Name: assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Detta arbete finansierades av ett bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (bidrag RGPIN-2018-06442 till MMS). Vi tackar djuranläggningen vid CRCHUM och Dr. Junzheng Peng från Cardiovascular Phenotyping Platform.

Alla procedurer utfördes enligt riktlinjerna från Canadian Council on Animal Care efter godkännande av CRCHUM: s institutionella djurvårdskommitté. Åtta veckor gamla kvinnliga BALB / c-möss, erhållna från en kommersiell källa (se materialförteckning), användes för den aktuella studien. Djuren fick kosttillskott med 10% inulin vikt/vikt i 2 veckor. En kontrollgrupp fick en liknande diet som saknade inulintillskottet. Möss hade ad libitum tillgång till kosten. En översikt över analysen visas i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk bild av FITC-dextran-testet. T-4-4 timmar före sondmatning avlägsnades tillgången till föda. T0- FITC-dextran administrerades via oral sondmatning. T1 - 1 timme efter sondmatning utvärderades fluorescensen in vivo . T4-4 timmar efter sondmatning samlades fekal- och plasmaproverna in och fluorescensen mättes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
1. Administrering av FITC-dextran
<ol><li>Innan FITC-dextran administreras, fasta mössen i 4 timmar samtidigt som de behåller ad libitum tillgång till vatten. OBS: Fastan måste helst inledas i början av ljuscykeln (på morgonen). Mössen kan överföras till en ny bur utan strö under fasta för att begränsa koprofagi.</li>
	<li>Bered 200 μl 80 mg·ml−1 4 kDa FITC-dextran (se Materialtabell) utspädd i steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (per mus). Förbered proverna omedelbart före administrering och skydda dem från ljus.</li>
	<li>Administrera 200 μl FITC-dextransuspension via oral sondmatning till varje mus med hjälp av en 38 mm 22 G steriliserad, böjd sondnål med en kul- eller päronformad spets (se Materialförteckning). Starta en timer efter den första sondmatningen och vänta i 5-10 minuter innan du tar hand om nästa mus för att möjliggöra in vivo-mätningar (steg 2), behåll alltid 1 timme efter sondmatningen. Behåll den återstående FITC-dextran-upphängningen för standardkurvan. OBS: Omedelbart efter sondmatningen kan mat ersättas för att säkerställa bildandet av avföring.</li>
</ol>2. Fluorescensmätning in vivo
<ol><li>Bedöva mössen 1 h efter sondmatningen med 2,5% isofluran eller ett alternativt bedövningsmedel. Bekräfta att djuret är lämpligt bedövat genom att nypa tån eller svansen och se till att djuret inte reagerar.<ol><li>Ta bort pälsen från bukområdet med en elektrisk rakapparat och applicera generöst oftalmisk smörjsalva på ögonen för att förhindra torkning. Placera sedan mössen individuellt i bildkammaren som ligger dorsalt. OBS: En kontrollmus måste inkluderas som tar emot PBS eller saltlösning istället för FITC-dextran för att ta hänsyn till bakgrunden under in vivo-avbildning .</li>
	</ol></li>
	<li>Avbilda mössen med hjälp av en fluorescensbildningskammare (se Materialförteckning). Ta bilder av bukregionen, ställ in laserlängden på 470 nm och upplösningen på 2,0 mm.<ol><li>Starta maskinen och programvaran genom att klicka och hålla ned startknappen . Låt systemet värmas upp. OBS: Systemet kan behöva 20 minuter eller mer för att värmas upp, så maskinen måste startas tidigt för att inte störa avbildningen av mössen vid 1 h efter sondmatning.</li>
		<li>Klicka på Enhetsstatus och se till att alla konfigurerade enheter visar "OK" innan du fortsätter.</li>
		<li>Om det behövs, värm upp lämplig laser genom att klicka på Laserkontroll och klicka sedan på lasernamnknappen för önskad laser.</li>
		<li>Starta en ny studie genom att klicka på Ny studie. Spara under lämplig fil med önskat namn.</li>
		<li>Klicka på Studiealternativ, ange sedan Specimen ID och välj rätt laser och experiment.</li>
		<li>Öppna bildkammaren och placera djuret dorsalt på skanningsplattan. Säkra lemmarna och svansen med tejp och se till att näsa och mun sitter tätt i anestesiröret och bibehåller 2,5% isofluran.</li>
		<li>Justera skanningsplattans höjd så att skanningsområdet är något ventralt från djurets mittlinje. Justera plattan genom att vrida på justeringsknappen inuti bildkammaren. Stäng och lås bildkammardörren.</li>
		<li>Markera det område som ska genomsökas med hjälp av ritverktyget . Inkludera hela bredden av buken från strax ovanför levern till ändtarmen. Klicka på Ändra verktyg för att justera området när det har ritats.</li>
		<li>Ställ in skanningsupplösningen till 2,0 mm och klicka sedan på Nästa. När strömautomatiseringen är klar kontrollerar du att inställningarna är korrekta och gör de justeringar som behövs. Klicka på Start för att starta skanningen.</li>
		<li>När skanningen är klar, ta bort djuret från bildkammaren och placera det i en inkubator för att bibehålla kroppstemperaturen medan du återhämtar dig från anestesi.</li>
		<li>Klicka på Fortsätt studera för att behålla inställningarna och upprepa sedan steg 2.2.5-2.2.10 tills alla möss har skannats.</li>
		<li>Klicka på strömbrytaren och håll den intryckt i 3 s för att stänga av bildkammaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Utvärdera fluorescensen genom att jämföra bukfluorescensen hos varje djur och kontrollmusen på jämnt skalade bilder med hjälp av en programvara som är associerad med det använda bildsystemet (se materialförteckning).<ol><li>Öppna bildfilerna genom att hitta dem under det valda filnamnet. Öppna alla filer som har synkroniserade inställningar samtidigt.</li>
		<li>Använd verktygsfältet för bildinställningar och använd knapparna Synkronisera bild och Synkronisera skala för att synkronisera inställningarna för bilderna, vilket möjliggör en korrekt jämförelse.</li>
		<li>Spara bilderna med sina justerade skalor.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fluorescensmätning i fekala prover och plasma
<ol><li>Samla en fekal pellet från varje mus i ett sterilt rör 4 timmar efter sondmatning. Håll rören i mörkret på is.</li>
	<li>Bedöva mössen via intraperitoneal injektion av 240 mg/ml pentobarbitalnatrium (spädning, 1:100; se Materialförteckning). Administrera i en dos på 0,03 ml/g kroppsvikt.<ol><li>Samla blodprover på minst 700 μl i ett rör tillverkat för plasmauppsamling innehållande heparin eller EDTA för att förhindra koagulering (se materialtabell) genom att sätta in ett kapillärrör av glas i retroorbital plexus14. OBS: Alternativa metoder för blodinsamling inkluderar hjärtpunktion eller uttag från svansvenen. Eftersom detta är ett terminalt förfarande måste mössen avlivas via cervikal dislokation eller en alternativ human metod. Följ lokala djurförsöksetiska kommittéers rekommendationer för avlivning.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugera blodproverna vid 9,390 x g i 10 min vid rumstemperatur. Överför plasman till ett nytt sterilt rör och håll det i mörkret på is.</li>
	<li>Späd 50 mg fekala prover i 200 μl 1x PBS och späd plasma 1:2 med 1x PBS. Utspädningsfaktorn kan modifieras baserat på fluorescenssignalens intensitet.</li>
	<li>Generera en standardkurva med seriella utspädningar av FITC-dextran i 1x PBS. Börja med den högsta koncentrationen av 20 mg · ml-1 FITC-dextran, späd med en faktor 1: 1 seriellt 7-10 gånger. OBS: Koncentrationerna måste således läsa 20 mg·ml−1, 10 mg·ml−1, 5 mg·ml−1, 2,5 mg·ml−1, 1,25 mg·ml−1, 0,625 mg·ml−1, 0,3125 mg·ml−1, etc.</li>
	<li>Platta 100 μL prover och standarder i en ogenomskinlig svart 96-brunnsplatta. Inkludera ett PBS-ämne. Avläs fluorescensen på en fluorescerande plattläsare (se Materialförteckning) med absorptionen vid 530 nm och excitationen vid 485 nm. OBS: Proverna och standarderna kan pläteras i två eller tre exemplar, och sedan beräknas deras fluorescensvärden.</li>
	<li>Bestäm koncentrationen av FITC-dextran per prov genom att jämföra fluorescensen med de kända koncentrationerna i standardkurvan. Multiplicera koncentrationen med utspädningsfaktorn (steg 3.5) i proverna.</li>
</ol>

<ol>
	<li>K&#246;nig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+barrier+function+in+health+and+disease.">Human intestinal barrier function in health and disease.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).</li><li>Lorenzo-Zuniga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+I+improves+intestinal+barrier+function+in+cirrhotic+rats.">Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats.</a> Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).</li><li>Schwarz, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIGHT+signals+directly+to+intestinal+epithelia+to+cause+barrier+dysfunction+via+cytoskeletal+and+endocytic+mechanisms.">LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms.</a> Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).</li><li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis.">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li><li>Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+translocation+and+changes+in+the+intestinal+microbiome+in+mouse+models+of+liver+disease.">Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease.</a> Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).</li><li>Galipeau, H. J., Verdu, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+task+of+measuring+intestinal+permeability+in+basic+and+clinical+science.">The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science.</a> Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).</li><li>Bordoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+an+electrolyzed+reduced+water+on+gut+permeability,+fecal+microbiota+and+liver+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease.">Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).</li><li>Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+is+reduced+and+IL-10+levels+are+increased+in+septic+IL-6+knockout+mice.">Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).</li><li>Crapser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+induces+gut+permeability+and+enhances+bacterial+translocation+leading+to+sepsis+in+aged+mice.">Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice.</a> Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).</li><li>Mal Earley, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+alters+the+intestinal+microbiome+and+increases+gut+permeability+and+bacterial+translocation.">Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation.</a> PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut+microbiota+from+autism+spectrum+disorder+promote+behavioral+symptoms+in+mice.">Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice.</a> Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).</li><li>Schroeder, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+or+fiber+protects+against+diet-induced+microbiota-mediated+colonic+mucus+deterioration.">Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).</li><li>Hajjar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+colonic+healing+and+surgical+recovery+with+perioperative+supplementation+of+inulin+and+galacto-oligosaccharides.">Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides.</a> Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Blood+Withdrawal+I.">Lab Animal Research. Blood Withdrawal I.</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Costantini, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+intestinal+injury+using+a+novel+in+vivo,+near-infrared+imaging+technique.">Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique.</a> Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).</li><li>Thevaranjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+microbial+dysbiosis+promotes+intestinal+permeability,+systemic+inflammation,+and+macrophage+dysfunction.">Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+intestinal+permeability.">Alterations in intestinal permeability.</a> Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).</li><li>von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+intestinal+permeability+in+Crohn's+disease+patients+using+orally+administered+52Cr-EDTA.">Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA.</a> PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).</li><li>Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+and+blood+correlates+of+reduced+functional+connectivity+in+mild+cognitive+impairment.">Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment.</a> Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några avslöjanden.

Tarmbarriärfunktionen är en integrerad del av många olika sjukdomsprocesser. Således är det viktigt att bedöma tarmpermeabiliteten på ett icke-invasivt, kostnadseffektivt och kvantifierbart sätt för att exakt representera dessa sjukdomar i djurmodeller. FITC-dextran-analysen ger möjlighet till denna representation. Detta protokoll innebär dock flera kritiska steg som måste slutföras exakt för att få tillförlitliga resultat. För det första är det viktigt att se till att FITC-dextran används av lämplig storlek. För undersökning av permeabilitet in vivo är 4 kDa FITC-dextran den optimala molekylvikten, och när molekylvikten ökar minskar permeabiliteten15. Således kan användning av FITC-dextran med en annan molekylvikt ge förvirrande eller opålitliga resultat. Dessutom är det viktigt att notera tidpunkten för varje sondmatning och att justera tidpunkterna för datainsamling in vivo och insamling av plasma och avföring i enlighet därmed. Till exempel, om två möss sondas med 10 minuters mellanrum, måste in vivo-fluorescensavläsningarna och insamlingen av avföring och plasma också ske med 10 minuters mellanrum. Att jämföra fluorescensen vid samma tidpunkter möjliggör en mer exakt representation av skillnaderna i permeabilitet. Dessutom bör den ordning i vilken djuren från olika grupper testas alterneras för att förhindra en klustereffekt på grund av tidpunkten. Istället för att testa alla djur i grupp A först, sedan alla djur i grupp B andra (AAABBB), rekommenderas att gruppen byts ut efter varje djur (ABABAB).
Denna analys kan modifieras för att endast inkludera utvärdering av plasma- och fekalprover om det saknas tillgång till en bildmaskin. Även om direkt fluorescensavbildning in vivo möjliggör visualisering av leverintag och kvarvarande bukfluorescens, ger utvärdering av fluorescens i plasma och fekalprover fortfarande en kvantitativ mätning av tarmpermeabiliteten. Dessutom, som demonstrerats av det beskrivna experimentet, korrelerar fluorescensnivåerna i plasma och avföring väl med in vivo-avbildningen. Dessutom kan denna analys modifieras för att endast inkludera in vivo-avbildning . Detta gör att djuren kan hållas vid liv för att fortsätta testa andra parametrar eller övervaka hur tarmpermeabiliteten förändras över tiden. Möjligheten att modifiera denna analys gör den därför tillgänglig, men ändå kvantitativ. Slutligen har doseringen av 200 μl 80 mg·ml−1 FITC-dextran som ges till varje mus använts tidigare och visat sig vara effektiv hos möss med små skillnader i kroppsvikt16. Dessutom är det viktigt att notera att alla möss som användes i avsnittet representativa resultat vägde cirka 20 g, vilket gör att samma dos kan användas för varje mus. För att ta hänsyn till skillnader i kroppsvikt kan FITC-dextran administreras i en dos av 0,6-0,8 mg/g kroppsvikt, till exempel17. Oavsett vilken dos som används är det viktigt att begränsa mängden som sonderas till varje mus till mindre än 10 ml · kg-1 för att förhindra komplikationer eller obehag18.
Även om FITC-dextran-analysen ger en effektiv metod för att utvärdera tarmbarriärfunktionen, har den fortfarande vissa begränsningar. En begränsning med denna modell är att den kräver fasta mössen i flera timmar, vilket innebär att det är opålitligt att jämföra dessa resultat med de från möss som inte har fastats. Dessutom kan fasta påverka resultaten i vissa modeller som kräver strikta utfodringsscheman, till exempel vid mätning av blodsocker i djurmodeller för diabetes.
Trots dessa begränsningar är FITC-dextran-analysen fortfarande en effektiv metod för att analysera tarmpermeabilitet eftersom den är kvantitativ, mångsidig, kostnadseffektiv och mindre invasiv än många klassiska metoder. Vanliga sonder som används för att mäta tarmpermeabilitet är till exempel små sackaridprober eller Cr-EDTA, som har vissa fördelar19. Vissa sackaridsonder har dock endast regionspecifik permeabilitet. Eftersom de hydrolyseras i den distala delen av tunntarmen, ger de ingen inblick i kolonpermeabilitet19. Å andra sidan kan Cr-EDTA ge information om kolonpermeabilitet men kräver mätningar i 24 timmar, vilket gör tidsbördan för denna metod mycket högre än för FITC-dextrananalys20. Dessutom tillhandahåller ingen av dessa metoder direkt in vivo-avbildning av denna analys. Därför ger FITC-dextran-analysen ett relativt enkelt, direkt och effektivt alternativ jämfört med alternativa metoder för mätning av tarmpermeabilitet.
Slutligen, i sjukdomsprocesser som IBD4, Alzheimers sjukdom21 och leversjukdom2, är tarmpermeabilitet en viktig parameter som kan mätas med hjälp av FITC-dextran-analysen för att förbättra studierna. Till exempel, vid utveckling av nya behandlingar, såsom immunterapier för IBD, kan denna analys användas för att testa effekten av den terapeutiska för att upprätthålla tarmbarriärens integritet. Med tanke på att nedsatt tarmbarriärfunktion kan vara inblandad i att upprätthålla den kroniska inflammationen vid UC, till exempel, är det viktigt att undersöka hur väl en terapeutisk skyddar mot ökad permeabilitet4. Detta är bara ett exempel, men FITC-dextran-analysen är ett tillgängligt och kvantifierbart sätt att mäta tarmpermeabilitet inom många olika områden och aspekter av forskning.

Tarmbarriären spelar en viktig roll för både hälsa och sjukdom. Det kräver en komplex balans mellan att låta de nödvändiga näringsämnena tränga in i cirkulationen från tarmlumen och samtidigt förhindra penetrering av proinflammatoriska molekyler, såsom patogener eller antigener1. Ökad permeabilitet kan orsakas av många gastrointestinala störningar, såsom leversjukdom eller inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD)2,3. Till exempel, vid ulcerös kolit (UC), en IBD, leder kronisk inflammation till nedbrytning av snäva korsningar, efterföljande störning av tarmbarriären och translokation av bakterier, vilket potentiellt upprätthåller mukosal och systemisk inflammation4.
Tarmbarriärens integritet är därför en viktig markör för tarmhälsa. Nuvarande metoder för mätning av tarmpermeabilitet har dock många begränsningar. Till exempel är metoder som mäter plasmainflammatoriska markörer eller bakteriell translokation till mjälte och lymfkörtlar indirekta 5,6. Andra metoder kan vara invasiva och tidskrävande. Denna artikel beskriver en icke-invasiv och kostnadseffektiv analys som direkt och kvantitativt mäter tarmpermeabiliteten. Denna analys använder fluorescein-isotiocyanatmärkt dextran (FITC-dextran) för att följa tarmpermeabiliteten i realtid genom att mäta fluorescens in vivo. Dessutom kvantifierar mätning av FITC-dextrannivåer i plasma och avföring tarmpermeabiliteten (figur 1).
FITC-dextran-permeabilitetsanalysen har tidigare använts i många olika sammanhang, bland annat i djurmodeller av Parkinsons sjukdom7, sepsis8, ischemisk stroke9 och brännskada10. Dessutom har denna analys nyligen använts för att hjälpa till att förstå hur tarmmikrobiomet kan vara inblandat i olika sjukdomsprocesser och hur det kan riktas eller manipuleras som en potentiell terapeutisk. Det har till exempel använts för att studera mikrobiomet och mikrobiombaserade terapier vid åldrande 11, IBD 12, kolorektal cancer13 och autismspektrumstörning11. Eftersom tarmbarriärfunktionen är inblandad i många aspekter av hälsa och sjukdom har denna analys använts i stor utsträckning. Dess relativa enkelhet och låga tidsbörda gör den idealisk för att testa in vivo-förhållanden som misstänks förändra tarmbarriärens integritet. Dess kvantitativa resultat är användbara för att bestämma effektiviteten av en potentiell behandling.
I denna studie utvärderades effekten av kost på tarmbarriärfunktionen med hjälp av FITC-dextran-analysen. Tarmens permeabilitet hos möss som fick en kontrolldiet och tarmpermeabiliteten hos möss som fick en inulinkompletterad diet jämfördes. Inulin är en fördelaktig oligosackarid som har visat sig förbättra tarmbarriärfunktionen12,13. För fluorescensmätningar in vivo (bakgrund) användes ytterligare en obehandlad mus som negativ kontroll och fick PBS istället för FITC-dextran. Detta experiment visar att FITC-dextran-analysen är ett värdefullt verktyg för att utvärdera tarmpermeabiliteten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (10% Inulin)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190651</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ppm Fe Diet (FeSO4)</td>
			<td>Envigo Teklad</td>
			<td>TD.190723</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Mice 49-55 Days, Female</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>Representative Results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For gavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>365965</td>
			<td>For plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5420</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S420KN605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G</td>
			<td>Harvard Apparatus Canada</td>
			<td>34-024</td>
			<td>No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>141704</td>
			<td>1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 4</td>
			<td>TdB Labs</td>
			<td>20550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase Life Science and Research</td>
			<td>2501</td>
			<td>For retro-orbital blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniARCO Clipper Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>For hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optix MX2 and Optix Optiview</td>
			<td>Advanced Research Technologies</td>
			<td>2.02.00.6</td>
			<td>Fluorescence imaging machine and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>311-010-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td>Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Multiplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086376</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of gut barrier integrity in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran

Tarmbarriärens integritet är ett kännetecken för tarmhälsan. Medan tarmbarriärens integritet kan bedömas med hjälp av indirekta markörer såsom mätning av plasmainflammatoriska markörer och bakteriell translokation till mjälten och lymfkörtlarna, kvantifierar guldstandarden direkt förmågan hos utvalda molekyler att korsa tarmslemhinnans skikt mot systemisk cirkulation. Denna artikel använder en icke-invasiv, kostnadseffektiv och låg börda teknik för att kvantifiera och följa i realtid tarmpermeabiliteten hos möss med hjälp av fluorescein-isotiocyanatmärkt dextran (FITC-dextran). Före oralt tillskott med FITC-dextran fastas mössen. De sonderas sedan med FITC-dextran utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). En timme efter sondmatningen utsätts mössen för narkos med isofluran och in vivo-fluorescensen visualiseras i en avbildningskammare. Denna teknik syftar till att bedöma kvarvarande fluorescens i bukhålan och leverupptaget, vilket tyder på portalmigration av den fluorescerande sonden. Blod- och avföringsprover samlas in 4 timmar efter oral sondmatning och mössen offras. Plasma- och fekalprover utspädda i PBS pläteras sedan och fluorescensen registreras. Koncentrationen av FITC-dextran beräknas sedan med hjälp av en standardkurva. I tidigare forskning har in vivo-avbildning visat att fluorescens snabbt sprider sig till levern hos möss med en svagare tarmbarriär inducerad av en fiberfattig diet, medan hos möss kompletterade med fiber för att stärka tarmbarriären behålls den fluorescerande signalen mestadels i mag-tarmkanalen. Dessutom hade kontrollmöss i denna studie förhöjd plasmafluorescens och minskad fluorescens i avföringen, medan omvänt hade inulinkompletterade möss högre nivåer av fluorescenssignaler i tarmen och låga nivåer i plasma. Sammanfattningsvis ger detta protokoll kvalitativa och kvantitativa mätningar av tarmpermeabilitet som en markör för tarmhälsa.

Analysen av in vivo-fluorescensen visade att möss som endast fick kontrolldieten hade ett högre leverintag av FITC-dextran och högre nivåer av kvarvarande fluorescens i bukhålan jämfört med mössen som fick den inulinkompletterade kosten (figur 2A). Viss fluorescens var synlig i caecum hos mössen som fick inulindieten, men det fanns lite eller inget leverintag, vilket indikerar att dessa dieter skyddade mot ökad tarmpermeabilitet.
Fluorescensnivåerna i plasma och fekala prover arbetar för att förstärka och kvantifiera deras in vivo-motsvarigheter . Mössen som fick den inulinkompletterade kosten hade signifikant lägre nivåer av FITC-dextran i sin plasma jämfört med mössen som endast fick kontrolldieten (figur 2B). Detta tyder på att de hade förbättrad tarmbarriärfunktion eftersom mindre FITC-dextran kunde tränga igenom tarmbarriären i cirkulationen. Samtidigt hade mössen som fick inulindieten signifikant högre nivåer av FITC-dextran i avföringen än mössen som endast fick kontrolldieten (figur 2C). Detta förstärker att de hade intakt tarmbarriärfunktion eftersom FITC-dextran förblev i tjocktarmen tills utsöndring, vilket anses vara normalt. De lägre nivåerna av FITC-dextran i avföringen hos kontrollmössen indikerar att det trängde igenom tarmbarriären in i cirkulationen snarare än att utsöndras på lämpligt sätt. De höga nivåerna av FITC-dextran i plasma förstärker detta fynd.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg"> Figur 2: Kosttillskott med inulin minskar translokationen av FITC-dextran genom tarmbarriären . a) Kvarvarande fluorescens och leverupptag av FITC-dextran. Röd = högsta intensitet; mörklila = lägsta intensitet. Maximal fluorescens på 2,15 x 103, minsta fluorescens på 0,378. (B) Plasmatisk koncentration av FITC-dextran. P = 0,010. c) Fekal koncentration av FITC-dextran. P = 0,00003. N = 4 per grupp. Data representeras som medelvärde ± SEM. Varje punkt representerar en mus. Oparad elevs t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran at JoVE.com

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

I den aktuella studien administreras fluorescein-isotiocyanatmärkt (FITC) dextran till möss via oral sondmatning för att utvärdera tarmpermeabiliteten både in vivo och i plasma- och fekalprover. Eftersom tarmbarriärfunktionen påverkas i många sjukdomsprocesser kan denna direkta och kvantitativa analys användas inom olika forskningsområden.

Bedömning av tarmbarriärens integritet hos möss med användning av fluorescein-isotiocyanatmärkt dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Denna metod hjälper till att svara på frågor om huruvida ett tillstånd förändrar tarmbarriärens integritet eller frågor om huruvida en potentiell behandling kan upprätthålla tarmbarriärens integritet. Den största fördelen med denna teknik är att den erbjuder en icke-invasiv teknik med låg belastning för att utvärdera och kvantifiera tarmpermeabiliteten in vivo. För att börja, fasta mössen i fyra timmar och administrera sedan 200 mikroliter av FITC-dextran-suspensionen via oral sondmatning till varje mus med en 38 millimeter 22 gauge steriliserad krökt sondnål.Starta en timer efter den första sondmatningen och vänta fem till 10 minuter mellan varje sondmatning för att möjliggöra in vivo-mätningar, med bibehållen en timme efter sondmatningen. Behåll den återstående FITC-dextran-upphängningen för standardkurvan. Starta maskinen och programvaran genom att klicka och hålla ned startknappen och låt systemet värmas upp.Klicka på Enhetsstatus och se till att alla konfigurerade enheter visar OK innan du fortsätter. Klicka sedan på Ny studie och spara filen med önskat namn. Klicka sedan på Studiealternativ.Ange prov-ID och välj rätt laser och experiment. Ta sedan bort pälsen från bukområdet med en elektrisk rakapparat och applicera veterinärsalva generöst på ögonen för att förhindra torkning. Öppna bildkammaren och placera djuret dorsalt på skanningsplattan.Säkra sedan lemmarna och svansen med tejp. Välj sedan det område som ska skannas med hjälp av ritverktyget. Se till att inkludera hela bredden av buken från strax ovanför levern till ändtarmen.Klicka sedan på Ändra verktyg för att justera området när det har ritats. Ställ in skanningsupplösningen till 2.0 millimeter och klicka på Start för att starta skanningen. Öppna sedan bildfilerna genom att hitta dem under det valda filnamnet och öppna samtidigt alla filer med synkroniserade inställningar.Använd verktygsfältet för bildinställningar och använd knapparna Synkronisera bild och Synkronisera skala för att synkronisera bildinställningarna för en korrekt jämförelse. Spara sedan bilderna med de justerade skalorna. Jämför bukfluorescensen hos varje djur och kontrollmusen på enhetligt skalade bilder med hjälp av programvara som är associerad med bildsystemet.Samla en fekal pellet från varje mus i ett sterilt rör fyra timmar efter sondmatning. Håll sedan rören på is och placera dem i mörkret. Därefter centrifugera blodproverna vid 9 390 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.Överför sedan plasman till ett nytt sterilt rör och håll det på is i mörkret. Späd 50 milligram fekala prover i 200 mikroliter PBS och späd plasman med PBS i ett förhållande mellan en och två. Platta 100 mikroliter prover och standarder i en ogenomskinlig svart 96-brunnsplatta.Läs fluorescensen på en fluorescerande plattläsare med excitation vid 485 nanometer och absorption vid 530 nanometer. Bestäm slutligen koncentrationen av FITC-dextran per prov genom att jämföra fluorescensen med de kända koncentrationerna av standardkurvan. Analysen av in vivo-fluorescensen visade att möss som endast fick kontrolldieten hade ett högre leverintag av FITC-dextran och högre nivåer av kvarvarande fluorescens i bukhålan jämfört med mössen som fick den inulinkompletterade kosten.Mössen som fick den inulinkompletterade kosten hade signifikant lägre nivåer av FITC-dextran i sin plasma jämfört med mössen som bara fick kontrolldieten. Samtidigt hade mössen som fick inulindieten signifikant högre nivåer av FITC-dextran i avföringen än mössen som bara fick kontrolldieten. De lägre nivåerna av FITC-dextran i avföringen hos de kontrollerade mössen indikerar att det trängde igenom tarmbarriären in i cirkulationen snarare än att utsöndras på lämpligt sätt.De höga nivåerna av FITC-dextran i plasma förstärkte detta fynd. Timing är viktigt när du försöker denna procedur. Fluorescensavläsning och provtagning bör ske så nära en timme och fyra timmar efter sondmatning som möjligt för varje enskild mus.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extrahera DNA från tarmen Mikroberna i Termite (Zootermopsis Angusticollis) och visualisering Gut Mikroberna

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Murina kolit modellering med hjälp av dextransulfat Natrium (DSS)

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Märkning av Zebrafish Celler med laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Ett protokoll för att använda gen Set-anrikning analys identifiera den lämplig djurmodell för translationell forskning

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

En metod för att bedöma bakterie-cin-effekter på musens tarmmikrobiota

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokoll för genetiska Gut innehåll analyser av vattenlevande Macroinvertebrates använda gruppspecifika rDNA grundfärger

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studerar ribonucleotid införlivande: Strand-detektering av ribonukleotider i jäst genomet och mäta ribonucleotid-inducerad mutagenes

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Hög genomströmning mätning av Gut transittid använder Larval zebrafiskar

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Bedömning av Zebrafish lins Nucleus lokalisering och Suturural integritet

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Bedömning av de metaboliska effekterna av Isokalori 2:1 intermittent fasta hos möss

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...