Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Эта работа была профинансирована за счет гранта Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (грант RGPIN-2018-06442 MMS). Мы благодарим животноводческое учреждение CRCHUM и доктора Цзюньчжэн Пэна из Платформы сердечно-сосудистого фенотипирования.

Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными после одобрения Институциональным комитетом по уходу за животными CRCHUM. Для настоящего исследования были использованы восьминедельные самки мышей BALB/c, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Животные получали пищевые добавки с 10% инулином в течение 2 недель. Контрольная группа получала аналогичную диету, в которой отсутствовала добавка инулина. Мыши имели свободный доступ к рациону. Обзор анализа показан на рисунке 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема анализа FITC-декстрана. Т−4-4 ч до зонда доступ к пище был прекращен. T0-FITC-декстран вводили через пероральный зонд. T1 - через 1 ч после зонда оценивали флуоресценцию in vivo. После зонда Т4-4 ч собирали образцы кала и плазмы, измеряли флуоресценцию. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
1. Администрирование ФИТК-декстрана
<ol><li>Перед введением FITC-декстрана мышей следует ускорить в течение 4 ч, сохраняя при этом свободный доступ к воде. ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно, чтобы голодание начиналось в начале светового цикла (утром). Мыши могут быть переведены в новую клетку без подстилки во время голодания, чтобы ограничить копрофагию.</li>
	<li>Приготовьте 200 мкл 80 мг · мл - 1 4 кДа FITC-декстрана (см. Таблицу материалов), разведенного в стерильном 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) (на мышь). Предварительно подготовьте образцы непосредственно перед введением и защитите их от света.</li>
	<li>Вводят 200 мкл суспензии FITC-декстрана через ротовой зонд каждой мыши, используя стерилизованную изогнутую иглу зонда 38 мм 22 г с шариковидным или грушевидным наконечником (см. Таблицу материалов). Запустите таймер после первого зонда и подождите 5-10 минут, прежде чем вставлять следующую мышь, чтобы обеспечить измерения in vivo (шаг 2), всегда поддерживая 1 час после зонда. Оставьте оставшуюся подвеску FITC-декстрана для стандартной кривой. ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после зонда пища может быть заменена, чтобы обеспечить образование фекалий.</li>
</ol>2. Измерение флуоресценции in vivo
<ol><li>Анестезируют мышей через 1 ч после зонда, используя 2,5% изофлуран или альтернативный анестетик. Убедитесь, что животное надлежащим образом обезболито, ущипнув палец ноги или хвост и убедившись, что животное не реагирует.<ol><li>Удалите шерсть с области живота с помощью электробритвы и щедро нанесите офтальмологическую смазывающую мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Затем поместите мышей по отдельности в камеру визуализации, лежащую на спине. ПРИМЕЧАНИЕ: Должна быть включена одна контрольная мышь, которая получает PBS или физиологический раствор вместо FITC-декстрана для учета фона во время визуализации in vivo .</li>
	</ol></li>
	<li>Изображение мышей с помощью флуоресцентной камеры (см. Таблицу материалов). Получите изображения брюшной области, установив длину лазера на 470 нм и разрешение на 2,0 мм.<ol><li>Запустите аппарат и программное обеспечение, нажав и удерживая кнопку запуска . Дайте системе прогреться. ПРИМЕЧАНИЕ: Для прогрева системы может потребоваться 20 минут или более, поэтому машину необходимо запускать рано, чтобы не мешать визуализации мышей через 1 час после зонда.</li>
		<li>Нажмите « Состояние устройства» и убедитесь, что все настроенные устройства показывают «ОК», прежде чем продолжить.</li>
		<li>При необходимости разогрейте соответствующий лазер, щелкнув «Управление лазером», а затем нажав кнопку «Имя лазера» нужного лазера.</li>
		<li>Начните новое исследование, нажав « Новое исследование». Сохраните под соответствующим файлом с нужным именем.</li>
		<li>Нажмите « Параметры исследования», затем введите идентификатор образца и выберите правильный лазер и экспериментируйте.</li>
		<li>Откройте камеру визуализации и поместите животное дорсально на сканирующую пластину. Закрепите конечности и хвост лентой и убедитесь, что нос и рот плотно прилегают к анестезиологической трубке, сохраняя 2,5% изофлурана.</li>
		<li>Отрегулируйте высоту сканирующей пластины так, чтобы область сканирования была немного вентральной от средней линии животного. Отрегулируйте пластину, повернув ручку регулировки внутри камеры визуализации. Закройте и заприте дверцу камеры визуализации.</li>
		<li>Выделите область для сканирования с помощью инструмента «Рисование ». Включите всю ширину живота от чуть выше печени до прямой кишки. Нажмите на инструмент «Изменить », чтобы настроить нарисованную область.</li>
		<li>Установите разрешение сканирования на 2,0 мм и нажмите « Далее». После завершения автоматизации питания убедитесь, что настройки верны, и внесите необходимые коррективы. Нажмите « Пуск », чтобы начать сканирование.</li>
		<li>После завершения сканирования извлеките животное из камеры визуализации и поместите его в инкубатор для поддержания температуры тела во время восстановления после анестезии.</li>
		<li>Нажмите « Продолжить исследование », чтобы сохранить настройки, а затем повторяйте шаги 2.2.5-2.2.10, пока все мыши не будут просканированы.</li>
		<li>Нажмите кнопку питания и удерживайте ее в течение 3 секунд, чтобы выключить камеру визуализации.</li>
	</ol></li>
	<li>Оцените флуоресценцию, сравнив брюшную флуоресценцию каждого животного и контрольной мыши на равномерно масштабированных изображениях с использованием программного обеспечения, связанного с используемой системой визуализации (см. Таблицу материалов).<ol><li>Откройте файлы изображений, найдя их под выбранным именем файла. Откройте все файлы с синхронизированными настройками одновременно.</li>
		<li>С помощью панели инструментов параметров изображения используйте кнопки « Синхронизировать изображение » и «Синхронизировать масштаб», чтобы синхронизировать настройки изображений, обеспечивая точное сравнение.</li>
		<li>Сохраните изображения с их скорректированным масштабом.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Измерение флуоресценции в образцах фекалий и плазмы
<ol><li>Соберите гранулы кала от каждой мыши в стерильную пробирку через 4 ч после зонда. Держите трубки в темноте на льду.</li>
	<li>Анестезируют мышей внутрибрюшинной инъекцией 240 мг/мл пентобарбитала натрия (разведение 1:100; см. Таблицу материалов). Вводят в дозе 0,03 мл/г массы тела.<ol><li>Соберите образцы крови объемом не менее 700 мкл в пробирку, предназначенную для сбора плазмы, содержащей гепарин или ЭДТА, для предотвращения свертывания крови (см. Таблицу материалов), вставив стеклянную капиллярную трубку в ретроорбитальное сплетение14. ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные методы забора крови включают пункцию сердца или удаление из хвостовой вены. Поскольку это терминальная процедура, мышей необходимо усыпить с помощью вывиха шейки матки или альтернативного гуманного метода. Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных по эвтаназии.</li>
	</ol></li>
	<li>Центрифугируйте образцы крови при 9,390 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Переложите плазму в новую стерильную пробирку и держите ее в темноте на льду.</li>
	<li>Разбавьте 50 мг образцов кала в 200 мкл 1x PBS и разбавьте плазму 1:2 1x PBS. Коэффициент разбавления может быть изменен в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала.</li>
	<li>Постройте стандартную кривую, используя последовательные разбавления FITC-декстрана в 1x PBS. Начиная с самой высокой концентрации декстрана FITC 20 мг·мл-1, разбавляйте в 1:1 серийно 7-10 раз. ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, концентрации должны составлять 20 мг·мл-1, 10 мг·мл-1, 5 мг·мл-1, 2,5 мг·мл-1, 1,25 мг·мл-1, 0,625 мг·мл-1, 0,3125 мг·мл-1 и т.д.</li>
	<li>Планшет 100 мкл образцов и стандартов в непрозрачной черной 96-луночной пластине. Включите пробел PBS. Считайте флуоресценцию на считывателе флуоресцентных пластин (см. Таблицу материалов) с поглощением при 530 нм и возбуждением при 485 нм. ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы и стандарты могут быть покрыты в двух или трех экземплярах, а затем их значения флуоресценции усредняются.</li>
	<li>Определите концентрацию FITC-декстрана на образец, сравнив флуоресценцию с известными концентрациями стандартной кривой. В пробах умножьте концентрацию на коэффициент разбавления (этап 3.5).</li>
</ol>

<ol>
	<li>K&#246;nig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+barrier+function+in+health+and+disease.">Human intestinal barrier function in health and disease.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).</li><li>Lorenzo-Zuniga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+I+improves+intestinal+barrier+function+in+cirrhotic+rats.">Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats.</a> Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).</li><li>Schwarz, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIGHT+signals+directly+to+intestinal+epithelia+to+cause+barrier+dysfunction+via+cytoskeletal+and+endocytic+mechanisms.">LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms.</a> Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).</li><li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis.">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li><li>Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+translocation+and+changes+in+the+intestinal+microbiome+in+mouse+models+of+liver+disease.">Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease.</a> Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).</li><li>Galipeau, H. J., Verdu, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+task+of+measuring+intestinal+permeability+in+basic+and+clinical+science.">The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science.</a> Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).</li><li>Bordoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+an+electrolyzed+reduced+water+on+gut+permeability,+fecal+microbiota+and+liver+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease.">Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).</li><li>Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+is+reduced+and+IL-10+levels+are+increased+in+septic+IL-6+knockout+mice.">Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).</li><li>Crapser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+induces+gut+permeability+and+enhances+bacterial+translocation+leading+to+sepsis+in+aged+mice.">Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice.</a> Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).</li><li>Mal Earley, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+alters+the+intestinal+microbiome+and+increases+gut+permeability+and+bacterial+translocation.">Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation.</a> PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut+microbiota+from+autism+spectrum+disorder+promote+behavioral+symptoms+in+mice.">Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice.</a> Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).</li><li>Schroeder, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+or+fiber+protects+against+diet-induced+microbiota-mediated+colonic+mucus+deterioration.">Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).</li><li>Hajjar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+colonic+healing+and+surgical+recovery+with+perioperative+supplementation+of+inulin+and+galacto-oligosaccharides.">Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides.</a> Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Blood+Withdrawal+I.">Lab Animal Research. Blood Withdrawal I.</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Costantini, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+intestinal+injury+using+a+novel+in+vivo,+near-infrared+imaging+technique.">Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique.</a> Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).</li><li>Thevaranjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+microbial+dysbiosis+promotes+intestinal+permeability,+systemic+inflammation,+and+macrophage+dysfunction.">Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+intestinal+permeability.">Alterations in intestinal permeability.</a> Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).</li><li>von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+intestinal+permeability+in+Crohn's+disease+patients+using+orally+administered+52Cr-EDTA.">Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA.</a> PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).</li><li>Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+and+blood+correlates+of+reduced+functional+connectivity+in+mild+cognitive+impairment.">Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment.</a> Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет раскрытия информации.

Барьерная функция кишечника является неотъемлемой частью многих различных болезненных процессов. Таким образом, оценка кишечной проницаемости неинвазивным, экономически эффективным и поддающимся количественной оценке способом имеет важное значение для точного представления этих заболеваний на животных моделях. Анализ FITC-декстрана предоставляет возможность для такого представления. Однако этот протокол включает в себя несколько важных шагов, которые необходимо выполнить точно для получения надежных результатов. Во-первых, важно обеспечить использование FITC-декстрана соответствующего размера. Для исследования проницаемости in vivo оптимальной молекулярной массой является FITC-декстран 4 кДа, и по мере увеличения молекулярной массы проницаемость уменьшаетсяв 15 раз. Таким образом, использование FITC-декстрана другой молекулярной массы может привести к запутанным или ненадежным результатам. Кроме того, важно отмечать время каждого зонда и соответствующим образом корректировать временные точки для сбора данных in vivo и сбора плазмы и фекалий. Например, если две мыши находятся на расстоянии 10 минут друг от друга, показания флуоресценции in vivo и сбор фекалий и плазмы также должны происходить с интервалом в 10 минут. Сравнение флуоресценции в одни и те же моменты времени позволяет более точно представить различия в проницаемости. Кроме того, порядок, в котором тестируются животные из разных групп, должен чередоваться, чтобы предотвратить эффект кластеризации из-за времени. Вместо того, чтобы сначала тестировать всех животных в группе A, а затем всех животных во второй группе B (AAABBB), рекомендуется переключать группу после каждого животного (ABABAB).
Этот анализ может быть изменен, чтобы включать только оценку образцов плазмы и фекалий, если нет доступа к аппарату визуализации. Хотя прямая флуоресцентная визуализация in vivo позволяет визуализировать потребление печени и остаточную абдоминальную флуоресценцию, оценка флуоресценции в образцах плазмы и фекалий по-прежнему обеспечивает количественное измерение проницаемости кишечника. Кроме того, как показал описанный эксперимент, уровни флуоресценции в плазме и кале хорошо коррелируют с визуализацией in vivo . Кроме того, этот анализ может быть модифицирован, чтобы включить только визуализацию in vivo . Это позволяет сохранить животных в живых, чтобы продолжить тестирование других параметров или следить за тем, как проницаемость кишечника изменяется с течением времени. Таким образом, возможность модифицировать этот анализ делает его доступным, но все же количественным. Наконец, дозировка 200 мкл 80 мг · мл -1 FITC-декстрана , вводимая каждой мыши, использовалась ранее и показала свою эффективность у мышей с небольшими различиями в массе тела16. Кроме того, важно отметить, что все мыши, использованные в репрезентативном разделе результатов, весили примерно 20 г, что позволяло использовать одинаковую дозировку для каждой мыши. Однако для учета различий в массе тела ФИТК-декстран можно вводить в дозировке 0,6-0,8 мг/г массы тела, например17. Важно отметить, что, независимо от используемой дозировки, важно ограничить количество зонда для каждой мыши до менее чем 10 мл · кг-1 , чтобы предотвратить осложнения или дискомфорт18.
Хотя анализ FITC-декстрана является эффективным методом оценки барьерной функции кишечника, он все же имеет некоторые ограничения. Одним из ограничений этой модели является то, что она требует голодания мышей в течение нескольких часов, а это означает, что ненадежно сравнивать эти результаты с результатами мышей, которые не голодали. Кроме того, голодание может повлиять на результаты в некоторых моделях, требующих строгого графика кормления, например, при измерении уровня глюкозы в крови на животных моделях диабета.
Несмотря на эти ограничения, анализ FITC-декстрана остается эффективным методом анализа кишечной проницаемости, поскольку он является количественным, универсальным, экономически эффективным и менее инвазивным, чем многие классические методы. Например, обычными зондами, используемыми для измерения проницаемости кишечника, являются небольшие датчики сахаридов или Cr-EDTA, которые имеют некоторые преимущества19. Однако некоторые датчики сахаридов имеют только региональную проницаемость. Поскольку они гидролизуются в дистальном отделе тонкой кишки, они не дают представления о проницаемости толстой кишки19. С другой стороны, Cr-EDTA может предоставить информацию о проницаемости толстой кишки, но требует измерений в течение 24 часов, что делает временную нагрузку этого метода намного выше, чем у анализа FITC-декстрана20. Кроме того, ни один из этих методов не обеспечивает прямой визуализации этого анализа in vivo . Таким образом, анализ FITC-декстрана обеспечивает относительно простой, прямой и эффективный вариант по сравнению с альтернативными методами измерения проницаемости кишечника.
Наконец, при таких патологических процессах, как ВЗК4, болезнь Альцгеймера21 и заболевание печени2, проницаемость кишечника является важным параметром, который можно измерить с помощью анализа FITC-декстрана для улучшения исследований. Например, при разработке новых методов лечения, таких как иммунотерапия для ВЗК, этот анализ может быть использован для проверки эффективности терапевтического средства для поддержания целостности кишечного барьера. Учитывая, что нарушение барьерной функции кишечника может быть связано с увековечиванием хронического воспаления при ЯК, например, важно изучить, насколько хорошо терапевтическое средство защищает от повышенной проницаемости4. Это только один пример, но анализ FITC-декстрана является доступным и поддающимся количественной оценке способом измерения проницаемости кишечника во многих различных областях и аспектах исследований.

Кишечный барьер играет важную роль как в здоровье, так и в болезнях. Это требует сложного баланса между тем, чтобы позволить необходимым питательным веществам проникать в кровоток из просвета кишечника и одновременно предотвращать проникновение провоспалительных молекул, таких как патогены или антигены1. Повышенная проницаемость может быть вызвана многими желудочно-кишечными расстройствами, такими как заболевания печени или воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)2,3. Например, при язвенном колите (ЯК), ВЗК, хроническое воспаление приводит к разрушению плотных соединений, последующему нарушению кишечного барьера и транслокации бактерий, потенциально увековечивая воспаление слизистой оболочки и системное воспаление4.
Таким образом, целостность кишечного барьера является важным маркером здоровья кишечника. Однако современные методы измерения проницаемости кишечника имеют много ограничений. Например, методы измерения маркеров воспаления плазмы или бактериальной транслокации в селезенку и лимфатические узлы являются непрямыми 5,6. Другие методы могут быть инвазивными и трудоемкими. В этой статье описывается неинвазивный и экономически эффективный анализ, который непосредственно и количественно измеряет проницаемость кишечника. В этом анализе используется меченный флуоресцеин-изотиоцианатом декстран (FITC-декстран) для отслеживания проницаемости кишечника в режиме реального времени путем измерения флуоресценции in vivo. Кроме того, измерение уровня FITC-декстрана в плазме и кале количественно определяет проницаемость кишечника (рис. 1).
Анализ проницаемости FITC-декстрана ранее использовался во многих различных контекстах, в том числе на животных моделях болезни Паркинсона7, сепсиса8, ишемического инсульта9 и ожоговой травмы10. Кроме того, этот анализ недавно использовался, чтобы помочь понять, как микробиом кишечника может быть вовлечен в различные процессы заболевания и как он может быть нацелен или манипулирован в качестве потенциального терапевтического средства. Например, он использовался для изучения микробиома и терапии на основе микробиома в возрасте11 лет, ВЗК 12, колоректального рака 13 и расстройства аутистического спектра11. Поскольку барьерная функция кишечника участвует во многих аспектах здоровья и болезней, этот анализ широко используется. Его относительная простота и низкая нагрузка по времени делают его идеальным для тестирования условий in vivo, которые, как предполагается, изменяют целостность кишечного барьера. Его количественные результаты полезны для определения эффективности потенциального лечения.
В этом исследовании влияние диеты на барьерную функцию кишечника оценивали с помощью анализа FITC-декстрана. Сравнивали кишечную проницаемость мышей, получавших контрольную диету, и кишечную проницаемость мышей, получавших диету с добавлением инулина. Инулин является полезным олигосахаридом, который, как было показано, улучшает барьерную функцию кишечника12,13. Для измерений флуоресценции in vivo (фон) одна дополнительная необработанная мышь использовалась в качестве отрицательного контроля и получала PBS вместо FITC-декстрана. Этот эксперимент демонстрирует, что анализ FITC-декстрана является ценным инструментом для оценки проницаемости кишечника.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

Целостность кишечного барьера является отличительной чертой здоровья кишечника. В то время как целостность кишечного барьера может быть оценена с помощью косвенных маркеров, таких как измерение маркеров воспаления плазмы и бактериальной транслокации в селезенку и лимфатические узлы, золотой стандарт напрямую количественно оценивает способность выбранных молекул пересекать слой слизистой оболочки кишечника к системному кровообращению. В этой статье используется неинвазивный, экономически эффективный и малонагрузочный метод для количественной оценки и отслеживания в режиме реального времени проницаемости кишечника у мышей с использованием меченного флуоресцеин-изотиоцианатом декстрана (FITC-декстран). Перед пероральным приемом добавок с FITC-декстраном мышей проводят натощак. Затем их продувают FITC-декстраном, разбавленным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Через час после зонда мышей подвергают общей анестезии с использованием изофлурана, а флуоресценция in vivo визуализируется в камере визуализации. Этот метод направлен на оценку остаточной флуоресценции в брюшной полости и печеночного поглощения, что указывает на портальную миграцию флуоресцентного зонда. Образцы крови и стула собирают через 4 часа после перорального зонда, и мышей приносят в жертву. Затем образцы плазмы и фекалий, разбавленные в PBS, покрываются и регистрируется флуоресценция. Затем концентрация декстрана FITC рассчитывается с использованием стандартной кривой. В предыдущих исследованиях визуализация in vivo показала, что флуоресценция быстро распространяется на печень у мышей с более слабым кишечным барьером, вызванным диетой с низким содержанием клетчатки, в то время как у мышей, получавших клетчатку для укрепления кишечного барьера, флуоресцентный сигнал сохраняется в основном в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, в этом исследовании у контрольных мышей наблюдалась повышенная флуоресценция плазмы и сниженная флуоресценция в стуле, в то время как у мышей, получавших инулин, были более высокие уровни сигналов флуоресценции в кишечнике и низкие уровни в плазме. Таким образом, этот протокол обеспечивает качественные и количественные измерения проницаемости кишечника в качестве маркера здоровья кишечника.

Анализ флуоресценции in vivo показал, что мыши, получавшие только контрольную диету, имели более высокое потребление FITC-декстрана в печени и более высокие уровни остаточной флуоресценции в брюшной полости по сравнению с мышами, получавшими диету с добавлением инулина (рис. 2А). Некоторая флуоресценция была видна в слепой кишке мышей, получавших инулиновую диету, но потребление печени было незначительным или отсутствовало, что указывает на то, что эти диеты защищали от повышенной проницаемости кишечника.
Уровни флуоресценции в образцах плазмы и фекалий усиливают и количественно оценивают их аналоги in vivo . Мыши, получавшие диету с добавлением инулина, имели значительно более низкие уровни FITC-декстрана в плазме по сравнению с мышами, получавшими только контрольную диету (рис. 2B). Это указывает на то, что у них улучшилась барьерная функция кишечника, потому что меньшее количество FITC-декстрана могло проникать через кишечный барьер в кровоток. Соответственно, мыши, получавшие инулиновую диету, имели значительно более высокие уровни FITC-декстрана в фекалиях, чем мыши, получавшие только контрольную диету (рис. 2C). Это подтверждает, что у них была неповрежденная барьерная функция кишечника, поскольку FITC-декстран оставался в толстой кишке до экскреции, что считается нормальным. Более низкие уровни FITC-декстрана в фекалиях контрольных мышей указывают на то, что он проникал через кишечный барьер в кровоток, а не выводился надлежащим образом. Высокие уровни FITC-декстрана в плазме подтверждают этот вывод.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Рисунок 2: Пищевые добавки с инулином уменьшают транслокацию FITC-декстрана через кишечный барьер. (A) Остаточная флуоресценция и печеночное поглощение FITC-декстрана. Красный = самая высокая интенсивность; темно-фиолетовый = самая низкая интенсивность. Максимальная флуоресценция 2,15 х 103, минимальная флуоресценция 0,378. (B) Плазматическая концентрация FITC-декстрана. P = 0,010. (C) Фекальная концентрация FITC-декстрана. P = 0,00003. N = 4 на группу. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Каждая точка обозначает одну мышь. Непарный t-критерий Стьюдента. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

В настоящем исследовании меченый флуоресцеин-изотиоцианатом декстран вводят мышам через ротовой зонд для оценки проницаемости кишечника как in vivo, так и в образцах плазмы и фекалий. Поскольку барьерная функция кишечника затрагивается во многих болезненных процессах, этот прямой и количественный анализ может быть использован в различных областях исследований.

Оценка целостности кишечного барьера у мышей с использованием меченного флуоресцеин-изотиоцианатом декстрана

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Этот метод помогает ответить на вопросы о том, изменяет ли состояние целостность кишечного барьера, или на вопросы о том, может ли потенциальное лечение поддерживать целостность кишечного барьера. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предлагает неинвазивный метод с низкой нагрузкой для оценки и количественной оценки проницаемости кишечника in vivo. Для начала постите мышей в течение четырех часов, затем введите 200 микролитров суспензии FITC-декстрана через ротовой зонд каждой мыши, используя 38-миллиметровую стерилизованную иглу изогнутого зонда 22-го калибра.Запустите таймер после первого зонда и подождите от пяти до 10 минут между каждым зондом, чтобы обеспечить измерения in vivo, сохраняя один час после зонда. Оставьте оставшуюся подвеску FITC-декстрана для стандартной кривой. Запустите машину и программное обеспечение, нажав и удерживая кнопку запуска, и дайте системе прогреться.Нажмите «Состояние устройства» и убедитесь, что все настроенные устройства показывают «ОК», прежде чем продолжить. Затем нажмите «Новое исследование» и сохраните файл с нужным именем. Затем нажмите «Параметры обучения».Введите идентификатор образца, выберите правильный лазер и поэкспериментируйте. Затем удалите мех с области живота с помощью электробритвы и щедро нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Откройте камеру визуализации и поместите животное дорсально на сканирующую пластину.Затем закрепите конечности и хвост скотчем. Затем выберите область для сканирования с помощью инструмента «Рисование». Убедитесь, что вы включили всю ширину живота от чуть выше печени до прямой кишки.Затем нажмите на инструмент «Изменить», чтобы настроить область после рисования. Установите разрешение сканирования на 2.0 миллиметра и нажмите «Пуск», чтобы начать сканирование. Затем откройте файлы изображений, найдя их под выбранным именем файла, и одновременно откройте все файлы с синхронизированными настройками.Используя панель инструментов параметров изображения, используйте кнопки «Синхронизировать изображение» и «Синхронизировать масштаб», чтобы синхронизировать настройки изображения для точного сравнения. Затем сохраните изображения с отрегулированными масштабами. Сравните брюшную флуоресценцию каждого животного и контрольной мыши на равномерно масштабированных изображениях с помощью программного обеспечения, связанного с системой визуализации.Соберите гранулы фекалий от каждой мыши в стерильную пробирку через четыре часа после зонда. Затем держите трубки на льду и поместите их в темноту. Затем центрифугируют образцы крови при 9 390 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.Затем переложите плазму в новую стерильную пробирку и держите ее на льду в темноте. Разведите 50 миллиграммов образцов фекалий в 200 микролитрах PBS и разбавьте плазму PBS в соотношении один к двум. Пластина 100 микролитровых образцов и стандартов в непрозрачной черной 96-луночной пластине.Считывание флуоресценции на считывателе флуоресцентных пластин с возбуждением при 485 нанометрах и поглощением при 530 нанометрах. Наконец, определите концентрацию FITC-декстрана на образец, сравнив флуоресценцию с известными концентрациями стандартной кривой. Анализ флуоресценции in vivo показал, что мыши, получавшие только контрольную диету, имели более высокое потребление FITC-декстрана в печени и более высокие уровни остаточной флуоресценции в брюшной полости по сравнению с мышами, получавшими диету с добавлением инулина.Мыши, получавшие диету с добавлением инулина, имели значительно более низкие уровни FITC-декстрана в плазме по сравнению с мышами, получавшими только контрольную диету. Соответственно, мыши, получавшие инулиновую диету, имели значительно более высокие уровни FITC-декстрана в фекалиях, чем мыши, получавшие только контрольную диету. Более низкие уровни FITC-декстрана в фекалиях контролируемых мышей указывают на то, что он проникал через кишечный барьер в кровоток, а не выводился надлежащим образом.Высокие уровни FITC-декстрана в плазме подтвердили это открытие. Время имеет важное значение при попытке этой процедуры. Флуоресцентное считывание и сбор образцов должны происходить как можно ближе к одному часу и четырем часам после зонда для каждой отдельной мыши.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Извлечение ДНК из Gut микробы Термит (Zootermopsis Angusticollis) и Визуализация Gut Микробы

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Моделирование мышей колит использованием декстрана сульфата натрия (DSS)

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Протокол для использования гена набор обогащения анализ для выявления соответствующих животных модель для трансляционного исследования

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Метод оценки бактериоциновых эффектов на кишечную микробиоту мышей

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Лаборатория протокол для генетических кишки содержание анализа водных макробеспозвоночных использование конкретных групп рДНК грунтовки

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Высок объём измерения кишки транзитного времени используя личиночной данио рерио

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Оценка метаболических эффектов изокалорийного 2:1 Прерывистый пост у мышей

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...