Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (subvención RGPIN-2018-06442 a MMS). Agradecemos a la instalación de animales en el CRCHUM y al Dr. Junzheng Peng de la Plataforma de Fenotipado Cardiovascular.

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado de Animales del CRCHUM. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra BALB/c de ocho semanas de edad, obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). Los animales recibieron suplementos dietéticos con 10% de inulina en peso / peso durante 2 semanas. Un grupo de control recibió una dieta similar que carecía del suplemento de inulina. Los ratones tenían acceso ad libitum a la dieta. En la figura 1 se muestra una descripción general del ensayo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del ensayo FITC-dextrano. T-4- 4 h antes del sonda nasogástrica, se eliminó el acceso a los alimentos. T0- FITC-dextrano se administró por sonda nasogástrica oral. T1 - 1 h post sonda nasogástrica, se evaluó la fluorescencia in vivo . T4- 4 h después del sonda nasogástrica, se recogieron las muestras fecales y plasmáticas, y se midió la fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Administración de FITC-dextrano
<ol><li>Antes de administrar FITC-dextrano, ayune los ratones durante 4 h mientras mantiene el acceso ad libitum al agua. NOTA: El ayuno debe iniciarse preferiblemente al comienzo del ciclo de luz (por la mañana). Los ratones pueden ser transferidos a una nueva jaula sin ropa de cama durante el ayuno para limitar la coprofagia.</li>
	<li>Preparar 200 μL de 80 mg·mL−1 4 kDa FITC-dextrano (ver Tabla de materiales) diluido en solución salina estéril 1x tamponada con fosfato (PBS) (por ratón). Prepare las muestras inmediatamente antes de la administración y manténgalas protegidas de la luz.</li>
	<li>Administrar 200 μL de la suspensión de FITC-dextrano por sonda oral a cada ratón utilizando una aguja de sonda nasogástrica esterilizada de 38 mm y 22 G con una punta en forma de bola o pera (ver Tabla de materiales). Inicie un temporizador después del primer sonda nasogástrica y espere 5-10 minutos antes de hacer la siguiente aparición del ratón para permitir mediciones in vivo (paso 2), manteniendo siempre 1 h después de la sonda nasogástrica. Mantenga la suspensión FITC-dextrano restante para la curva estándar. NOTA: Inmediatamente después del sonda nasogástrica, los alimentos pueden ser reemplazados para asegurar la formación de heces.</li>
</ol>2. Medición de fluorescencia in vivo
<ol><li>Anestesiar a los ratones 1 h después del sonda nasogástrica utilizando isoflurano al 2,5% o un anestésico alternativo. Confirme que el animal está anestesiado adecuadamente pellizcando el dedo del pie o la cola y asegurándose de que el animal no reaccione.<ol><li>Retire el pelaje del área abdominal con una afeitadora eléctrica y aplique generosamente ungüento lubricante oftálmico en los ojos para evitar que se seque. Luego, coloque los ratones individualmente en la cámara de imágenes acostada dorsalmente. NOTA: Se debe incluir un ratón de control que reciba PBS o solución salina en lugar de FITC-dextrano para tener en cuenta el fondo durante las imágenes in vivo .</li>
	</ol></li>
	<li>Imagen de los ratones usando una cámara de imágenes de fluorescencia (ver Tabla de materiales). Adquirir imágenes de la región abdominal, ajustando la longitud del láser a 470 nm y la resolución a 2,0 mm.<ol><li>Inicie la máquina y el software haciendo clic y manteniendo presionado el botón de inicio . Permita que el sistema se caliente. NOTA: El sistema puede necesitar 20 minutos o más para calentarse, por lo que la máquina debe iniciarse temprano para no interferir con la obtención de imágenes de los ratones a 1 h después del sonda nasogástrica.</li>
		<li>Haga clic en Estado del dispositivo y asegúrese de que todos los dispositivos configurados muestren "Aceptar" antes de continuar.</li>
		<li>Si es necesario, caliente el láser apropiado haciendo clic en Control láser y luego haciendo clic en el botón Nombre del láser del láser deseado.</li>
		<li>Comience un nuevo estudio haciendo clic en Nuevo estudio. Guarde en el archivo apropiado con el nombre deseado.</li>
		<li>Haga clic en Opciones de estudio, luego ingrese el ID de muestra y elija el láser y el experimento correctos.</li>
		<li>Abra la cámara de imágenes y coloque al animal dorsalmente sobre la placa de escaneo. Asegure las extremidades y la cola con cinta adhesiva, y asegúrese de que la nariz y la boca encajen perfectamente en el tubo de anestesia, manteniendo un 2,5% de isoflurano.</li>
		<li>Ajuste la altura de la placa de escaneo para que la región de escaneo sea ligeramente ventral desde la línea media del animal. Ajuste la placa girando la perilla de ajuste dentro de la cámara de imágenes. Cierre y cierre con llave la puerta de la cámara de imágenes.</li>
		<li>Seleccione el área que desea digitalizar mediante la herramienta Dibujar . Incluya todo el ancho del abdomen desde justo por encima del hígado hasta el recto. Haga clic en la herramienta Modificar para ajustar el área una vez dibujada.</li>
		<li>Establezca la resolución de escaneo en 2.0 mm y luego haga clic en Siguiente. Una vez que se complete la automatización de energía, asegúrese de que la configuración sea correcta y realice los ajustes necesarios. Haga clic en Inicio para comenzar el escaneo.</li>
		<li>Una vez que se complete la exploración, retire al animal de la cámara de imágenes y colóquelo en una incubadora para mantener la temperatura corporal mientras se recupera de la anestesia.</li>
		<li>Haga clic en Continuar estudio para mantener la configuración y, a continuación, repita los pasos 2.2.5-2.2.10 hasta que se hayan escaneado todos los ratones.</li>
		<li>Haga clic en el botón de encendido y manténgalo presionado durante 3 s para apagar la cámara de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Evalúe la fluorescencia comparando la fluorescencia abdominal de cada animal y el ratón control en imágenes de escala uniforme utilizando un software asociado con el sistema de imágenes utilizado (ver Tabla de materiales).<ol><li>Abra los archivos de imagen buscándolos bajo el nombre de archivo elegido. Abra todos los archivos que tienen configuraciones sincronizadas al mismo tiempo.</li>
		<li>Con la barra de herramientas de configuración de imagen, utilice los botones Sincronizar imagen y Sincronizar escala para sincronizar la configuración de las imágenes, lo que permite una comparación precisa.</li>
		<li>Guarde las imágenes con sus escalas ajustadas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medición de fluorescencia en muestras fecales y plasma
<ol><li>Recoger una bolita fecal de cada ratón en un tubo estéril 4 h después de la sonda nasogástrica. Mantenga los tubos en la oscuridad sobre hielo.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de 240 mg/ml de pentobarbital sódico (dilución, 1:100; ver Tabla de materiales). Administrar a una dosis de 0,03 mL/g de peso corporal.<ol><li>Recolectar muestras de sangre de al menos 700 μL en un tubo hecho para la recolección de plasma que contenga heparina o EDTA para prevenir la coagulación (ver Tabla de materiales) insertando un tubo capilar de vidrio en el plexo retroorbitario14. NOTA: Los métodos alternativos para la recolección de sangre incluyen punción cardíaca o retirada de la vena de la cola. Como este es un procedimiento terminal, los ratones deben ser sacrificados a través de la dislocación cervical o un método humano alternativo. Siga las recomendaciones del comité local de ética animal para la eutanasia.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar las muestras de sangre a 9.390 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Transfiera el plasma a un nuevo tubo estéril y manténgalo en la oscuridad sobre hielo.</li>
	<li>Diluir 50 mg de muestras fecales en 200 μL de 1x PBS y diluir el plasma 1:2 con 1x PBS. La relación de dilución se puede modificar en función de la intensidad de la señal de fluorescencia.</li>
	<li>Genere una curva estándar utilizando diluciones seriadas de FITC-dextrano en 1x PBS. Comenzando con la concentración más alta de 20 mg·mL−1 de dextrano FITC, diluir por un factor de 1:1 en serie 7-10 veces. NOTA: Las concentraciones, por lo tanto, deben leer 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2.5 mg·mL−1, 1.25 mg·mL−1, 0.625 mg·mL−1, 0.3125 mg·mL−1, etc.</li>
	<li>Placas de 100 μL de muestras y patrones en una placa negra opaca de 96 pocillos. Incluye un PBS en blanco. Lea la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes (consulte la Tabla de materiales) con la absorción a 530 nm y la excitación a 485 nm. NOTA: Las muestras y los patrones se pueden chapar por duplicado o triplicado, y luego se promedian sus valores de fluorescencia.</li>
	<li>Determinar la concentración de FITC-dextrano por muestra comparando la fluorescencia con las concentraciones conocidas de la curva estándar. En las muestras, multiplicar la concentración por el factor de dilución (paso 3.5).</li>
</ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIGHT+signals+directly+to+intestinal+epithelia+to+cause+barrier+dysfunction+via+cytoskeletal+and+endocytic+mechanisms.">LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms.</a> Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).</li><li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis.">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li><li>Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. 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Los autores declaran que no tienen divulgaciones.

La función de barrera intestinal es una parte integral de muchos procesos de enfermedades diferentes. Por lo tanto, evaluar la permeabilidad intestinal de una manera no invasiva, rentable y cuantificable es esencial para representar con precisión estas enfermedades en modelos animales. El ensayo FITC-dextrano ofrece la posibilidad de esta representación. Sin embargo, este protocolo implica varios pasos críticos que deben completarse con precisión para obtener resultados confiables. En primer lugar, es esencial garantizar el uso de FITC-dextrano del tamaño adecuado. Para examinar la permeabilidad in vivo , 4 kDa FITC-dextrano es el peso molecular óptimo, y a medida que aumenta el peso molecular, la permeabilidad disminuye15. Por lo tanto, el uso de FITC-dextrano de un peso molecular diferente puede proporcionar resultados confusos o poco fiables. Además, es importante anotar el tiempo de cada sonda nasogástrica y ajustar los puntos de tiempo para la recopilación de datos in vivo y la recolección de plasma y heces en consecuencia. Por ejemplo, si dos ratones están separados por 10 minutos, las lecturas de fluorescencia in vivo y la recolección de heces y plasma también deben ocurrir con 10 minutos de diferencia. La comparación de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo permite una representación más precisa de las diferencias en la permeabilidad. Además, el orden en que se someten a ensayo los animales de diferentes grupos debe alternarse para evitar un efecto de agrupación debido al tiempo. En lugar de probar primero a todos los animales del Grupo A, luego a todos los animales del Grupo B en segundo lugar (AAABBB), se recomienda cambiar el grupo después de cada animal (ABABAB).
Este ensayo puede modificarse para incluir solo la evaluación de muestras plasmáticas y fecales si no hay acceso a una máquina de imágenes. Aunque la fluorescencia directa in vivo permite la visualización de la ingesta hepática y la fluorescencia abdominal residual, la evaluación de la fluorescencia en las muestras plasmáticas y fecales todavía proporciona una medición cuantitativa de la permeabilidad intestinal. Además, como lo demuestra el experimento descrito, los niveles de fluorescencia en el plasma y las heces se correlacionan bien con las imágenes in vivo . Además, este ensayo se puede modificar para incluir solo las imágenes in vivo . Esto permite que los animales se mantengan vivos para continuar probando otros parámetros o monitorear cómo cambia la permeabilidad intestinal con el tiempo. La capacidad de modificar este ensayo, por lo tanto, lo hace accesible, pero aún cuantitativo. Finalmente, la dosis de 200 μL de 80 mg·mL−1 de FITC-dextrano administrada a cada ratón ha sido utilizada previamente y ha demostrado ser efectiva en ratones con pequeñas diferencias en el peso corporal16. Además, es importante tener en cuenta que todos los ratones utilizados en la sección de resultados representativos pesaban aproximadamente 20 g, lo que permite utilizar la misma dosis para cada ratón. Sin embargo, para tener en cuenta las diferencias en el peso corporal, FITC-dextrano puede administrarse a una dosis de 0,6-0,8 mg / g de peso corporal, por ejemplo17. Fundamentalmente, independientemente de la dosis utilizada, es importante limitar la cantidad administrada a cada ratón a menos de 10 mL·kg−1 para prevenir complicaciones o molestias18.
Aunque el ensayo FITC-dextrano proporciona un método eficaz para evaluar la función de barrera intestinal, todavía tiene algunas limitaciones. Una limitación de este modelo es que requiere ayunar a los ratones durante varias horas, lo que significa que no es confiable comparar estos resultados con los de ratones que no han sido ayunados. Además, el ayuno puede afectar los resultados en ciertos modelos que requieren horarios de alimentación estrictos, como cuando se mide la glucosa en sangre en modelos animales para la diabetes.
A pesar de estas limitaciones, el ensayo FITC-dextrano sigue siendo un método eficaz para analizar la permeabilidad intestinal, ya que es cuantitativo, versátil, rentable y menos invasivo que muchos métodos clásicos. Por ejemplo, las sondas comunes utilizadas para medir la permeabilidad intestinal son las pequeñas sondas de sacáridos o Cr-EDTA, que tienen algunas ventajas19. Sin embargo, algunas sondas de sacáridos solo tienen permeabilidad específica de la región. Como se hidrolizan en la porción distal del intestino delgado, no proporcionan información sobre la permeabilidad colónica19. Por otro lado, Cr-EDTA puede proporcionar información sobre la permeabilidad colónica, pero requiere mediciones durante 24 h, lo que hace que la carga de tiempo de este método sea mucho mayor que la del ensayo FITC-dextrano20. Además, ninguno de estos métodos proporciona la imagen directa in vivo de este ensayo. Por lo tanto, el ensayo FITC-dextrano proporciona una opción relativamente simple, directa y efectiva en comparación con los métodos alternativos para medir la permeabilidad intestinal.
Finalmente, en procesos de enfermedades como la EII4, la enfermedad de Alzheimer21 y la enfermedad hepática2, la permeabilidad intestinal es un parámetro importante que podría medirse utilizando el ensayo FITC-dextrano para mejorar los estudios. Por ejemplo, en el desarrollo de nuevos tratamientos, como las inmunoterapias para las EII, este ensayo se puede utilizar para probar la eficacia de la terapia para mantener la integridad de la barrera intestinal. Teniendo en cuenta que la función de barrera intestinal deteriorada puede estar implicada en la perpetuación de la inflamación crónica en la CU, por ejemplo, examinar qué tan bien una terapia protege contra el aumento de la permeabilidades importante 4. Este es solo un ejemplo, pero el ensayo FITC-dextrano es una forma accesible y cuantificable de medir la permeabilidad intestinal en muchas áreas y aspectos diferentes de la investigación.

La barrera intestinal juega un papel importante tanto en la salud como en la enfermedad. Requiere un equilibrio complejo entre permitir que los nutrientes requeridos penetren en la circulación desde la luz intestinal y, al mismo tiempo, prevenir la penetración de moléculas proinflamatorias, como patógenos o antígenos1. El aumento de la permeabilidad puede ser causado por muchos trastornos gastrointestinales, como la enfermedad hepática o las enfermedades inflamatorias intestinales (EII)2,3. Por ejemplo, en la colitis ulcerosa (CU), una EII, la inflamación crónica conduce a la ruptura de las uniones estrechas, la posterior interrupción de la barrera intestinal y la translocación de bacterias, perpetuando potencialmente la inflamación mucosa y sistémica4.
La integridad de la barrera intestinal es, por lo tanto, un marcador importante de la salud intestinal. Sin embargo, los métodos actuales para la medición de la permeabilidad intestinal tienen muchas limitaciones. Por ejemplo, los métodos que miden los marcadores inflamatorios plasmáticos o la translocación bacteriana al bazo y los ganglios linfáticos son indirectos 5,6. Otros métodos pueden ser invasivos y requieren mucho tiempo. Este artículo describe un ensayo no invasivo y rentable que mide directa y cuantitativamente la permeabilidad intestinal. Este ensayo utiliza dextrano marcado con fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano) para seguir la permeabilidad intestinal en tiempo real mediante la medición de la fluorescencia in vivo. Además, la medición de los niveles de FITC-dextrano en el plasma y las heces cuantifica la permeabilidad intestinal (Figura 1).
El ensayo de permeabilidad FITC-dextrano se ha utilizado anteriormente en muchos contextos diferentes, incluso en modelos animales de enfermedad de Parkinson7, sepsis8, accidente cerebrovascular isquémico9 y lesión por quemadura10. Además, este ensayo se ha utilizado recientemente para ayudar a comprender cómo el microbioma intestinal puede estar implicado en diferentes procesos de enfermedad y cómo puede ser dirigido o manipulado como una posible terapéutica. Por ejemplo, se ha utilizado para estudiar el microbioma y la terapéutica basada en el microbioma en el envejecimiento 11, las EII12, el cáncer colorrectal13 y el trastorno del espectro autista11. Como la función de barrera intestinal está implicada en numerosos aspectos de la salud y la enfermedad, este ensayo se ha utilizado ampliamente. Su relativa simplicidad y baja carga de tiempo lo hacen ideal para probar las condiciones in vivo que se sospecha que alteran la integridad de la barrera intestinal. Sus resultados cuantitativos son útiles para determinar la efectividad de un tratamiento potencial.
En este estudio, el efecto de la dieta sobre la función de barrera intestinal se evaluó mediante el ensayo FITC-dextrano. Se compararon la permeabilidad intestinal de los ratones que recibieron una dieta de control y la permeabilidad intestinal de los ratones que recibieron una dieta suplementada con inulina. La inulina es un oligosacárido beneficioso que ha demostrado mejorar la función de barrera intestinal12,13. Para las mediciones de fluorescencia in vivo (fondo), se utilizó un ratón adicional no tratado como control negativo y recibió PBS en lugar de FITC-dextrano. Este experimento demuestra que el ensayo FITC-dextrano es una herramienta valiosa para evaluar la permeabilidad intestinal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

La integridad de la barrera intestinal es un sello distintivo de la salud intestinal. Si bien la integridad de la barrera intestinal se puede evaluar utilizando marcadores indirectos como la medición de marcadores inflamatorios plasmáticos y la translocación bacteriana al bazo y los ganglios linfáticos, el estándar de oro cuantifica directamente la capacidad de las moléculas seleccionadas para atravesar la capa mucosa intestinal hacia la circulación sistémica. Este artículo utiliza una técnica no invasiva, rentable y de baja carga para cuantificar y seguir en tiempo real la permeabilidad intestinal en ratones utilizando dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano). Antes de la suplementación oral con FITC-dextrano, los ratones están en ayunas. Luego se gavagan con FITC-dextrano diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una hora después del sonda nasogástrica, los ratones son sometidos a anestesia general usando isoflurano, y la fluorescencia in vivo se visualiza en una cámara de imágenes. Esta técnica tiene como objetivo evaluar la fluorescencia residual en la cavidad abdominal y la captación hepática, lo que sugiere la migración portal de la sonda fluorescente. Las muestras de sangre y heces se recogen 4 h después de la sonda nasogástrica oral, y los ratones son sacrificados. Las muestras plasmáticas y fecales diluidas en PBS se platean y se registra la fluorescencia. La concentración de FITC-dextrano se calcula utilizando una curva estándar. En investigaciones anteriores, las imágenes in vivo han demostrado que la fluorescencia se propaga rápidamente al hígado en ratones con una barrera intestinal más débil inducida por una dieta baja en fibra, mientras que en ratones suplementados con fibra para fortalecer la barrera intestinal, la señal fluorescente se retiene principalmente en el tracto gastrointestinal. Además, en este estudio, los ratones de control tenían fluorescencia plasmática elevada y fluorescencia reducida en las heces, mientras que inversamente, los ratones suplementados con inulina tenían niveles más altos de señales de fluorescencia en el intestino y niveles bajos en el plasma. En resumen, este protocolo proporciona mediciones cualitativas y cuantitativas de la permeabilidad intestinal como marcador de la salud intestinal.

El análisis de la fluorescencia in vivo mostró que los ratones que recibieron solo la dieta de control tenían una mayor ingesta hepática de FITC-dextrano y niveles más altos de fluorescencia residual en la cavidad abdominal en comparación con los ratones que recibieron la dieta suplementada con inulina (Figura 2A). Algo de fluorescencia fue visible en el ciego de los ratones que recibieron la dieta de inulina, pero hubo poca o ninguna ingesta hepática, lo que indica que estas dietas protegieron contra el aumento de la permeabilidad intestinal.
Los niveles de fluorescencia en muestras plasmáticas y fecales trabajan para reforzar y cuantificar sus contrapartes in vivo . Los ratones que recibieron la dieta suplementada con inulina tenían niveles significativamente más bajos de FITC-dextrano en su plasma en comparación con los ratones que recibieron solo la dieta de control (Figura 2B). Esto indica que habían mejorado la función de la barrera intestinal porque menos FITC-dextrano podría penetrar la barrera intestinal en la circulación. Concordantemente, los ratones que recibieron la dieta de inulina tenían niveles significativamente más altos de FITC-dextrano en sus heces que los ratones que recibieron solo la dieta de control (Figura 2C). Esto refuerza que tenían una función de barrera intestinal intacta ya que el FITC-dextrano permaneció en el colon hasta la excreción, como se considera normal. Los niveles más bajos de FITC-dextrano en las heces de los ratones de control indican que penetró a través de la barrera intestinal hacia la circulación en lugar de excretarse adecuadamente. Los altos niveles de FITC-dextrano en el plasma refuerzan este hallazgo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Figura 2: La suplementación dietética con inulina disminuye la translocación de FITC-dextrano a través de la barrera intestinal. (A) La fluorescencia residual y la captación hepática de FITC-dextrano. Rojo = intensidad más alta; púrpura oscuro = intensidad más baja. Fluorescencia máxima de 2,15 x 103, fluorescencia mínima de 0,378. (B) La concentración plasmática de FITC-dextrano. P = 0,010. (C) La concentración fecal de FITC-dextrano. P = 0,00003. N = 4 por grupo. Los datos se representan como media ± SEM. Cada punto representa un ratón. Prueba t de Student no pareada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

En el presente estudio, el dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se administra a ratones a través de sonda oral para evaluar la permeabilidad intestinal tanto in vivo como en muestras plasmáticas y fecales. Como la función de barrera intestinal se ve afectada en muchos procesos de enfermedad, este ensayo directo y cuantitativo se puede utilizar en diversas áreas de investigación.

Evaluación de la integridad de la barrera intestinal en ratones utilizando dextrano marcado con fluoresceína-isotiocianato

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Este método ayuda a responder preguntas sobre si una afección altera la integridad de la barrera intestinal o preguntas sobre si un tratamiento potencial puede mantener la integridad de la barrera intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una técnica no invasiva y de baja carga para evaluar y cuantificar la permeabilidad intestinal in vivo. Para comenzar, ayune los ratones durante cuatro horas, luego administre 200 microlitros de la suspensión FITC-dextrano a través de sonda oral a cada ratón utilizando una aguja de sonda curva esterilizada calibre 22 de 38 milímetros.Inicie un temporizador después del primer sonda y espere de cinco a 10 minutos entre cada sonda para permitir mediciones in vivo, manteniendo una hora después de la sonda nasogástrica. Mantenga la suspensión FITC-dextrano restante para la curva estándar. Inicie la máquina y el software haciendo clic y manteniendo presionado el botón de inicio y permita que el sistema se caliente.Haga clic en Estado del dispositivo y asegúrese de que todos los dispositivos configurados muestren OK antes de continuar. Luego haga clic en Nuevo estudio y guarde el archivo con el nombre deseado. A continuación, haga clic en Opciones de estudio.Ingrese la identificación de la muestra y elija el láser correcto y experimente. Luego retire el pelaje del área abdominal con una afeitadora eléctrica y aplique ungüento veterinario generosamente en los ojos para evitar que se seque. Abra la cámara de imágenes y coloque al animal dorsalmente sobre la placa de escaneo.Luego asegure las extremidades y la cola con cinta adhesiva. A continuación, seleccione el área que desea escanear mediante la herramienta Dibujar. Asegúrese de incluir todo el ancho del abdomen desde justo por encima del hígado hasta el recto.Luego haga clic en la herramienta Modificar para ajustar el área una vez dibujada. Establezca la resolución de escaneo en 2.0 milímetros y haga clic en Inicio para comenzar el escaneo. A continuación, abra los archivos de imagen encontrándolos con el nombre de archivo elegido y abra simultáneamente todos los archivos con la configuración sincronizada.Con la barra de herramientas de configuración de imagen, utilice los botones Sincronizar imagen y Sincronizar escala para sincronizar la configuración de imagen y obtener una comparación precisa. Luego guarde las imágenes con las escalas ajustadas. Compare la fluorescencia abdominal de cada animal y el ratón control en imágenes de escala uniforme utilizando el software asociado con el sistema de imágenes.Recoja una bolita fecal de cada ratón en un tubo estéril cuatro horas después de la sonda nasogástrica. Luego mantenga los tubos en hielo y colóquelos en la oscuridad. A continuación, centrifugar las muestras de sangre a 9, 390 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Luego transfiera el plasma a un nuevo tubo estéril y manténgalo en hielo en la oscuridad. Diluir 50 miligramos de muestras fecales en 200 microlitros de PBS, y diluir el plasma con PBS en una proporción de uno a dos. Placa de muestras de 100 microlitros y estándares en una placa negra opaca de 96 pocillos.Lea la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes con excitación a 485 nanómetros y absorción a 530 nanómetros. Finalmente, determine la concentración de FITC-dextrano por muestra comparando la fluorescencia con las concentraciones conocidas de la curva estándar. El análisis de la fluorescencia in vivo mostró que los ratones que recibieron solo la dieta de control tenían una mayor ingesta hepática de FITC-dextrano y niveles más altos de fluorescencia residual en la cavidad abdominal en comparación con los ratones que recibieron la dieta suplementada con inulina.Los ratones que recibieron la dieta suplementada con inulina tenían niveles significativamente más bajos de FITC-dextrano en su plasma en comparación con los ratones que recibieron solo la dieta de control. Concordantemente, los ratones que recibieron la dieta de inulina tenían niveles significativamente más altos de FITC-dextrano en sus heces que los ratones que recibieron solo la dieta de control. Los niveles más bajos de FITC-dextrano en las heces de los ratones controlados indican que penetró a través de la barrera intestinal hacia la circulación en lugar de excretarse adecuadamente.Los altos niveles de FITC-dextrano en el plasma reforzaron este hallazgo. El tiempo es esencial al intentar este procedimiento. La lectura de fluorescencia y la recolección de muestras deben ocurrir lo más cerca posible de una hora y cuatro horas después del sonda nasogástrica para cada ratón individual.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

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Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales

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Biología

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