Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av et tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (stipend RGPIN-2018-06442 til MMS). Vi takker dyreavdelingen ved CRCHUM og Dr. Junzheng Peng fra Cardiovascular Phenotyping Platform.

Alle prosedyrer ble utført i henhold til Canadian Council on Animal Care retningslinjer etter godkjenning av Institutional Animal Care Committee of CRCHUM. Åtte uker gamle kvinnelige BALB / c-mus, hentet fra en kommersiell kilde (se materialfortegnelse), ble brukt til denne studien. Dyrene fikk kosttilskudd med 10% inulin vekt/vekt i 2 uker. En kontrollgruppe fikk en lignende diett som manglet inulintilskuddet. Mus hadde ad libitum tilgang til dietten. En oversikt over analysen er vist i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av FITC-dextran-analysen. T-4- 4 timer før gavage ble mattilgangen fjernet. T0- FITC-dextran ble administrert via oral gavage. T1 - 1 time etter gavage ble in vivo fluorescens evaluert. T4- 4 timer etter gavage ble fekal- og plasmaprøver samlet, og fluorescensen ble målt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
1. Administrering av FITC-dextran
<ol><li>Før administrering av FITC-dextran, må musene fastes i 4 timer mens du opprettholder ad libitum-tilgang til vann. MERK: Fasten må helst startes i begynnelsen av lyssyklusen (om morgenen). Musene kan overføres til et nytt bur uten sengetøy under faste for å begrense koprofagi.</li>
	<li>Tilbered 200 μL 80 mg·ml−1 4 kDa FITC-dextran (se materialfortegnelse) fortynnet i steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (per mus). Forbered prøvene umiddelbart før administrering, og hold dem beskyttet mot lys.</li>
	<li>Administrer 200 mikrol av FITC-dextran suspensjonen via oral gavage til hver mus ved hjelp av en 38 mm 22 G sterilisert, buet nål med en kule- eller pæreformet spiss (se materialfortegnelsen). Start en timer etter den første gavage, og vent i 5-10 min før gavaging neste mus for å tillate in vivo målinger (trinn 2), alltid opprettholde 1 t post gavage. Behold den gjenværende FITC-dekstran-fjæringen for standardkurven. MERK: Umiddelbart etter gavage, kan mat erstattes for å sikre dannelse av avføring.</li>
</ol>2. In vivo fluorescensmåling
<ol><li>Bedøv musene 1 time etter gavage ved hjelp av 2,5% isofluran eller et alternativt bedøvelsesmiddel. Bekreft at dyret er riktig bedøvet ved å klemme tåen eller halen og sørge for at dyret ikke reagerer.<ol><li>Fjern pelsen fra bukområdet ved hjelp av en barbermaskin, og bruk sjenerøst oftalmisk smøresalve på øynene for å forhindre tørking. Plasser deretter musene individuelt i bildekammeret som ligger dorsalt. MERK: En kontrollmus må inkluderes som mottar PBS eller saltvann i stedet for FITC-dextran for å ta hensyn til bakgrunnen under in vivo-avbildning .</li>
	</ol></li>
	<li>Se for deg musene ved hjelp av et fluorescensavbildningskammer (se materialfortegnelse). Ta bilder av bukregionen, sett laserlengden på 470 nm og oppløsningen på 2,0 mm.<ol><li>Start maskinen og programvaren ved å klikke og holde inne startknappen . La systemet varmes opp. MERK: Systemet kan trenge 20 minutter eller mer for å varme opp, så maskinen må startes tidlig for ikke å forstyrre avbildning av musene ved 1 time etter gavage.</li>
		<li>Klikk på Enhetsstatus og sørg for at alle konfigurerte enheter viser "OK" før du fortsetter.</li>
		<li>Hvis nødvendig, varm opp riktig laser ved å klikke på Laserkontroll og deretter klikke på Lasernavn-knappen på ønsket laser.</li>
		<li>Start en ny studie ved å klikke på Ny studie. Lagre under riktig fil med ønsket navn.</li>
		<li>Klikk på Studiealternativer, skriv deretter inn prøve-IDen, og velg riktig laser og eksperiment.</li>
		<li>Åpne bildekammeret og plasser dyret dorsalt på skanneplaten. Fest lemmer og hale med tape, og sørg for at nesen og munnen passer godt inn i anestesirøret, og oppretthold 2,5% isofluran.</li>
		<li>Juster høyden på skanneplaten slik at skanneområdet er litt ventralt fra dyrets midtlinje. Juster platen ved å vri justeringsknappen inne i bildekammeret. Lukk og lås døren til bildekammeret.</li>
		<li>Merk området som skal skannes ved hjelp av tegneverktøyet . Inkluder hele bredden av magen fra like over leveren til endetarmen. Klikk på Endre verktøy for å justere området en gang tegnet.</li>
		<li>Sett skanneoppløsningen til 2,0 mm, og klikk deretter på Neste. Når strømautomatiseringen er fullført, må du kontrollere at innstillingene er riktige, og foreta eventuelle justeringer som trengs. Klikk på Start for å starte skanningen.</li>
		<li>Når skanningen er fullført, fjern dyret fra bildekammeret, og plasser det i en inkubator for å opprettholde kroppstemperaturen mens du gjenoppretter fra anestesi.</li>
		<li>Klikk på Fortsett studien for å opprettholde innstillingene, og gjenta deretter trinn 2.2.5-2.2.10 til alle musene er skannet.</li>
		<li>Klikk på strømknappen og hold den inne i 3 s for å slå av bildekammeret.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluer fluorescensen ved å sammenligne abdominalfluorescensen til hvert dyr og kontrollmusen på jevnt skalerte bilder ved hjelp av en programvare knyttet til bildesystemet som brukes (se materialfortegnelse).<ol><li>Åpne bildefilene ved å finne dem under det valgte filnavnet. Åpne alle filene som har synkroniserte innstillinger samtidig.</li>
		<li>Bruk verktøylinjen for bildeinnstillinger til å bruke knappene Synkroniser bilde og Synkroniser skala til å synkronisere innstillingene for bildene, slik at du kan sammenligne dem nøyaktig.</li>
		<li>Lagre bildene med de justerte skalaene.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fluorescensmåling i fekale prøver og plasma
<ol><li>Samle en fekal pellet fra hver mus i et sterilt rør 4 timer etter gavage. Hold rørene i mørket på is.</li>
	<li>Bedøve musene via intraperitoneal injeksjon av 240 mg/ml pentobarbitalnatrium (fortynning, 1:100; se materialfortegnelse). Administreres i en dose på 0,03 ml/g kroppsvekt.<ol><li>Samle blodprøver på minst 700 μL i et rør laget for plasmaoppsamling som inneholder heparin eller EDTA for å forhindre koagulering (se materialtabell) ved å sette inn et glasskapillærrør i retro-orbital plexus14. MERK: Alternative metoder for blodinnsamling inkluderer hjertepunktering eller uttak fra halvenen. Siden dette er en terminal prosedyre, må musene avlives via cervikal dislokasjon eller en alternativ human metode. Følg anbefalingene fra den lokale dyreetiske komiteen for avlivning.</li>
	</ol></li>
	<li>Sentrifuger blodprøvene ved 9 390 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Overfør plasmaet til et nytt sterilt rør, og hold det i mørket på is.</li>
	<li>Fortynn 50 mg fekale prøver i 200 μL 1x PBS og fortynn plasmaet 1: 2 med 1x PBS. Fortynningsforholdet kan modifiseres basert på intensiteten av fluorescenssignalet.</li>
	<li>Generer en standardkurve ved hjelp av serielle fortynninger av FITC-dextran i 1x PBS. Starter med den høyeste konsentrasjonen av 20 mg·ml-1 FITC dextran, fortynnet med en faktor på 1:1 serielt 7-10 ganger. MERK: Konsentrasjonene må derfor lese 20 mg·ml−1, 10 mg·ml−1, 5 mg·ml−1, 2,5 mg·ml−1, 1,25 mg·ml−1, 0,625 mg·ml−1, 0,3125 mg·ml−1, osv.</li>
	<li>Plate 100 μL prøver og standarder i en ugjennomsiktig svart 96-brønnsplate. Inkluder en PBS-tom. Les fluorescensen på en fluorescerende plateleser (se materialtabell) med absorpsjon ved 530 nm og eksitasjon ved 485 nm. MERK: Prøvene og standardene kan belegges i duplikat eller triplikat, og deretter blir fluorescensverdiene deres gjennomsnittet.</li>
	<li>Bestem konsentrasjonen av FITC-dextran per prøve ved å sammenligne fluorescensen med de kjente konsentrasjonene av standardkurven. I prøvene multipliserer du konsentrasjonen med fortynningsfaktoren (trinn 3,5).</li>
</ol>

<ol>
	<li>K&#246;nig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+barrier+function+in+health+and+disease.">Human intestinal barrier function in health and disease.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).</li><li>Lorenzo-Zuniga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+I+improves+intestinal+barrier+function+in+cirrhotic+rats.">Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats.</a> Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).</li><li>Schwarz, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIGHT+signals+directly+to+intestinal+epithelia+to+cause+barrier+dysfunction+via+cytoskeletal+and+endocytic+mechanisms.">LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms.</a> Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).</li><li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis.">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li><li>Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+translocation+and+changes+in+the+intestinal+microbiome+in+mouse+models+of+liver+disease.">Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease.</a> Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).</li><li>Galipeau, H. J., Verdu, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+task+of+measuring+intestinal+permeability+in+basic+and+clinical+science.">The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science.</a> Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).</li><li>Bordoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+an+electrolyzed+reduced+water+on+gut+permeability,+fecal+microbiota+and+liver+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease.">Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).</li><li>Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+is+reduced+and+IL-10+levels+are+increased+in+septic+IL-6+knockout+mice.">Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).</li><li>Crapser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+induces+gut+permeability+and+enhances+bacterial+translocation+leading+to+sepsis+in+aged+mice.">Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice.</a> Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).</li><li>Mal Earley, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+alters+the+intestinal+microbiome+and+increases+gut+permeability+and+bacterial+translocation.">Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation.</a> PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut+microbiota+from+autism+spectrum+disorder+promote+behavioral+symptoms+in+mice.">Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice.</a> Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).</li><li>Schroeder, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+or+fiber+protects+against+diet-induced+microbiota-mediated+colonic+mucus+deterioration.">Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).</li><li>Hajjar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+colonic+healing+and+surgical+recovery+with+perioperative+supplementation+of+inulin+and+galacto-oligosaccharides.">Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides.</a> Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Blood+Withdrawal+I.">Lab Animal Research. Blood Withdrawal I.</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Costantini, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+intestinal+injury+using+a+novel+in+vivo,+near-infrared+imaging+technique.">Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique.</a> Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).</li><li>Thevaranjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+microbial+dysbiosis+promotes+intestinal+permeability,+systemic+inflammation,+and+macrophage+dysfunction.">Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+intestinal+permeability.">Alterations in intestinal permeability.</a> Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).</li><li>von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+intestinal+permeability+in+Crohn's+disease+patients+using+orally+administered+52Cr-EDTA.">Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA.</a> PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).</li><li>Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+and+blood+correlates+of+reduced+functional+connectivity+in+mild+cognitive+impairment.">Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment.</a> Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen avsløringer.

Tarmbarrierefunksjonen er en integrert del av mange forskjellige sykdomsprosesser. Derfor er vurdering av intestinal permeabilitet på en ikke-invasiv, kostnadseffektiv og kvantifiserbar måte avgjørende for nøyaktig å representere disse sykdommene i dyremodeller. FITC-dextran-analysen gir mulighet for denne representasjonen. Denne protokollen innebærer imidlertid flere kritiske trinn som må fullføres nøyaktig for å oppnå pålitelige resultater. For det første er det viktig å sikre bruk av passende størrelse FITC-dekstran. For undersøkelse in vivo permeabilitet er 4 kDa FITC-dextran den optimale molekylvekten, og når molekylvekten øker, reduseres permeabiliteten15. Dermed kan bruk av FITC-dextran med en annen molekylvekt gi forvirrende eller upålitelige resultater. I tillegg er det viktig å notere tidspunktet for hver gavage og å justere tidspunktene for in vivo datainnsamling og innsamling av plasma og avføring tilsvarende. For eksempel, hvis to mus er herjet 10 min fra hverandre, må in vivo fluorescensavlesninger og innsamling av avføring og plasma også forekomme med 10 minutters mellomrom. Sammenligning av fluorescensen på samme tidspunkter muliggjør en mer nøyaktig representasjon av forskjellene i permeabilitet. Videre bør rekkefølgen dyrene fra forskjellige grupper testes i skiftes for å forhindre en klyngeeffekt på grunn av timing. I stedet for å teste alle dyrene i gruppe A først, deretter alle dyrene i gruppe B nummer to (AAABBB), anbefales det at gruppen byttes etter hvert dyr (ABABAB).
Denne analysen kan modifiseres for å inkludere bare evaluering av plasma- og fekale prøver hvis det mangler tilgang til en bildebehandlingsmaskin. Selv om direkte fluorescensavbildning in vivo tillater visualisering av leverinntak og gjenværende abdominal fluorescens, gir evaluering av fluorescens i plasma og fekale prøver fortsatt en kvantitativ måling av intestinal permeabilitet. Videre, som demonstrert ved det beskrevne eksperimentet, korrelerer fluorescensnivåene i plasma og avføring godt med in vivo-avbildningen. I tillegg kan denne analysen endres slik at den bare inkluderer in vivo-avbildning. Dette gjør at dyrene kan holdes i live for å fortsette å teste andre parametere eller overvåke hvordan intestinal permeabilitet endres over tid. Evnen til å endre denne analysen gjør den derfor tilgjengelig, men likevel kvantitativ. Endelig har dosen på 200 μL av 80 mg · ml - 1 FITC-dextran gitt til hver mus blitt brukt tidligere og ble vist å være effektiv hos mus med små forskjeller i kroppsvekt16. Videre er det viktig å merke seg at alle musene som ble brukt i den representative resultatdelen veide ca. 20 g, slik at samme dosering kunne brukes for hver mus. For å ta hensyn til forskjeller i kroppsvekt kan imidlertid FITC-dextran administreres i en dose på 0,6-0,8 mg / g kroppsvekt, for eksempel17. Avgjørende, uavhengig av doseringen som brukes, er det viktig å begrense mengden til hver mus til mindre enn 10 ml · kg -1 for å forhindre komplikasjoner eller ubehag18.
Selv om FITC-dextran-analysen gir en effektiv metode for å evaluere tarmbarrierefunksjonen, har den fortsatt noen begrensninger. En begrensning av denne modellen er at den krever faste musene i flere timer, noe som betyr at det er upålitelig å sammenligne disse resultatene med de fra mus som ikke har blitt fastet. I tillegg kan faste påvirke resultatene i visse modeller som krever strenge fôringsplaner, for eksempel ved måling av blodsukker i dyremodeller for diabetes.
Til tross for disse begrensningene forblir FITC-dextran-analysen en effektiv metode for å analysere intestinal permeabilitet, da den er kvantitativ, allsidig, kostnadseffektiv og mindre invasiv enn mange klassiske metoder. For eksempel er vanlige sonder som brukes til å måle intestinal permeabilitet små sakkaridprober eller Cr-EDTA, som har noen fordeler19. Noen sakkaridprober har imidlertid bare regionspesifikk permeabilitet. Siden de hydrolyseres i den distale delen av tynntarmen, gir de ingen innsikt i kolonpermeabilitet19. På den annen side kan Cr-EDTA gi informasjon om kolonpermeabilitet, men krever målinger i 24 timer, noe som gjør tidsbelastningen for denne metoden mye høyere enn for FITC-dextran-analysen20. Videre gir ingen av disse metodene direkte in vivo avbildning av denne analysen. Derfor gir FITC-dextran-analysen et relativt enkelt, direkte og effektivt alternativ sammenlignet med alternative metoder for måling av intestinal permeabilitet.
Til slutt, i sykdomsprosesser som IBD4, Alzheimers sykdom21 og leversykdom2, er intestinal permeabilitet en viktig parameter som kan måles ved hjelp av FITC-dextran-analysen for å forbedre studier. For eksempel, ved utvikling av nye behandlinger, for eksempel immunterapier for IBD, kan denne analysen brukes til å teste effekten av terapeutisk for å opprettholde tarmbarriereintegritet. Tatt i betraktning at nedsatt tarmbarrierefunksjon kan være involvert i å opprettholde kronisk betennelse i UC, for eksempel, er det viktig å undersøke hvor godt en terapeutisk beskytter mot økt permeabilitet4. Dette er bare ett eksempel, men FITC-dextran-analysen er en tilgjengelig og kvantifiserbar måte å måle intestinal permeabilitet på mange forskjellige områder og aspekter av forskning.

Tarmbarrieren spiller en viktig rolle i både helse og sykdom. Det krever en kompleks balanse mellom å la de nødvendige næringsstoffene trenge inn i sirkulasjonen fra tarmlumenet samtidig som det forhindrer penetrering av proinflammatoriske molekyler, som patogener eller antigener1. Økt permeabilitet kan skyldes mange gastrointestinale sykdommer, som leversykdom eller inflammatoriske tarmsykdommer (IBD)2,3. For eksempel, i ulcerøs kolitt (UC), en IBD, fører kronisk betennelse til nedbrytning av stramme veikryss, den påfølgende forstyrrelsen av tarmbarrieren og translokasjonen av bakterier, som potensielt opprettholder slimhinne og systemisk betennelse4.
Tarmbarrierens integritet er derfor en viktig markør for tarmhelsen. Imidlertid har dagens metoder for måling av intestinal permeabilitet mange begrensninger. For eksempel er metoder som måler plasmainflammatoriske markører eller bakteriell translokasjon til milt og lymfeknuter indirekte 5,6. Andre metoder kan være invasive og tidkrevende. Denne artikkelen beskriver en ikke-invasiv og kostnadseffektiv analyse som direkte og kvantitativt måler intestinal permeabilitet. Denne analysen bruker fluorescein-isotiocyanatmerket dextran (FITC-dextran) for å følge intestinal permeabilitet i sanntid ved å måle fluorescens in vivo. I tillegg kvantifiserer måling av FITC-dekstrannivået i plasma og avføring tarmpermeabiliteten (figur 1).
FITC-dextran permeabilitetsanalysen har tidligere blitt brukt i mange forskjellige sammenhenger, inkludert i dyremodeller av Parkinsons sykdom7, sepsis8, iskemisk slag9 og brannskade10. I tillegg har denne analysen nylig blitt brukt til å hjelpe til med å forstå hvordan tarmmikrobiomet kan være involvert i forskjellige sykdomsprosesser og hvordan det kan målrettes eller manipuleres som en potensiell terapeutisk. For eksempel har den blitt brukt til å studere mikrobiomet og mikrobiombaserte terapier i aldring 11, IBD12, kolorektal kreft13 og autismespektrumforstyrrelse11. Siden tarmbarrierefunksjonen er involvert i mange aspekter av helse og sykdom, har denne analysen blitt brukt mye. Dens relative enkelhet og lave tidsbelastning gjør den ideell for testing av in vivo-forholdene som mistenkes å endre tarmbarrierens integritet. Dens kvantitative resultater er nyttige for å bestemme effektiviteten av en potensiell behandling.
I denne studien ble effekten av diett på tarmbarrierefunksjonen evaluert ved hjelp av FITC-dextran-analysen. Den intestinale permeabiliteten hos mus som fikk en kontrolldiett og tarmpermeabiliteten hos mus som fikk en inulin-supplert diett ble sammenlignet. Inulin er et gunstig oligosakkarid som har vist seg å forbedre tarmbarrierefunksjonen12,13. For in vivo fluorescensmålinger (bakgrunn) ble ytterligere en ubehandlet mus brukt som negativ kontroll og fikk PBS i stedet for FITC-dextran. Dette eksperimentet viser at FITC-dextran-analysen er et verdifullt verktøy for å evaluere intestinal permeabilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

Tarmbarriereintegritet er et kjennetegn på tarmhelsen. Mens tarmbarrierens integritet kan vurderes ved hjelp av indirekte markører som måling av plasmainflammatoriske markører og bakteriell translokasjon til milten og lymfeknuter, kvantifiserer gullstandarden direkte utvalgte molekylers evne til å krysse tarmslimhinnelaget mot systemisk sirkulasjon. Denne artikkelen bruker en ikke-invasiv, kostnadseffektiv og lavbelastningsteknikk for å kvantifisere og følge i sanntid tarmpermeabiliteten hos mus ved bruk av fluorescein-isotiocyanatmerket dextran (FITC-dextran). Før oral tilskudd med FITC-dextran fastes musene. De blir deretter herjet med FITC-dextran fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS). En time etter gavage blir musene utsatt for generell anestesi ved bruk av isofluran, og in vivo-fluorescensen visualiseres i et bildekammer. Denne teknikken tar sikte på å vurdere gjenværende fluorescens i bukhulen og leveropptaket, noe som tyder på portalmigrasjon av den fluorescerende sonden. Blod- og avføringsprøver samles 4 timer etter oral gavage, og musene ofres. Plasma- og fekale prøver fortynnet i PBS blir deretter belagt, og fluorescensen registreres. Konsentrasjonen av FITC-dextran beregnes deretter ved hjelp av en standardkurve. I tidligere forskning har in vivo-avbildning vist at fluorescens raskt sprer seg til leveren hos mus med en svakere tarmbarriere indusert av et fiberfattig diett, mens hos mus supplert med fiber for å styrke tarmbarrieren, beholdes det fluorescerende signalet hovedsakelig i mage-tarmkanalen. I tillegg hadde kontrollmusene i denne studien forhøyet plasmafluorescens og redusert fluorescens i avføringen, mens omvendt hadde inulintilskudd mus høyere nivåer av fluorescenssignaler i tarmen og lave nivåer i plasma. Oppsummert gir denne protokollen kvalitative og kvantitative målinger av intestinal permeabilitet som markør for tarmhelse.

Analysen av in vivo fluorescens viste at mus som bare fikk kontrolldietten hadde et høyere leverinntak av FITC-dextran og høyere nivåer av gjenværende fluorescens i bukhulen sammenlignet med musene som fikk inulintilskudd diett (figur 2A). Noe fluorescens var synlig i cecum hos musene som fikk inulindietten, men det var lite eller ingen leverinntak, noe som indikerer at disse diettene beskyttet mot økt intestinal permeabilitet.
Fluorescensnivåene i plasma- og fekalprøver arbeider for å styrke og kvantifisere deres in vivo-kolleger . Musene som fikk inulin-supplert diett hadde signifikant lavere nivåer av FITC-dextran i plasma sammenlignet med musene som bare fikk kontrolldietten (figur 2B). Dette indikerer at de hadde forbedret tarmbarrierefunksjonen fordi mindre FITC-dextran kunne trenge tarmbarrieren inn i sirkulasjonen. Samtidig hadde musene som fikk inulin dietten signifikant høyere nivåer av FITC-dextran i avføringen enn musene som bare fikk kontrolldietten (figur 2C). Dette forsterker at de hadde intakt tarmbarrierefunksjon da FITC-dextran forble i tykktarmen til utskillelse, som regnes som normalt. De lavere nivåene av FITC-dextran i avføringen til kontrollmusene indikerer at det gjennomsyret gjennom tarmbarrieren inn i sirkulasjonen i stedet for å bli utskilt på riktig måte. De høye nivåene av FITC-dextran i plasma forsterker dette funnet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Figur 2: Kosttilskudd med inulin reduserer translokasjonen av FITC-dextran gjennom tarmbarrieren . (A) Gjenværende fluorescens og leveropptak av FITC-dextran. Rød = høyeste intensitet; mørk lilla = laveste intensitet. Maksimal fluorescens på 2,15 x 103, minimum fluorescens på 0,378. (B) Den plasmatiske konsentrasjonen av FITC-dextran. P = 0,010. (C) Fekal konsentrasjon av FITC-dextran. P = 0,00003. N = 4 per gruppe. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. Hver prikk representerer én mus. Uparede Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

I denne studien administreres fluorescein-isotiocyanatmerket (FITC) dextran til mus via oral gavage for å evaluere intestinal permeabilitet både in vivo og i plasma- og fekalprøver. Siden tarmbarrierefunksjonen påvirkes i mange sykdomsprosesser, kan denne direkte og kvantitative analysen brukes i ulike forskningsområder.

Vurdering av tarmbarriereintegritet hos mus ved bruk av fluorescein-isotiocyanatmerket dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Denne metoden bidrar til å svare på spørsmål om hvorvidt en tilstand endrer tarmbarrierens integritet eller spørsmål om en potensiell behandling kan opprettholde tarmbarrierens integritet. Den største fordelen med denne teknikken er at den tilbyr en ikke-invasiv, lavbelastningsteknikk for å evaluere og kvantifisere intestinal permeabilitet in vivo. For å begynne, rask musene i fire timer, og administrer deretter 200 mikroliter av FITC-dextran-suspensjonen via oral gavage til hver mus ved hjelp av en 38 millimeter 22 gauge sterilisert buet gavage nål.Start en timer etter den første gavage og vent fem til 10 minutter mellom hver gavage for å tillate in vivo målinger, opprettholde en time etter gavage. Behold den gjenværende FITC-dekstran-fjæringen for standardkurven. Start maskinen og programvaren ved å klikke og holde inne startknappen og la systemet varmes opp.Klikk på Enhetsstatus og sørg for at alle konfigurerte enheter viser OK før du fortsetter. Klikk deretter på Ny studie og lagre filen med ønsket navn. Deretter klikker du på Studiealternativer.Skriv inn prøve-ID-en og velg riktig laser og eksperiment. Fjern deretter pelsen fra bukområdet ved hjelp av en barbermaskin, og påfør veterinærsalve sjenerøst til øynene for å forhindre tørking. Åpne bildekammeret og plasser dyret dorsalt på skanneplaten.Fest deretter lemmer og hale med tape. Velg deretter området som skal skannes ved hjelp av tegneverktøyet. Sørg for å inkludere hele bredden av magen fra like over leveren til endetarmen.Klikk deretter på Endre verktøy for å justere området når det er tegnet. Sett skanneoppløsningen til 2.0 millimeter og klikk på Start for å starte skanningen. Deretter åpner du bildefilene ved å finne dem under det valgte filnavnet og samtidig åpne alle filene med synkroniserte innstillinger.Bruk verktøylinjen for bildeinnstillinger til å bruke knappene Synkroniser bilde og Synkroniser skala til å synkronisere bildeinnstillingene for en nøyaktig sammenligning. Lagre deretter bildene med de justerte skalaene. Sammenlign abdominalfluorescensen til hvert dyr og kontrollmusen på jevnt skalerte bilder ved hjelp av programvare tilknyttet bildesystemet.Samle en fekal pellet fra hver mus i et sterilt rør fire timer etter gavage. Hold deretter rørene på is og legg dem i mørket. Deretter sentrifugerer du blodprøver ved 9.390 x g i 10 minutter ved romtemperatur.Overfør deretter plasmaet til et nytt sterilt rør og hold det på is i mørket. Fortynn 50 milligram fekale prøver i 200 mikroliter PBS, og fortynn plasmaet med PBS i et forhold på en til to. Plate 100 mikroliter prøver og standarder i en ugjennomsiktig svart 96-brønnsplate.Les fluorescensen på en fluorescerende plateleser med eksitasjon ved 485 nanometer og absorpsjon ved 530 nanometer. Til slutt bestemmer du konsentrasjonen av FITC-dextran per prøve ved å sammenligne fluorescensen med de kjente konsentrasjonene av standardkurven. Analysen av in vivo-fluorescensen viste at mus som bare fikk kontrolldietten hadde et høyere leverinntak av FITC-dextran og høyere nivåer av gjenværende fluorescens i bukhulen sammenlignet med musene som fikk inulin-supplert diett.Musene som fikk inulin-supplert diett hadde signifikant lavere nivåer av FITC-dextran i plasma sammenlignet med musene som bare fikk kontrolldietten. Tilsvarende hadde musene som fikk inulin dietten betydelig høyere nivåer av FITC-dextran i avføringen enn musene som bare fikk kontrolldietten. De lavere nivåene av FITC-dextran i avføringen til de kontrollerte musene indikerer at det gjennomsyret gjennom tarmbarrieren inn i sirkulasjonen i stedet for å bli utskilt på riktig måte.De høye nivåene av FITC-dextran i plasma forsterket dette funnet. Timing er viktig når du prøver denne prosedyren. Fluorescensavlesning og prøvetaking bør skje så nært som mulig til en time og fire timer etter gavage for hver enkelt mus.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

En protokoll for bruk av Gene satt berikelse analyse for å identifisere den aktuelle dyr modellen for translasjonsforskning

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

En metode for å vurdere bakteriocin-effekter på gut-mikrobioten av mus

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokoll for genetisk Gut innhold analyser av akvatiske Macroinvertebrates bruke gruppe-spesifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studere Ribonucleotide inkorporering: Strand-spesifikke påvisning av Ribonucleotides i gjær genomet og måler Ribonucleotide-indusert mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Høy gjennomstrømming-måling av Gut transittiden bruker larver sebrafisk

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Vurdering av sebrafisk Lens nucleus lokalisering og Sutural integritet

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Vurdering av metabolske effekter av Isocaloric 2:1 intermitterende Fasting i mus

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...