascun topo in un tubo sterile 4 ore dopo la sonda gastrica. Tenere i tubi al buio sul ghiaccio.</li>
	<li>Anestetizzare i topi tramite iniezione intraperitoneale di 240 mg/ml di pentobarbital sodico (diluizione, 1:100; vedere Tabella dei materiali). Somministrare alla dose di 0,03 ml/g di peso corporeo.<ol><li>Raccogliere campioni di sangue di almeno 700 μL in una provetta fatta per la raccolta del plasma contenente eparina o EDTA per prevenire la coagulazione (vedi Tabella dei materiali) inserendo un tubo capillare di vetro nel plesso retroorbitale14. NOTA: I metodi alternativi per la raccolta del sangue includono la puntura cardiaca o il ritiro dalla vena caudale. Poiché si tratta di una procedura terminale, i topi devono essere eutanizzati tramite dislocazione cervicale o un metodo umano alternativo. Seguire le raccomandazioni del comitato etico animale locale per l'eutanasia.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugare i campioni di sangue a 9.390 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il plasma in un nuovo tubo sterile e tenerlo al buio sul ghiaccio.</li>
	<li>Diluire 50 mg di campioni fecali in 200 μL di 1x PBS e diluire il plasma 1:2 con 1x PBS. Il rapporto di diluizione può essere modificato in base all'intensità del segnale di fluorescenza.</li>
	<li>Generare una curva standard utilizzando diluizioni seriali di destrano FITC in 1x PBS. A partire dalla massima concentrazione di 20 mg·mL−1 di FITC destrano, diluire di un fattore di 1:1 serialmente 7-10 volte. NOTA: Le concentrazioni, quindi, devono essere 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2,5 mg·mL−1, 1,25 mg·mL−1, 0,625 mg·mL−1, 0,3125 mg·mL−1, ecc.</li>
	<li>Campioni e standard di piastra da 100 μL in una piastra nera opaca a 96 pozzetti. Includi uno spazio vuoto PBS. Leggere la fluorescenza su un lettore di piastre fluorescenti (vedi Tabella dei Materiali) con l'assorbimento a 530 nm e l'eccitazione a 485 nm. NOTA: I campioni e gli standard possono essere placcati in duplice o triplice copia, quindi i loro valori di fluorescenza vengono mediati.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di destrano FITC per campione confrontando la fluorescenza con le concentrazioni note della curva standard. Nei campioni, moltiplicare la concentrazione per il fattore di diluizione (fase 3.5).</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere rivelazioni.

La funzione di barriera intestinale è parte integrante di molti processi patologici diversi. Pertanto, valutare la permeabilità intestinale in modo non invasivo, economico e quantificabile è essenziale per rappresentare accuratamente queste malattie in modelli animali. Il saggio FITC-dextran offre la possibilità di questa rappresentazione. Tuttavia, questo protocollo comporta diversi passaggi critici che devono essere completati con precisione per ottenere risultati affidabili. In primo luogo, è essenziale garantire l'uso di un destrano FITC di dimensioni adeguate. Per esaminare la permeabilità in vivo , 4 kDa FITC-destrano è il peso molecolare ottimale e, all'aumentare del peso molecolare, la permeabilità diminuiscedi 15. Pertanto, l'uso di FITC-destrano di un peso molecolare diverso può fornire risultati confusi o inaffidabili. Inoltre, è importante annotare il tempo di ciascun gavage e regolare di conseguenza i punti temporali per la raccolta di dati in vivo e la raccolta di plasma e feci. Ad esempio, se due topi vengono gavagati a 10 minuti di distanza, anche le letture di fluorescenza in vivo e la raccolta di feci e plasma devono avvenire a 10 minuti di distanza. Il confronto della fluorescenza negli stessi punti temporali consente una rappresentazione più accurata delle differenze di permeabilità. Inoltre, l'ordine in cui gli animali di gruppi diversi sono sottoposti a test dovrebbe essere alternato per evitare un effetto di raggruppamento dovuto alla tempistica. Invece di testare prima tutti gli animali del gruppo A, poi tutti gli animali del secondo gruppo B (AAABBB), si raccomanda di cambiare gruppo dopo ogni animale (ABABAB).
Questo test può essere modificato per includere solo la valutazione di campioni di plasma e fecali se vi è una mancanza di accesso a una macchina di imaging. Sebbene l'imaging a fluorescenza diretta in vivo consenta la visualizzazione dell'assunzione epatica e della fluorescenza addominale residua, la valutazione della fluorescenza nei campioni plasmatici e fecali fornisce comunque una misurazione quantitativa della permeabilità intestinale. Inoltre, come dimostrato dall'esperimento descritto, i livelli di fluorescenza nel plasma e nelle feci si correlano bene con l'imaging in vivo . Inoltre, questo test può essere modificato per includere solo l'imaging in vivo . Ciò consente agli animali di essere mantenuti in vita per continuare a testare altri parametri o monitorare come cambia la permeabilità intestinale nel tempo. La possibilità di modificare questo test, quindi, lo rende accessibile, ma ancora quantitativo. Infine, il dosaggio di 200 μL di 80 mg·mL−1 FITC-destrano somministrato a ciascun topo è stato utilizzato in precedenza e si è dimostrato efficace nei topi con piccole differenze nel peso corporeo16. Inoltre, è importante notare che tutti i topi utilizzati nella sezione dei risultati rappresentativi pesavano circa 20 g, consentendo di utilizzare lo stesso dosaggio per ciascun topo. Per tenere conto delle differenze di peso corporeo, tuttavia, il FITC-destrano può essere somministrato alla dose di 0,6-0,8 mg/g di peso corporeo, ad esempio17. Fondamentalmente, indipendentemente dal dosaggio utilizzato, è importante limitare la quantità di gavag a ciascun topo a meno di 10 mL·kg−1 per prevenire complicazioni o disagi18.
Sebbene il test FITC-destrano fornisca un metodo efficace per valutare la funzione della barriera intestinale, ha ancora alcune limitazioni. Una limitazione di questo modello è che richiede il digiuno dei topi per diverse ore, il che significa che non è affidabile confrontare questi risultati con quelli dei topi che non sono stati digiunati. Inoltre, il digiuno può influenzare i risultati in alcuni modelli che richiedono programmi di alimentazione rigorosi, come quando si misura la glicemia in modelli animali per il diabete.
Nonostante queste limitazioni, il test FITC-destrano rimane un metodo efficace per analizzare la permeabilità intestinale in quanto è quantitativo, versatile, economico e meno invasivo di molti metodi classici. Ad esempio, le sonde comuni utilizzate per misurare la permeabilità intestinale sono piccole sonde saccaridiche o Cr-EDTA, che presentano alcuni vantaggi19. Tuttavia, alcune sonde saccaridiche hanno solo permeabilità specifica della regione. Poiché sono idrolizzati nella porzione distale dell'intestino tenue, non forniscono alcuna informazione sulla permeabilità del colon19. D'altra parte, Cr-EDTA può fornire informazioni sulla permeabilità del colon, ma richiede misurazioni per 24 ore, rendendo il carico di tempo di questo metodo molto più elevato di quello del saggio FITC-destrano20. Inoltre, nessuno di questi metodi fornisce l'imaging diretto in vivo di questo test. Pertanto, il test FITC-destrano fornisce un'opzione relativamente semplice, diretta ed efficace rispetto ai metodi alternativi per misurare la permeabilità intestinale.
Infine, nei processi patologici come IBD4, Alzheimer21 e malattia epatica2, la permeabilità intestinale è un parametro importante che potrebbe essere misurato utilizzando il test FITC-destrano per migliorare gli studi. Ad esempio, nello sviluppo di nuovi trattamenti, come le immunoterapie per le IBD, questo test può essere utilizzato per testare l'efficacia della terapia per mantenere l'integrità della barriera intestinale. Considerando che la compromissione della funzione della barriera intestinale può essere implicata nel perpetuare l'infiammazione cronica nella UC, ad esempio,è importante esaminare quanto bene una terapia protegga dall'aumento della permeabilità 4. Questo è solo un esempio, ma il test FITC-destrano è un modo accessibile e quantificabile per misurare la permeabilità intestinale in molte aree e aspetti diversi della ricerca.

La barriera intestinale svolge un ruolo importante sia nella salute che nella malattia. Richiede un complesso equilibrio tra consentire ai nutrienti necessari di permeare nella circolazione dal lume intestinale e contemporaneamente impedire la penetrazione di molecole pro-infiammatorie, come agenti patogeni o antigeni1. L'aumento della permeabilità può essere causato da molti disturbi gastrointestinali, come malattie del fegato o malattie infiammatorie intestinali (IBD)2,3. Ad esempio, nella colite ulcerosa (UC), una IBD, l'infiammazione cronica porta alla rottura delle giunzioni strette, alla successiva rottura della barriera intestinale e alla traslocazione dei batteri, potenzialmente perpetuando l'infiammazione mucosa e sistemica4.
L'integrità della barriera intestinale è, quindi, un importante indicatore della salute dell'intestino. Tuttavia, i metodi attuali per la misurazione della permeabilità intestinale hanno molte limitazioni. Ad esempio, i metodi che misurano i marcatori infiammatori plasmatici o la traslocazione batterica alla milza e ai linfonodi sono indiretti 5,6. Altri metodi possono essere invasivi e richiedere molto tempo. Questo articolo descrive un test non invasivo ed economico che misura direttamente e quantitativamente la permeabilità intestinale. Questo test utilizza destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC-destrano) per seguire la permeabilità intestinale in tempo reale misurando la fluorescenza in vivo. Inoltre, la misurazione dei livelli di destrano FITC nel plasma e nelle feci quantifica la permeabilità intestinale (Figura 1).
Il test di permeabilità FITC-destrano è stato utilizzato in precedenza in molti contesti diversi, inclusi modelli animali di malattia di Parkinson7, sepsi8, ictus ischemico9 e lesioni da ustione10. Inoltre, questo test è stato utilizzato di recente per aiutare a capire come il microbioma intestinale può essere implicato in diversi processi patologici e come può essere mirato o manipolato come potenziale terapeutico. Ad esempio, è stato utilizzato per studiare il microbioma e le terapie basate sul microbioma nell'età di 11, IBD 12, cancro del colon-retto13 e disturbo dello spettro autistico11. Poiché la funzione della barriera intestinale è implicata in numerosi aspetti della salute e della malattia, questo test è stato ampiamente utilizzato. La sua relativa semplicità e il basso carico di tempo lo rendono ideale per testare le condizioni in vivo sospettate di alterare l'integrità della barriera intestinale. I suoi risultati quantitativi sono utili per determinare l'efficacia di un potenziale trattamento.
In questo studio, l'effetto della dieta sulla funzione della barriera intestinale è stato valutato utilizzando il test FITC-destrano. Sono state confrontate la permeabilità intestinale dei topi che ricevono una dieta di controllo e la permeabilità intestinale dei topi che ricevono una dieta integrata con inulina. L'inulina è un oligosaccaride benefico che ha dimostrato di migliorare la funzione della barriera intestinale12,13. Per le misurazioni di fluorescenza in vivo (background), un altro topo non trattato è stato utilizzato come controllo negativo e ha ricevuto PBS invece di FITC-destrano. Questo esperimento dimostra che il test FITC-destrano è uno strumento prezioso per valutare la permeabilità intestinale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

L'integrità della barriera intestinale è un segno distintivo della salute intestinale. Mentre l'integrità della barriera intestinale può essere valutata utilizzando marcatori indiretti come la misurazione dei marcatori infiammatori plasmatici e la traslocazione batterica alla milza e ai linfonodi, il gold standard quantifica direttamente la capacità di molecole selezionate di attraversare lo strato mucoso intestinale verso la circolazione sistemica. Questo articolo utilizza una tecnica non invasiva, economica e a basso carico per quantificare e seguire in tempo reale la permeabilità intestinale nei topi utilizzando destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC-destrano). Prima dell'integrazione orale con FITC-destrano, i topi vengono digiunati. Vengono quindi gavagati con destrano FITC diluito in soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Un'ora dopo il gavage, i topi vengono sottoposti ad anestesia generale utilizzando isoflurano e la fluorescenza in vivo viene visualizzata in una camera di imaging. Questa tecnica mira a valutare la fluorescenza residua nella cavità addominale e l'assorbimento epatico, che è suggestivo della migrazione portale della sonda fluorescente. I campioni di sangue e feci vengono raccolti 4 ore dopo il gavage orale e i topi vengono sacrificati. I campioni di plasma e feci diluiti in PBS vengono quindi placcati e la fluorescenza viene registrata. La concentrazione di FITC-destrano viene quindi calcolata utilizzando una curva standard. In ricerche precedenti, l'imaging in vivo ha dimostrato che la fluorescenza si diffonde rapidamente al fegato nei topi con una barriera intestinale più debole indotta da una dieta povera di fibre, mentre nei topi integrati con fibre per rafforzare la barriera intestinale, il segnale fluorescente viene mantenuto principalmente nel tratto gastrointestinale. Inoltre, in questo studio, i topi di controllo avevano un'elevata fluorescenza plasmatica e una ridotta fluorescenza nelle feci, mentre inversamente, i topi integrati con inulina avevano livelli più elevati di segnali di fluorescenza nell'intestino e bassi livelli nel plasma. In sintesi, questo protocollo fornisce misurazioni qualitative e quantitative della permeabilità intestinale come marker per la salute dell'intestino.

L'analisi della fluorescenza in vivo ha mostrato che i topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo avevano un apporto epatico più elevato di destrano FITC e livelli più elevati di fluorescenza residua nella cavità addominale rispetto ai topi che hanno ricevuto la dieta integrata con inulina (Figura 2A). Una certa fluorescenza era visibile nel cieco dei topi che hanno ricevuto la dieta dell'inulina, ma c'era poca o nessuna assunzione epatica, indicando che queste diete proteggevano dall'aumento della permeabilità intestinale.
I livelli di fluorescenza nei campioni plasmatici e fecali lavorano per rafforzare e quantificare le loro controparti in vivo . I topi che hanno ricevuto la dieta integrata con inulina avevano livelli significativamente più bassi di destrano FITC nel loro plasma rispetto ai topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo (Figura 2B). Ciò indica che avevano migliorato la funzione della barriera intestinale perché meno destrano FITC poteva permeare la barriera intestinale nella circolazione. Concordemente, i topi che hanno ricevuto la dieta a base di inulina avevano livelli significativamente più alti di destrano FITC nelle loro feci rispetto ai topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo (Figura 2C). Ciò rafforza il fatto che avevano una funzione di barriera intestinale intatta poiché il destrano FITC rimaneva nel colon fino all'escrezione, come è considerato normale. I livelli più bassi di destrano FITC nelle feci dei topi di controllo indicano che è permeato attraverso la barriera intestinale nella circolazione piuttosto che essere opportunamente escreto. Gli alti livelli di FITC-destrano nel plasma rafforzano questo risultato.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Figura 2: L'integrazione alimentare con inulina diminuisce la traslocazione del destrano FITC attraverso la barriera intestinale . (A) La fluorescenza residua e l'assorbimento epatico di FITC-destrano. Rosso = massima intensità; viola scuro = intensità più bassa. Fluorescenza massima di 2,15 x 103, fluorescenza minima di 0,378. (B) La concentrazione plasmatica di FITC-destrano. P = 0,010. (C) La concentrazione fecale di FITC-destrano. P = 0,00003. N = 4 per gruppo. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Ogni punto rappresenta un mouse. Test t dello studente spaiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Nel presente studio, il destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) viene somministrato ai topi tramite sonda gastrica orale per valutare la permeabilità intestinale sia in vivo che in campioni plasmatici e fecali. Poiché la funzione di barriera intestinale è influenzata in molti processi patologici, questo test diretto e quantitativo può essere utilizzato in diverse aree di ricerca.

Valutazione dell'integrità della barriera intestinale nei topi utilizzando destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Questo metodo aiuta a rispondere alle domande sul fatto che una condizione alteri l'integrità della barriera intestinale o domande sul fatto che un potenziale trattamento possa mantenere l'integrità della barriera intestinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre una tecnica non invasiva e a basso carico per valutare e quantificare la permeabilità intestinale in vivo. Per iniziare, digiunare i topi per quattro ore, quindi somministrare 200 microlitri di sospensione FITC-destrano tramite sonda orale a ciascun topo utilizzando un ago da 38 millimetri calibro 22 sterilizzato.Avviare un timer dopo il primo gavage e attendere da cinque a 10 minuti tra ogni gavage per consentire misurazioni in vivo, mantenendo un'ora dopo il gavage. Mantenere le restanti sospensioni FITC-destrano per la curva standard. Avviare la macchina e il software facendo clic e tenendo premuto il pulsante di avvio e consentire al sistema di riscaldarsi.Fare clic su Stato dispositivo e assicurarsi che tutti i dispositivi configurati mostrino OK prima di procedere. Quindi fare clic su Nuovo studio e salvare il file con il nome desiderato. Quindi, fai clic su Opzioni di studio.Inserisci l'ID del campione e scegli il laser corretto e sperimenta. Quindi rimuovere la pelliccia dalla zona addominale usando un rasoio elettrico e applicare generosamente un unguento veterinario sugli occhi per evitare l'essiccazione. Aprire la camera di imaging e posizionare l'animale dorsalmente sulla piastra di scansione.Quindi fissare gli arti e la coda con del nastro adesivo. Quindi, selezionare l'area da scansionare utilizzando lo strumento Disegno. Assicurarsi di includere l'intera larghezza dell'addome da appena sopra il fegato al retto.Quindi fare clic sullo strumento Modifica per regolare l'area una volta disegnata. Impostare la risoluzione di scansione su 2,0 millimetri e fare clic su Start per iniziare la scansione. Quindi, apri i file di immagine trovandoli sotto il nome del file scelto e apri contemporaneamente tutti i file con impostazioni sincronizzate.Utilizzando la barra degli strumenti delle impostazioni immagine, utilizzare i pulsanti Sincronizza immagine e Sincronizza scala per sincronizzare le impostazioni dell'immagine per un confronto accurato. Quindi salvare le immagini con le scale regolate. Confronta la fluorescenza addominale di ciascun animale e del mouse di controllo su immagini in scala uniforme utilizzando il software associato al sistema di imaging.Raccogli un pellet fecale da ciascun topo in un tubo sterile quattro ore dopo il gavage. Quindi tenere i tubi sul ghiaccio e metterli al buio. Quindi, centrifugare i campioni di sangue a 9, 390 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi trasferire il plasma in un nuovo tubo sterile e tenerlo sul ghiaccio al buio. Diluire 50 milligrammi di campioni fecali in 200 microlitri di PBS e diluire il plasma con PBS in un rapporto uno o due. Piastra 100 microlitri campioni e standard in una piastra nera opaca a 96 pozzetti.Leggere la fluorescenza su un lettore di piastre fluorescenti con eccitazione a 485 nanometri e assorbimento a 530 nanometri. Infine, determinare la concentrazione di destrano FITC per campione confrontando la fluorescenza con le concentrazioni note della curva standard. L'analisi della fluorescenza in vivo ha mostrato che i topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo avevano un apporto epatico più elevato di destrano FITC e livelli più elevati di fluorescenza residua nella cavità addominale rispetto ai topi che hanno ricevuto la dieta integrata con inulina.I topi che hanno ricevuto la dieta integrata con inulina avevano livelli significativamente più bassi di destrano FITC nel loro plasma rispetto ai topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo. Concordemente, i topi che hanno ricevuto la dieta dell'inulina avevano livelli significativamente più alti di destrano FITC nelle loro feci rispetto ai topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo. I livelli più bassi di FITC-destrano nelle feci dei topi controllati indicano che permeava attraverso la barriera intestinale nella circolazione piuttosto che essere opportunamente escreto.Gli alti livelli di FITC-destrano nel plasma hanno rafforzato questa scoperta. La tempistica è essenziale quando si tenta questa procedura. La lettura della fluorescenza e la raccolta dei campioni dovrebbero avvenire il più vicino possibile a un'ora e quattro ore dopo la sonda gastrica per ogni singolo topo.

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