Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

이 작업은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(MMS에 RGPIN-2018-06442 부여)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. CRCHUM의 동물 시설과 심혈관 표현형 플랫폼의 Junzheng Peng 박사에게 감사드립니다.

모든 절차는 CRCHUM의 기관 동물 관리 위원회의 승인을 받은 후 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council on Animal Care) 지침에 따라 수행되었습니다. 상업적 공급원( 재료 표 참조)으로부터 입수한 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 본 연구에 사용하였다. 실험실험자들은 2주 동안 10% 이눌린 wt/wt가 함유된 식이 보충제를 받았다. 대조군은 이눌린 보충제가 부족한 유사한 식단을 받았습니다. 생쥐는 식단에 임 의로 접근할 수 있었습니다. 분석의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> 그림 1: FITC-덱스트란 분석의 개략도. 위관영양법 4시간 전에 T-4- 음식물 접근이 제거되었습니다. T0-FITC-덱스트란은 경구 위관영양법을 통해 투여되었다. T1 - 위관영양 1시간 후, 생체내 형광을 평가하였다. T4- 위관영양 4시간 후, 분변 및 혈장 샘플을 수집하고 형광을 측정했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. FITC-덱스트란의 투여
<ol><li>FITC-덱스트란을 투여하기 전에 마우스를 4시간 동안 금식시키면서 물에 대한 임의적 접근을 유지합니다. 참고: 금식은 가급적이면 빛의 주기가 시작될 때(아침에) 시작해야 합니다. 마우스는 coprophagy를 제한하기 위해 금식 중에 침구없이 새로운 케이지로 옮겨 질 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석한 80mg·mL-1 4kDa FITC-덱스트란( 재료 표 참조) 200μL(마우스당)를 준비합니다. 투여 직전에 샘플을 신선하게 준비하고 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>공 또는 배 모양의 팁이 있는 38mm 22G 멸균된 곡선형 위관영양관 바늘을 사용하여 각 마우스에 경구 위관영양법을 통해 200μL의 FITC-덱스트란 현탁액을 투여합니다( 재료 표 참조). 첫 번째 위관 관찰 후 타이머를 시작하고 생체 내 측정(2단계)을 허용하기 위해 다음 마우스를 위관하기 전에 5-10분 동안 기다렸다가 항상 위관영양 후 1시간을 유지합니다. 표준 곡선에 대한 나머지 FITC-dextran 현탁액을 유지합니다. 참고: 위관영양 수술 직후, 대변 형성을 보장하기 위해 음식을 교체할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 생체 내 형광 측정
<ol><li>위관 관찰 후 1시간 후에 2.5% 이소플루란 또는 대체 마취제를 사용하여 마우스를 마취합니다. 발가락이나 꼬리를 꼬집고 동물이 반응하지 않도록 하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인합니다.<ol><li>전기 면도기를 사용하여 복부에서 털을 제거하고 건조를 방지하기 위해 안과 용 윤활 연고를 눈에 넉넉히 바릅니다. 그런 다음 마우스를 등쪽으로 누워 이미징 챔버에 개별적으로 놓습니다. 참고: 생체 내 이미징 중 배경을 설명하기 위해 FITC-dextran 대신 PBS 또는 식염수를 받는 하나의 대조군 마우스가 포함되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 이미징 챔버를 사용하여 마우스를 이미지화합니다( 재료 표 참조). 레이저 길이를 470nm로, 해상도를 2.0mm로 설정하여 복부 부위의 이미지를 수집합니다.<ol><li>시작 버튼을 길게 클릭하여 기계와 소프트웨어를 시작합니다. 시스템을 예열합니다. 알림: 시스템을 예열하는 데 20분 이상이 필요할 수 있으므로 위관영양 후 1시간에 마우스 이미징을 방해하지 않도록 기계를 일찍 시작해야 합니다.</li>
		<li>Device status(장치 상태)를 클릭하고 계속하기 전에 구성된 모든 장치에 "OK(확인)"가 표시되는지 확인합니다.</li>
		<li>필요한 경우 레이저 제어를 클릭한 다음 원하는 레이저의 레이저 이름 버튼을 클릭하여 적절한 레이저를 예열합니다.</li>
		<li>새 스터디를 클릭하여 새 스터디를 시작합니다. 원하는 이름으로 적절한 파일 아래에 저장합니다.</li>
		<li>연구 옵션을 클릭한 다음 표본 ID를 입력하고 올바른 레이저와 실험을 선택합니다.</li>
		<li>이미징 챔버를 열고 동물을 주사판에 등쪽으로 놓습니다. 팔다리와 꼬리를 테이프로 고정하고 코와 입이 마취관에 꼭 맞는지 확인하고 2.5% 이소플루란을 유지합니다.</li>
		<li>스캐닝 영역이 동물의 정중선에서 약간 복부가 되도록 스캐닝 플레이트의 높이를 조정합니다. 이미징 챔버 내부의 조정 손잡이를 돌려 플레이트를 조정합니다. 이미징 챔버 도어를 닫고 잠급니다.</li>
		<li>그리기 도구를 사용하여 스캔할 영역을 선택합니다. 간 바로 위에서 직장까지의 복부 전체 너비를 포함하십시오. 수정 도구를 클릭하여 그린 영역을 조정합니다.</li>
		<li>스캔 해상도를 2.0mm로 설정하고 다음을 클릭합니다. 전원 자동화가 완료되면 설정이 올바른지 확인하고 필요한 조정을 수행합니다. 시작을 클릭하여 스캔을 시작합니다.</li>
		<li>스캔이 완료되면 이미징 챔버에서 동물을 꺼내 인큐베이터에 넣어 마취에서 회복하는 동안 체온을 유지합니다.</li>
		<li>연구 계속을 클릭하여 설정을 유지한 다음 모든 마우스가 스캔될 때까지 2.2.5-2.2.10단계를 반복합니다.</li>
		<li>전원 버튼을 클릭하고 3초 동안 누르고 있으면 이미징 챔버의 전원이 꺼집니다.</li>
	</ol></li>
	<li>사용된 이미징 시스템과 관련된 소프트웨어를 사용하여 균일하게 스케일링된 이미지에서 각 동물과 대조군 마우스의 복부 형광을 비교하여 형광을 평가합니다( 재료 표 참조).<ol><li>선택한 파일 이름에서 이미지 파일을 찾아 엽니다. 동기화된 설정이 있는 모든 파일을 동시에 엽니다.</li>
		<li>이미지 설정 도구 모음을 사용하여 이미지 동기화 및 배율 동기화 버튼을 사용하여 이미지 설정을 동기화하면 정확한 비교가 가능합니다.</li>
		<li>조정된 배율로 이미지를 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 분변 시료 및 혈장의 형광 측정
<ol><li>위관 영양 검사 후 4시간 후에 멸균 튜브에 각 마우스의 분변 펠릿을 수집합니다. 튜브를 얼음 위의 어둠 속에 보관하십시오.</li>
	<li>240mg/mL 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사 하여 마우스를 마취합니다(희석, 1:100, 재료 표 참조). 0.03mL/g 체중의 용량으로 투여합니다.<ol><li>유리 모세관을 retro-orbital plexus14에 삽입하여 응고를 방지하기 위해 헤파린 또는 EDTA를 함유한 혈장 수집을 위해 만들어진 튜브에서 최소 700μL의 혈액 샘플을 수집합니다(재료 표 참조). 참고: 채혈을 위한 대체 방법에는 심장 천자 또는 꼬리 정맥 철수가 포함됩니다. 이것은 말기 절차이기 때문에 마우스는 자궁 경부 탈구 또는 다른 인도적 방법을 통해 안락사시켜야합니다. 안락사에 대한 지역 동물 윤리 위원회의 권고를 따르십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 9,390 x g 로 원심분리합니다. 혈장을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 얼음 위의 어둠 속에 보관하십시오.</li>
	<li>분변 샘플 50mg을 1x PBS 200μL에 희석하고 혈장을 1x PBS로 1:2로 희석합니다. 희석 비율은 형광 신호의 강도에 따라 변형될 수 있다.</li>
	<li>1x PBS에서 FITC-dextran의 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 최고 농도의 20mg·mL-1 FITC 덱스트란부터 시작하여 1:1로 연속적으로 7-10 배 희석합니다. 참고: 따라서 농도는 20mg·mL-1, 10mg·mL-1, 5mg·mL-1, 2.5mg·mL-1, 1.25mg·mL-1, 0.625mg·mL-1, 0.3125mg·mL-1 등을 읽어야 합니다.</li>
	<li>플레이트 100 μL 샘플 및 표준물질을 불투명한 검은색 96웰 플레이트에 담습니다. PBS 공백을 포함합니다. 형광 플레이트 리더( 재료 표 참조)에서 530nm에서 흡수하고 485nm에서 여기로 형광을 판독합니다. 참고: 샘플과 표준물질은 중복 또는 삼중으로 도금할 수 있으며 형광 값의 평균을 구합니다.</li>
	<li>형광을 표준 곡선의 알려진 농도와 비교하여 샘플당 FITC-dextran의 농도를 결정합니다. 샘플에서 농도에 희석 계수를 곱합니다(단계 3.5).</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개가 없다고 선언합니다.

장 장벽 기능은 다양한 질병 과정에서 없어서는 안될 부분입니다. 따라서 비침습적이고 비용 효율적이며 정량화 가능한 방식으로 장 투과성을 평가하는 것은 동물 모델에서 이러한 질병을 정확하게 나타내는 데 필수적입니다. FITC-덱스트란 분석은 이러한 표현에 대한 가능성을 제공합니다. 그러나 이 프로토콜에는 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 정확하게 완료해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 적절한 크기의 FITC-덱스트란을 사용하는 것이 필수적입니다. 생체 내 투과성을 조사하기 위해서는 4 kDa FITC-dextran이 최적 분자량이며, 분자량이 증가함에 따라 투과율은 감소한다15. 따라서, 상이한 분자량의 FITC-덱스트란을 사용하는 것은 혼란스럽거나 신뢰할 수 없는 결과를 제공할 수 있다. 또한 각 위관영양의 시간을 기록하고 그에 따라 생체 내 데이터 수집 및 혈장 및 대변 수집을 위한 시점을 조정하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 두 마리의 마우스가 10분 간격으로 위관영양되는 경우 생체 내 형광 판독값과 대변 및 혈장 수집도 10분 간격으로 이루어져야 합니다. 동일한 시점에서 형광을 비교하면 투과성의 차이를 보다 정확하게 표현할 수 있습니다. 또한, 타이밍으로 인한 클러스터링 효과를 방지하기 위해 다른 그룹의 동물을 테스트하는 순서를 번갈아 가며 사용해야 합니다. 그룹 A의 모든 동물을 먼저 테스트한 다음 그룹 B의 모든 동물을 두 번째(AAABBB)로 테스트하는 대신 각 동물(ABABAB) 이후에 그룹을 전환하는 것이 좋습니다.
이 분석은 이미징 기계에 대한 접근이 부족한 경우 혈장 및 분변 샘플의 평가만 포함하도록 수정할 수 있습니다. 생체 내 직접 형광 이미징을 통해 간 섭취 및 잔류 복부 형광을 시각화할 수 있지만 혈장 및 대변 샘플의 형광 평가는 여전히 장 투과성의 정량적 측정을 제공합니다. 또한, 기술된 실험에 의해 입증된 바와 같이, 혈장 및 대변의 형광 수준은 생체 내 이미징과 잘 상관관계가 있습니다. 추가적으로, 이러한 분석은 생체 내 이미징만을 포함하도록 변형될 수 있다. 이를 통해 동물을 살아 있게 하여 다른 매개변수를 계속 테스트하거나 시간이 지남에 따라 장 투과성이 어떻게 변하는지 모니터링할 수 있습니다. 따라서 이 분석을 수정할 수 있는 능력은 접근 가능하면서도 여전히 정량적입니다. 마지막으로, 각 마우스에 투여된 80 mg·mL-1 FITC-dextran 200 μL의 용량은 이전에 사용되었으며 체중에 약간의 차이가 있는 마우스에서 효과적인 것으로 나타났다16. 또한, 대표 결과 섹션에 사용된 모든 마우스의 무게는 약 20g이므로 각 마우스에 동일한 용량을 사용할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 체중의 차이를 설명하기 위해 FITC-덱스트란은 0.6-0.8mg/g 체중의 용량으로 투여할 수 있습니다(예:17). 결정적으로, 사용된 용량에 관계없이, 합병증이나 불편함을 예방하기 위해 각 마우스에 위관영양의 양을 10mL·kg-1 미만으로 제한하는 것이 중요하다18.
FITC-덱스트란 분석은 장 장벽 기능을 평가하는 효과적인 방법을 제공하지만 여전히 몇 가지 한계가 있습니다. 이 모델의 한 가지 한계는 몇 시간 동안 마우스를 금식시켜야 한다는 것인데, 이는 이러한 결과를 금식하지 않은 마우스의 결과와 비교하는 것이 신뢰할 수 없다는 것을 의미합니다. 또한 단식은 당뇨병 동물 모델에서 혈당을 측정할 때와 같이 엄격한 수유 일정이 필요한 특정 모델의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
이러한 한계에도 불구하고 FITC-덱스트란 분석은 정량적이고, 다목적이며, 비용 효율적이며, 많은 기존 방법보다 덜 침습적이기 때문에 장 투과성을 분석하는 효과적인 방법으로 남아 있습니다. 예를 들어, 장 투과성 측정에 사용되는 일반적인 프로브는 작은 당류 프로브 또는 Cr-EDTA이며, 이는 몇 가지 장점이 있습니다19. 그러나 일부 당류 프로브는 영역별 투과성만 있습니다. 소장의 말단부에서 가수분해되기 때문에 결장 투과성에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다19. 반면에, Cr-EDTA는 결장 투과성에 대한 정보를 제공할 수 있지만, 24시간 동안 측정이 필요하기 때문에, 이 방법의 시간 부담은 FITC-덱스트란 분석의 시간 부담보다 훨씬 높다20. 또한, 이들 방법 중 어느 것도 이 분석의 직접적인 생체 내 이미징을 제공하지 않습니다. 따라서 FITC-dextran 분석은 장 투과성을 측정하기 위한 다른 방법에 비해 비교적 간단하고 직접적이며 효과적인 옵션을 제공합니다.
마지막으로, IBDs4, 알츠하이머병21 및 간 질환2와 같은 질병 과정에서 장 투과성은 연구를 개선하기 위해 FITC-dextran 분석을 사용하여 측정할 수 있는 중요한 매개변수입니다. 예를 들어, IBD에 대한 면역요법과 같은 신규한 치료법을 개발할 때, 이 분석은 장 장벽 완전성을 유지하기 위한 치료제의 효능을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 장 장벽 기능 장애가 UC의 만성 염증을 영속시키는 것과 관련이 있을 수 있다는 점을 고려할 때, 투과성 증가에 대해 치료제가 얼마나 잘 보호하는지 조사하는 것이 중요합니다4. 이것은 하나의 예일 뿐이지만 FITC-덱스트란 분석은 연구의 다양한 영역과 측면에서 장 투과성을 측정할 수 있는 접근 가능하고 정량화 가능한 방법입니다.

장 장벽은 건강과 질병 모두에 중요한 역할을 합니다. 필요한 영양소가 장 내강에서 순환계로 스며들도록 하는 동시에 병원체나 항원과 같은 염증 유발 분자의 침투를 방지하는 것 사이의 복잡한 균형이 필요합니다1. 투과성 증가는 간 질환이나 염증성 장 질환(IBD)과 같은 많은 위장 장애로 인해 발생할 수 있습니다.2,3. 예를 들어, IBD인 궤양성 대장염(UC)에서 만성 염증은 밀착 접합부의 파괴, 그에 따른 장 장벽의 파괴, 박테리아의 전좌로 이어져 잠재적으로 점막 및 전신 염증을 영속화한다4.
따라서 장 장벽 무결성은 장 건강의 중요한 지표입니다. 그러나, 장내 투과성을 측정하기 위한 현재의 방법은 많은 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 혈장 염증 마커 또는 비장 및 림프절로의 박테리아 전좌를 측정하는 방법은 간접적이다 5,6. 다른 방법은 침습적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 이 기사에서는 장 투과성을 직접적이고 정량적으로 측정하는 비침습적이고 비용 효율적인 분석법에 대해 설명합니다. 이 분석은 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지 덱스트란(FITC-dextran)을 사용하여 생체 내 형광을 측정하여 실시간으로 장 투과성을 추적합니다. 또한 혈장과 대변에서 FITC-덱스트란 수치를 측정하면 장 투과성을 정량화할 수 있습니다(그림 1).
FITC-덱스트란 투과성 분석법은 파킨슨병7, 패혈증8, 허혈성 뇌졸중9, 화상10 등의 동물 모델을 포함하여 다양한 맥락에서 사용되어 왔다. 또한, 이 분석은 최근 장내 미생물군집이 다양한 질병 과정에 어떻게 연루될 수 있는지, 그리고 잠재적인 치료제로 표적화되거나 조작될 수 있는 방법을 이해하는 데 도움이 되었습니다. 예를 들어, 노화 11, IBD12, 대장암 13, 자폐 스펙트럼 장애11에서 마이크로바이옴 및 마이크로바이옴 기반 치료제를 연구하는 데 사용되어 왔다. 장 장벽 기능은 건강과 질병의 다양한 측면과 관련이 있기 때문에 이 분석은 널리 사용되었습니다. 상대적으로 단순하고 시간 부담이 적기 때문에 장 장벽 무결성을 변경하는 것으로 의심되는 생체 내 조건을 테스트하는 데 이상적입니다. 정량적 결과는 잠재적 치료의 효과를 결정하는 데 유용합니다.
본 연구에서는 FITC-덱스트란 분석을 이용하여 식이요법이 장 장벽 기능에 미치는 영향을 평가하였다. 대조군 식이를 투여받은 쥐의 장 투과성과 이눌린 보충 식이를 투여받은 쥐의 장 투과성을 비교하였다. 이눌린은 장 장벽 기능을 개선하는 것으로 밝혀진 유익한 올리고당입니다12,13. 생체 내 형광 측정(배경)을 위해 처리되지 않은 마우스 1마리를 음성 대조군으로 사용하고 FITC-덱스트란 대신 PBS를 받았습니다. 이 실험은 FITC-덱스트란 분석이 장 투과성을 평가하는 데 유용한 도구임을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

장 장벽 무결성은 장 건강의 특징입니다. 장 장벽 무결성은 혈장 염증 마커 측정 및 비장 및 림프절로의 박테리아 전위와 같은 간접 마커를 사용하여 평가할 수 있지만, 골드 스탠더드는 선택된 분자가 장 점막층을 가로질러 전신 순환을 향해 이동하는 능력을 직접 정량화합니다. 이 기사에서는 비침습적이고 비용 효율적이며 부담이 적은 기술을 사용하여 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지 덱스트란(FITC-dextran)을 사용하여 마우스의 장 투과성을 실시간으로 정량화하고 추적합니다. FITC-덱스트란을 경구 보충하기 전에 마우스를 금식시킵니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 FITC-덱스트란으로 위관영양됩니다. 위관 관찰 1시간 후, 마우스는 이소플루란을 사용하여 전신 마취를 받고 생체 내 형광은 이미징 챔버에서 시각화됩니다. 이 기술은 복강의 잔류 형광과 간 흡수를 평가하는 것을 목표로 하며, 이는 형광 프로브의 문맥 이동을 시사합니다. 혈액 및 대변 샘플을 경구 위관 영양 검사 후 4 시간 후에 수집하고 마우스를 희생시킵니다. 그런 다음 PBS로 희석된 혈장 및 분변 샘플을 도말하고 형광을 기록합니다. 그런 다음 FITC-덱스트란의 농도를 표준 곡선을 사용하여 계산합니다. 이전 연구에서 생체 내 이미징은 저섬유질 식단에 의해 유도된 장 장벽이 약한 쥐에서 형광이 간으로 빠르게 퍼지는 반면, 장 장벽을 강화하기 위해 섬유질이 보충된 쥐에서는 형광 신호가 대부분 위장관에 유지된다는 것을 보여주었습니다. 또한, 이 연구에서 대조군 마우스는 혈장 형광이 상승하고 대변의 형광이 감소한 반면, 반대로 이눌린이 보충된 마우스는 장에서 형광 신호 수준이 높고 혈장에서 낮은 수준을 보였습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 장 건강의 지표로서 장 투과성의 정성적 및 정량적 측정을 제공합니다.

생체 내 형광 분석 결과, 대조군 식이만 섭취한 쥐는 이눌린 보충 식이만 섭취한 쥐에 비해 FITC-덱스트란의 간 섭취량이 더 높고 복강 내 잔류 형광 수치가 더 높은 것으로 나타났습니다(그림 2A). 이눌린식이 요법을받은 쥐의 맹장에서 약간의 형광이 보였지만 간 섭취가 거의 또는 전혀 없었으며, 이는 이러한 식단이 장 투과성 증가로부터 보호되었음을 나타냅니다.
혈장 및 분변 샘플의 형광 수준은 생체 내 대응물을 강화하고 정량화하는 데 작용합니다. 이눌린이 보충된 식이만 섭취한 쥐는 대조군 식이만 섭취한 쥐에 비해 혈장 내 FITC-덱스트란 수치가 유의하게 낮았습니다(그림 2B). 이는 FITC-덱스트란이 적을수록 장 장벽이 순환계로 침투할 수 있기 때문에 장 장벽 기능이 향상되었음을 나타냅니다. 이와 일치하게, 이눌린 식이만 섭취한 쥐는 대조군 식이만 섭취한 쥐보다 대변 내 FITC-덱스트란 수치가 유의하게 높았습니다(그림 2C). 이것은 FITC-덱스트란이 정상으로 간주되는 것처럼 배설될 때까지 결장에 남아 있었기 때문에 장 장벽 기능이 손상되지 않았음을 강화합니다. 대조군 마우스의 대변에서 FITC-덱스트란의 낮은 수치는 적절하게 배설되지 않고 장 장벽을 통해 순환계로 침투했음을 나타냅니다. 혈장 내 FITC-덱스트란 수치가 높으면 이러한 발견이 뒷받침됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> 그림 2: 이눌린을 사용한 식이 보충제는 장 장벽을 통한 FITC-덱스트란의 전좌를 감소시킵니다. (A) FITC-덱스트란의 잔류 형광 및 간 흡수. 빨간색 = 가장 높은 강도; 짙은 보라색 = 가장 낮은 강도. 최대 형광 2.15 x 103, 최소 형광 0.378. (B) FITC-덱스트란의 혈장 농도. P = 0.010입니다. (C) FITC-덱스트란의 분변 농도. P = 0.00003입니다. N = 그룹당 4개. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다. 짝을 이루지 않은 학생의 t-검정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

본 연구에서, 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지(FITC) 덱스트란을 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하여 생체 내 및 혈장 및 대변 샘플 모두에서 장 투과성을 평가합니다. 장 장벽 기능은 많은 질병 과정에서 영향을 받기 때문에 이 직접적이고 정량적인 분석은 다양한 연구 분야에서 사용될 수 있습니다.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

이 방법은 상태가 장 장벽 무결성을 변경하는지 여부에 대한 질문 또는 잠재적인 치료가 장 장벽 무결성을 유지할 수 있는지에 대한 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 장 투과성을 평가하고 정량화할 수 있는 비침습적이고 부담이 적은 기술을 제공한다는 것입니다. 시작하기 위해, 마우스를 4시간 동안 금식시킨 다음, 38 밀리미터 22 게이지 멸균된 곡선형 위관영양관 바늘을 사용하여 각 마우스에 경구 위관영양법을 통해 200 마이크로리터의 FITC-덱스트란 현탁액을 투여한다.첫 번째 위관 영양 기능 후 타이머를 시작하고 생체 내 측정이 가능하도록 각 위 관법 사이에 5-10 분을 기다렸다가 위관 영양 후 1 시간을 유지합니다. 표준 곡선에 대한 나머지 FITC-dextran 현탁액을 유지합니다. 시작 버튼을 클릭한 상태에서 기계와 소프트웨어를 시작하고 시스템이 예열될 때까지 기다립니다.Device status(디바이스 상태)를 클릭하고 계속하기 전에 구성된 모든 디바이스에 OK(확인)가 표시되는지 확인합니다. 그런 다음 새 연구를 클릭하고 원하는 이름으로 파일을 저장합니다. 그런 다음 연구 옵션을 클릭하십시오.표본 ID를 입력하고 올바른 레이저를 선택하고 실험하십시오. 그런 다음 전기 면도기를 사용하여 복부에서 털을 제거하고 건조를 방지하기 위해 수의학 연고를 눈에 넉넉히 바릅니다. 이미징 챔버를 열고 동물을 주사판에 등쪽으로 놓습니다.그런 다음 팔다리와 꼬리를 테이프로 고정하십시오. 그런 다음 그리기 도구를 사용하여 스캔할 영역을 선택합니다. 간 바로 위에서 직장까지 복부의 전체 너비를 포함해야 합니다.그런 다음 수정 도구를 클릭하여 그린 영역을 조정합니다. 스캔 해상도를 2.0mm로 설정하고 시작을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 그런 다음 선택한 파일 이름으로 이미지 파일을 찾아 열고 동기화된 설정으로 모든 파일을 동시에 엽니다.이미지 설정 도구 모음에서 이미지 동기화 및 배율 동기화 버튼을 사용하여 정확한 비교를 위해 이미지 설정을 동기화합니다. 그런 다음 조정된 배율로 이미지를 저장합니다. 이미징 시스템과 관련된 소프트웨어를 사용하여 균일하게 스케일링된 이미지에서 각 동물과 대조군 마우스의 복부 형광을 비교합니다.위관 관찰 후 4시간 후에 멸균 튜브에 각 마우스의 분변 펠릿을 수집합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 어둠 속에 두십시오. 다음에, 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 9, 390 x g에서 원심분리한다.그런 다음 혈장을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 어둠 속에서 얼음 위에 보관하십시오. 50 밀리그램의 분변 샘플을 200 마이크로 리터의 PBS로 희석하고 PBS로 혈장을 1 대 2 비율로 희석합니다. 플레이트 100 마이크로리터 샘플과 표준물질을 불투명한 검은색 96웰 플레이트에 담습니다.형광 플레이트 리더에서 485 나노미터의 여기와 530 나노미터의 흡수로 형광을 판독합니다. 마지막으로, 형광을 표준 곡선의 알려진 농도와 비교하여 시료당 FITC-dextran의 농도를 결정합니다. 생체 내 형광 분석 결과, 대조군 식이만 섭취한 쥐는 이눌린 보충 식이를 섭취한 쥐에 비해 FITC-덱스트란의 간 섭취량이 더 높고 복강 내 잔류 형광 수치가 더 높은 것으로 나타났습니다.이눌린 보충 식이를 받은 쥐는 대조군 식이만 받은 쥐에 비해 혈장 내 FITC-덱스트란 수치가 현저히 낮았습니다. 이와 일치하게, 이눌린 식이만 섭취한 쥐는 대조군 식이만 섭취한 쥐보다 대변에서 FITC-덱스트란 수치가 유의하게 더 높았습니다. 통제된 쥐의 대변에서 FITC-덱스트란의 낮은 수치는 적절하게 배설되지 않고 장 장벽을 통해 순환계로 침투했음을 나타냅니다.혈장 내 FITC-덱스트란 수치가 높아 이 발견이 더욱 강화되었습니다. 이 절차를 시도할 때는 타이밍이 중요합니다. 형광 판독 및 샘플 수집은 각 개별 마우스에 대해 위관 후 1시간 및 4시간 동안 가능한 한 가깝게 이루어져야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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마이트의 굿 미생물 (Zootermopsis Angusticollis)에서 DNA를 추출하고 굿 미생물을 떠올리

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연구

생물학

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

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Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

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