Name: evaluation of antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces in vitro
Uploaded: 2023-04-21T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro at JoVE.com

De auteurs waarderen de financiële steun van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 en NSF PIRE 1545852), de National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, de Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) en de UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant toegekend aan Patricia Holt-Torres. De auteurs waarderen de hulp van de Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) bij UC-Riverside voor het gebruik van SEM / EDS en Dr. Perry Cheung voor het gebruik van XRD. De auteurs willen ook Morgan Elizabeth Nator en Samhitha Tumkur bedanken voor hun hulp bij de experimenten en data-analyses. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation of de National Institutes of Health.

Om de directe co-cultuur en directe blootstellingsmethoden te presenteren, gebruiken we magnesiumoxide nanodeeltjes (nMgO) als modelmateriaal om bacteriële interacties aan te tonen. Om de directe kweek- en gerichte contactblootstellingsmethoden te presenteren, gebruiken we een Mg-legering met nanogestructureerde oppervlakken als voorbeelden.
1. Sterilisatie van nanomaterialen
OPMERKING: Alle nanomaterialen moeten worden gesteriliseerd of gedesinfecte...

<ol>
	<li>Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+care-associated+infections+-+An+overview.">Health care-associated infections - An overview.</a> Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).</li><li>O'Connell, K. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combating+multidrug-resistant+bacteria:+Current+strategies+for+the+discovery+of+novel+antibacterials.">Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials.</a> Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).</li><li>Li, B., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+antibiotic+resistance:+New+challenges+and+opportunities+for+implant-associated+orthopedic+infections.">Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).</li><li>Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+enemies?+The+complicated+relationship+between+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus.">Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).</li><li>Adams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifamycin+antibiotics+and+the+mechanisms+of+their+failure.">Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure.</a> The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).</li><li>Harding, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+global+progress+report+on+tuberculosis+elimination.">WHO global progress report on tuberculosis elimination.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).</li><li>Baptista, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+fight+multidrug+resistant+bacteria-&amp;#34;A+battle+of+the+titans&amp;#34.">Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-&amp;#34;A battle of the titans&amp;#34.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).</li><li>Seong, M., Lee, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+against+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium:+Role+of+inner+membrane+dysfunction.">Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction.</a> Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).</li><li>Dasgupta, N., Ramalingam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticle+antimicrobial+activity+explained+by+membrane+rupture+and+reactive+oxygen+generation.">Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation.</a> Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).</li><li>Su, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disruption+of+bacterial+membrane+integrity+through+ROS+generation+induced+by+nanohybrids+of+silver+and+clay.">The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay.</a> Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).</li><li>Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+action+of+bactericidal+gold+nanoparticles+on+Escherichia+coli.">The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli.</a> Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).</li><li>Ranjan, S., Ramalingam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induce+bacterial+membrane+rupture+by+reactive+oxygen+species+generation.">Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation.</a> Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).</li><li>Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+insights+into+antibacterial+activity+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+methicillin+resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).</li><li>Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+bioresorbable+Mg-Zn-Ca+alloy+for+bone+repair+in+a+comparison+study+with+Mg-Zn-Sr+alloy+and+pure+Mg.">Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).</li><li>Lock, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+and+antibacterial+properties+of+magnesium+alloys+in+artificial+urine+for+potential+resorbable+ureteral+stent+applications.">Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).</li><li>Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+MgO+nanostructures+on+magnesium+substrates.">Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates.</a> ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).</li><li>Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+activities+and+mechanisms+of+magnesium+oxide+nanoparticles+(nMgO)+against+pathogenic+bacteria,+yeasts,+and+biofilms.">Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).</li><li>Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+morphological+and+optical+properties+of+MgO+nanoparticles+for+antibacterial+applications.">Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications.</a> Materials Letters. 166, 19-22 (2016).</li><li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+mechanism+of+antibacterial+action+of+magnesium+oxide+nanoparticles+against+foodborne+pathogens.">Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).</li><li>Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+controlled+nano-MgO+and+investigation+of+its+bactericidal+properties.">Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties.</a> Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).</li><li>Hayat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antibiofilm+and+anti-adhesion+effects+of+magnesium+oxide+nanoparticles+against+antibiotic+resistant+bacteria.">In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria.</a> Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Mg(OH)2+nanoparticles+as+an+antibacterial+agent.">Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent.</a> Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).</li><li>Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+antimicrobial+action+of+surface+modified+magnesium+hydroxide+nanoparticles.">Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles.</a> Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+antibacterial+activity+and+related+mechanism+of+a+series+of+Nano-Mg(OH)2.">Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).</li><li>Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+at+biocompatible+dosage+synergistically+increases+bacterial+susceptibility+to+antibiotics.">Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).</li><li>Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+inhibitory+concentration+(MIC)+and+minimum+bactericidal+concentration+(MBC)+of+silver+nanoparticles+against+Staphylococcus+aureus.">The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus.</a> Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).</li><li>Loo, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antimicrobial+activity+of+green+synthesized+silver+nanoparticles+against+selected+gram-negative+foodborne+pathogens.">In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).</li><li>Ali, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+accelerated+green+synthesis+of+stable+silver+nanoparticles+with+Eucalyptus+globulus+leaf+extract+and+their+antibacterial+and+antibiofilm+activity+on+clinical+isolates.">Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates.</a> PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).</li><li>Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+the+antimicrobial+properties+of+carbon+nanostructures.">Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures.</a> Materials. 10 (9), 1066 (2017).</li><li>MTI Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , (2022).</li><li>CHEBI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tris (CHEBI:9754). , (2023).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+Spring+Harbor+Protocols.+Phosphate+buffer.">Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).</li><li>Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+biological+and+chemically+induced+precipitation+of+calcium+phosphate+in+enhanced+biological+phosphorus+removal+systems.">Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems.</a> Water Research. 45, 3744-3752 (2011).</li><li>Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+precipitation+in+biological+phosphorus+removal+systems.">Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems.</a> Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).</li><li>Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-R&#246;mer, R., Feyerabend, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+degradation+under+physiological+conditions+-+Best+practice.">Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice.</a> Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).</li><li>Oyane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+assessment+of+revised+simulated+body+fluids.">Preparation and assessment of revised simulated body fluids.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).</li><li>Xia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+histology+stain+for+rapid+bacterial+endospore+imaging.">Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).</li><li>Pankey, G. A., Sabath, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+bacteriostatic+versus+bactericidal+mechanisms+of+action+in+the+treatment+of+Gram-positive+bacterial+infections.">Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).</li><li>Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+orthopedic+implants+with+emphasis+on+bacterial+adhesion+process+and+techniques+used+in+studying+bacterial-material+interactions.">Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions.</a> Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).</li></ol>

We hebben vier in vitro methoden (A-D) gepresenteerd om de antibacteriële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te karakteriseren. Hoewel elk van deze methoden de groei en levensvatbaarheid van bacteriën in de loop van de tijd kwantificeert als reactie op nanomaterialen, bestaat er enige variatie in de methoden die worden gebruikt om de initiële bacteriële zaaidichtheid, groei en levensvatbaarheid in de loop van de tijd te meten. Drie van deze methoden, de directe cocultuurmethode...

Alleen al in de VS ontwikkelen jaarlijks 1,7 miljoen mensen een ziekenhuisinfectie (HAI), waarbij één op de 17 van deze infecties resulteert in de dood1. Bovendien wordt geschat dat de behandelingskosten voor zorginfecties variëren van $ 28 miljard tot $ 45 miljard per jaar 1,2. Deze zorginfecties worden gedomineerd door methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 en Pseudomonas aeruginosa4, die vaak geïsoleerd zijn van chronische wondinfecties en meestal uitgebreide behandeling en tijd nodig hebben om een gunstig patiëntresultaat te produceren.
In de afgelopen decennia zijn meerdere antibioticaklassen ontwikkeld om infecties te behandelen die verband houden met deze en andere pathogene bacteriën. Rifamycine-analogen zijn bijvoorbeeld gebruikt voor de behandeling van MRSA, andere grampositieve en gramnegatieve infecties en Mycobacterium spp. infecties5. In de jaren 1990, om een toenemend aantal M. tuberculosis-infecties effectief te behandelen, werden aanvullende geneesmiddelen gecombineerd met rifamycine-analogen om hun effectiviteit te vergroten. Ongeveer 5% van de gevallen van M. tuberculosis blijft echter resistent tegenrifampicine 5,6 en er is toenemende bezorgdheid over multiresistente bacteriën7. Momenteel is het gebruik van antibiotica alleen mogelijk niet voldoende bij de behandeling van zorginfecties, en dit heeft geleid tot een voortdurende zoektocht naar alternatieve antimicrobiële therapieën1.
Zware metalen, zoals zilver (Ag)8,9,10 en goud (Au)11, en keramiek, zoals titaandioxide (TiO 2)12 en zinkoxide (ZnO)13, in nanodeeltjes (NP) vorm (respectievelijk AgNP, AuNP, TiO2 NP en ZnONP) zijn onderzochtop hun antimicrobiële activiteiten en zijn geïdentificeerd als potentiële antibioticaalternatieven. Daarnaast zijn bioresorbeerbare materialen, zoals magnesiumlegeringen (Mg-legeringen)14,15,16, magnesiumoxide nanodeeltjes 17,18,19,20,21, en magnesiumhydroxide nanodeeltjes [nMgO en nMg(OH)2, respectievelijk]22,23,24, zijn ook onderzocht. De eerdere antimicrobiële studies van nanodeeltjes gebruikten echter inconsistente materialen en onderzoeksmethoden, wat resulteerde in gegevens die moeilijk of onmogelijk te vergelijken zijn en soms tegenstrijdig van aard zijn18,19. De minimale remmende concentratie (MIC) en de minimale bacteriedodende concentratie (MBC) van zilveren nanodeeltjes varieerden bijvoorbeeld aanzienlijk in verschillende onderzoeken. Ipe et al.25 evalueerden de antibacteriële activiteiten van AgNP's met een gemiddelde deeltjesgrootte van ~26 nm om de MIC's te bepalen tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën. De geïdentificeerde MIC's voor P. aeruginosa, E. coli, S. aureus en MRSA waren respectievelijk 2 μg / ml, 5 μg / ml, 10 μg / ml en 10 μg / ml. Parvekar et al.26 evalueerden daarentegen AgNP's met een gemiddelde deeltjesgrootte van 5 nm. In dit geval bleken de AgNP MIC en een MBC van 0,625 mg/ml effectief te zijn tegen S. aureus. Daarnaast evalueerden Loo et al.27 AgNP's met een grootte van 4,06 nm. Wanneer E. coli werd blootgesteld aan deze nanodeeltjes, werden de MIC en MBC gerapporteerd bij 7,8 μg / ml. Ten slotte onderzochten Ali et al.28 de antibacteriële eigenschappen van bolvormige AgNP's met een gemiddelde grootte van 18 nm. Wanneer P. aeruginosa, E. coli en MRSA werden blootgesteld aan deze nanodeeltjes, werd de MIC geïdentificeerd bij respectievelijk 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml en 36 μg / ml, en de MBC werd geïdentificeerd bij respectievelijk 36 μg / ml, 42 μg / ml en 30 μg / ml.
Hoewel de antibacteriële activiteit van nanodeeltjes de afgelopen decennia uitgebreid is bestudeerd en gerapporteerd, is er geen standaard voor de gebruikte materialen en onderzoeksmethoden om directe vergelijkingen tussen studies mogelijk te maken. Om deze reden presenteren we twee methoden, de directe co-cultuurmethode (methode A) en de directe blootstellingsmethode (methode B), om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes te karakteriseren en te vergelijken, terwijl de materialen en methoden consistent blijven.
Naast nanodeeltjes zijn ook nanogestructureerde oppervlakken onderzocht op antibacteriële activiteiten. Deze omvatten op koolstof gebaseerde materialen, zoals grafeen nanosheets, koolstofnanobuizen en grafiet29, evenals pure Mg- en Mg-legeringen. Elk van deze materialen heeft ten minste één antibacterieel mechanisme vertoond, waaronder fysieke schade aan celmembranen door op koolstof gebaseerde materialen en schade aan metabole processen of DNA door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) wanneer Mg wordt afgebroken. Bovendien, wanneer zink (Zn) en calcium (Ca) worden gecombineerd bij de vorming van Mg-legeringen, wordt de verfijning van de Mg-matrixkorrelgrootte verbeterd, wat leidt tot een vermindering van bacteriële hechting aan substraatoppervlakken in vergelijking met Mg-only monsters14. Om antibacteriële activiteit aan te tonen, presenteren we de directe kweekmethode (methode C), die bacteriële hechting op en rond nanogestructureerde materialen in de loop van de tijd bepaalt door de kwantificering van bacteriële kolonievormende eenheden (CFU's) met direct en indirect oppervlaktecontact.
De geometrie van nanostructuren op oppervlakken, inclusief de grootte, vorm en oriëntatie, kan de bacteriedodende activiteiten van materialen beïnvloeden. Lin et al.16 fabriceerden bijvoorbeeld verschillende nanogestructureerde MgO-lagen op de oppervlakken van Mg-substraten door anodisatie en elektroforetische depositie (EPD). Na een periode van blootstelling aan het nanogestructureerde oppervlak in vitro was de groei van S. aureus aanzienlijk verminderd in vergelijking met niet-behandeld Mg. Dit duidde op een grotere potentie van het nanogestructureerde oppervlak tegen bacteriële hechting ten opzichte van het niet-behandelde metallische Mg-oppervlak. Om de verschillende mechanismen van de antibacteriële eigenschappen van verschillende nanogestructureerde oppervlakken te onthullen, wordt in dit artikel een gerichte contactblootstellingsmethode (methode D) besproken die de cel-oppervlakte-interacties binnen het interessegebied bepaalt.
Het doel van dit artikel is om vier in vitro methoden te presenteren die van toepassing zijn op verschillende nanodeeltjes, nanogestructureerde oppervlakken en microbiële soorten. We bespreken de belangrijkste overwegingen voor elke methode om consistente, reproduceerbare gegevens voor vergelijkbaarheid te produceren. In het bijzonder worden de directe cocultuurmethode17 en de directe blootstellingsmethode gebruikt voor het onderzoeken van de antimicrobiële eigenschappen van nanodeeltjes. Door middel van de directe co-cultuur methode kunnen de minimale remmende en minimale bacteriedodende concentraties (respectievelijk MIC en MBC 90-99,99) voor individuele soorten worden bepaald en kan de krachtigste concentratie (MPC) voor meerdere soorten worden bepaald. Door de directe blootstellingsmethode kunnen de bacteriostatische of bacteriedodende effecten van nanodeeltjes bij minimale remmende concentraties worden gekenmerkt door real-time optische dichtheidsmetingen in de loop van de tijd. De direct culture14 methode is geschikt voor het onderzoeken van bacteriën die direct en indirect in contact komen met nanogestructureerde oppervlakken. Ten slotte wordt de focused-contactexposure 16-methode gepresenteerd om de antibacteriële activiteit van een specifiek gebied op een nanogestructureerd oppervlak te onderzoeken door de directe toepassing van bacteriën en de karakterisering van bacteriegroei op de cel-nanostructuurinterface. Deze methode is aangepast van de Japanse industriële standaard JIS Z 2801:200016 en is bedoeld om zich te concentreren op microbe-oppervlakte-interacties en de effecten van bulkmonsterafbraak in microbiële cultuur op antimicrobiële activiteiten uit te sluiten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>Z336777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 L NTRL Certified Convection Drying Oven&#160;</td>
			<td>MTI Corporation</td>
			<td>BPG-7082</td>
			<td>https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>42457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSpec&#160;THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-850-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron-multiplying charge-coupled device digital camera&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Brightline, Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverse microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth + agar</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroTube 5.0&#160;&#160;</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005-T5-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium oxide nanoparticles</td>
			<td>US Research Nanomaterials, Inc</td>
			<td>Stock #:&#160;US3310&#160;&#160;&#160;M</td>
			<td>MgO, 99+%, 20 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Semi-Micro Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS105D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-801A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 12-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 48-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 96-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470210-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 15 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SP70P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy (SEM)</td>
			<td>TESCAN&#160;</td>
			<td>Vega3 SBH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>MP</td>
			<td>1010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Benchmark Incu-shaker 10L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray power defraction</td>
			<td>&#160;Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PANalytical Empyrean Series 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces in vitro

De antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken, zoals zilver, zinkoxide, titaniumdioxide en magnesiumoxide, zijn eerder onderzocht in klinische en omgevingsomgevingen en in verbruiksartikelen. Een gebrek aan consistentie in de gebruikte experimentele methoden en materialen heeft echter geleid tot tegenstrijdige resultaten, zelfs tussen studies van dezelfde nanostructuurtypen en bacteriesoorten. Voor onderzoekers die nanostructuren willen gebruiken als additief of coating in een productontwerp, beperken deze tegenstrijdige gegevens hun gebruik in klinische omgevingen. 
Om dit dilemma het hoofd te bieden, presenteren we in dit artikel vier verschillende methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te bepalen en bespreken we hun toepasbaarheid in verschillende scenario's. Het aanpassen van consistente methoden zal naar verwachting leiden tot reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen studies en geïmplementeerd voor verschillende nanostructuurtypen en microbiële soorten. We introduceren twee methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes te bepalen en twee methoden voor de antimicrobiële activiteiten van nanogestructureerde oppervlakken. 
Voor nanodeeltjes kan de directe cocultuurmethode worden gebruikt om de minimale remmende en minimale bacteriedodende concentraties van nanodeeltjes te bepalen, en de directe blootstellingscultuurmethode kan worden gebruikt om real-time bacteriostatische versus bacteriedodende activiteit als gevolg van blootstelling aan nanodeeltjes te beoordelen. Voor nanogestructureerde oppervlakken wordt de directe kweekmethode gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën indirect en direct in contact met nanogestructureerde oppervlakken te bepalen, en de methode voor gerichte contactblootstelling wordt gebruikt om antimicrobiële activiteit op een specifiek gebied van een nanogestructureerd oppervlak te onderzoeken. We bespreken de belangrijkste experimentele variabelen waarmee rekening moet worden gehouden voor in vitro onderzoeksontwerp bij het bepalen van de antimicrobiële eigenschappen van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken. Al deze methoden zijn relatief goedkoop, maken gebruik van technieken die relatief gemakkelijk te beheersen en herhaalbaar zijn voor consistentie, en zijn toepasbaar op een breed scala aan nanostructuurtypen en microbiële soorten.

De identificatie van de antibacteriële activiteit van magnesiumoxide nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken is gepresenteerd met behulp van vier in vitro methoden die toepasbaar zijn op verschillende materiaalsoorten en microbiële soorten.
Methode A en methode B onderzoeken bacteriële activiteiten bij blootstelling aan nanodeeltjes in een vertragingsfase (methode A) en logfase (methode B) gedurende een duur van 24 uur of langer. Methode A geeft resultaten met betrekking t...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro at JoVE.com

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

We introduceren vier methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te evalueren met behulp van in vitro technieken. Deze methoden kunnen worden aangepast om de interacties van verschillende nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken met een breed scala aan microbiële soorten te bestuderen.

Evaluatie van antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

De protocollen bieden een methode om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te onderzoeken, van vooronderzoeken tot complexere oppervlakteonderzoeken. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden die resulteerden in onvergelijkbare gegevens in verschillende studies, produceren deze methoden consistente en vergelijkbare resultaten voor verschillende nanodeeltjesmaterialen, nanogestructureerde materialen en microbiële soorten. Het handhaven van een homogene verdeling van nanodeeltjes in methoden A en B kan moeilijk zijn.Vortex-monsters grondig zorgen voor suspensie van nanodeeltjes, en pipetteren drie tot vier keer tussen aliquots zal suspensies behouden Begin met het verzamelen van gekweekte bacteriën door één milliliter van de 's nachts gekweekte bacteriecultuur in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen te aliquoteren. Nadat u een voldoende aantal aliquots hebt gemaakt, centrifugeert u ze om de gewenste zitdichtheid te bereiken. Verzamel het supernatant in een opvangbak.En suspensie de celpellet opnieuw in 0,5 milliliter vers groeimedium. Combineer de suspensie uit twee buizen en herhaal de centrifugalisatie. Geef na het centrifugeren een tweede wasbeurt met vers groeimedium en herhaal het combineren van de inhoud van twee buizen in één voordat u de buizen centrifugeert.Geef de derde wasbeurt met 0,33 milliliter trisbuffer of hydroxyethylaminomethaanbuffer. Combineer de drie suspensies, elk met een volume van 0,33 milliliter, in één microcentrifuge van 1,5 milliliter. Verwijder na centrifugalisatie het supernatant uit de gepelletiseerde cellen en suspensie de celpellet opnieuw in één milliliter verse tris-buffer die bekend staat als de celsuspensie of een vertragingsfase bacteriële zaaicultuur.Om de bacterie- en nanodeeltjesculturen te vormen, aliquoteert u de twee milliliter van de bacteriële zaaicultuur in elke put van een 12-goed niet-weefselbehandelde polystyreenplaat. Voeg voor elke microcentrifugebuis van vijf milliliter die vooraf gewogen magnesiumoxidedeeltjes bevat, drie milliliter van de bacteriële zaaicultuur toe. En draai de buis kort om de magnesiumoxide nanodeeltjes met de bacteriën te mengen.Na het mengen, aliquot een milliliter van de magnesiumoxide nanodeeltjes suspensie naar drie afzonderlijke putten om de drievoudige monsters van elk vooraf gemeten gewicht van magnesiumoxide nanodeeltjes te creëren. Incubeer het monster 's nachts bij 37 graden Celsius en 120 tpm. En breng een monster van drie milliliter over in een individuele conische buis van 15 milliliter met behulp van een pipet.Voer vervolgens één tot 10 seriële verdunning uit in een 96-putplaat door 180 microliter trisbuffer toe te voegen aan elke put in rij B tot rij G voor het juiste aantal kolommen. Draai kort een conische buis van 15 milliliter met bacteriële monsters en voeg 50 microliter bacteriemonster toe aan een individuele put in rij A.Breng vervolgens vanuit rij A 20 microliter bacterieel monster over in de overeenkomstige put van rij B met kort mengen. Breng met behulp van een steriele pipetpunt 20 microliter over van de put in rij B naar de overeenkomstige put in rij C.Ga hiermee door tot rij G om de seriële verdunning van 10 naar de negatieve in rij B naar 10 naar de negatieve zes in rij G te voltooien.Als u klaar bent, pipet u 100 microliter van elke put in een geschikte groeiagarplaat, en verspreid over de plaat om de celcultuur te verspreiden.Plaats de putplaten een nacht in een incubatorschudder bij 37 graden Celsius en incuber de agarplaten gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Onderzoek de plaat en tel de platen met ongeveer 25 tot 300 kolonies. Kies indien mogelijk platen met dezelfde verdunningswaarde.Verdun voor elk te testen materiaal de nachtelijke bacteriële monsters door drie aliquots van 200 microliter aan het groeimedium toe te voegen in drie putten en drie aliquots van 200 microliter van de bacteriecultuur in extra putten. Plaats de 96-putplaat in de plaatlezer en scan deze. Blijf indien nodig bouillon of nachtelijke bacteriecultuur toevoegen totdat de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD 600, ongeveer 0,01 is bereikt.Om bacteriële nanodeeltjessuspensies en steriele media-nanodeeltjessuspensies te bereiden, verwijdert u één milliliter bacteriecultuur of -medium uit een drievoudige set conische buizen van 15 milliliter. En voeg het toe aan een centrifugebuis van vijf milliliter met vooraf gemeten nanodeeltjes. Vortex de buizen om de oplossing te mengen.Verdeel de nanodeeltjes homogeen door één milliliter aliquots over te brengen van de vijf milliliter centrifugebuis naar de 15 milliliter conische buis. Als u klaar bent, aliquot dan 200 microliter van elk monster in de afzonderlijke putten van een 96-putplaat. Nadat u de eerder beschreven zitdichtheid hebt bepaald, voegt u de monsters toe en controleert u deze in de afzonderlijke putjes van een 48-put, niet-weefselbehandelde polystyreenplaat.Vervolgens wordt de 0,75 milliliter van de celsuspensie in elk putje met de monsters en controles geïnventariseerd. Plaats de 48-putplaat gedurende 24 uur in een incubatorschudder bij 37 graden Celsius, met schudden bij 120 RPM. Verzamel na incubatie twee monsters van elke groep en breng ze afzonderlijk over in gelabelde microcentrifugebuizen van vijf milliliter.Voeg twee milliliter herziene gesimuleerde lichaamsvloeistof, of RSBF, toe aan elke buis. Bereid gesteriliseerd lachgas cellulosepapier voor door ze in een diameter van één centimeter te snijden. Leg het gesneden nitrocellulosepapier op een agarplaat met het juiste medium.Voeg vervolgens 50 microliter van de verdunde bacteriecultuur toe aan het filterpapier voordat u 50 microliter van een geschikt medium toevoegt aan het midden van elk monsteroppervlak. Pak met een gesteriliseerd pincet het saltraatcellosepapier van het oppervlak van de vijzel. Draai het saltraatcellulosepapier voorzichtig om en plaats het op het monsteroppervlak, zodat de bacteriën in contact komen met de 50 microliter medium en het nanogestructureerde oppervlak van belang.Als het monster in cultuur afbreekbaar is, plaats er dan een houder onder om het op te tillen om contact met de trisbuffer te voorkomen. Houd de luchtvochtigheid op peil door een milliliter trisbuffer toe te voegen aan een monster dat put bevat. Verzamel na een nacht incubatie het nitrocellulosepapier van elk monsteroppervlak en plaats ze in vijf milliliter trisbuffer.Vortex het verzamelde filterpapier en nanooppervlak materiaalmonsters gedurende vijf seconden. Verzamel de tris-buffersuspensies uit het monster en plaats ze in afzonderlijke verse opvangbuizen. De antimicrobiële effecten met behulp van methode A geïdentificeerde minimale en remmende concentratie, of MIC, van één milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes, en minimale bacteriocidale concentraties, of MBC 99,9, van respectievelijk 1,0 en 1,6 milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes voor gramnegatieve Escherichia coli en pseudomonas aeruginosa.De grampositieve staphylococcus epidermis, S.Aureus en methicilline-resistente staphylococcus aureus, of MRSA, toonden de MIC-waarden van respectievelijk 0,5, 0,7 en één milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes. NBC 99,99 waarden van 1,6 en 1,2 milligram per milliliter werden geïdentificeerd voor respectievelijk S.epidermis en S.aureus. Terwijl MRSA niet verder kwam dan NBC 90.MIC's van 1,2 en één milligram per milliliter werden geïdentificeerd in geneesmiddelgevoelige en medicijnresistente candida-soorten, respectievelijk C albicans en C albicans fluconazolresistent of FR. Magnesiumoxide nanodeeltjes vertoonden daarentegen MIC-waarden van één en 0,7 milligram per milliliter, of respectievelijk C.glabrata en C glabrata echinocandine resistent, of ER. Elke kandidaat-soort bereikte een NBC 90 van 0,7 tot 1,2 milligram per milliliter, maar alleen C.glabrata ER werd gereduceerd tot NBC 99,9 bij 1,2 milligram per milliliter.In methode B groeide MRSA blootgesteld aan nanodeeltjes exponentieel tot een OD van 0,85. Blootstelling aan 1,2 milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes en 6,25 milligram per milliliter trimethoprim resulteerde in respectievelijk 80,2% en 81,6% verminderde bacteriegroei. Evenzo verminderde 2,9 milligram per milliliter magnesiumhydroxide nanodeeltjes de bacteriële groei tot 70,3% Blootstelling aan één microliter per milliliter vancomycine resulteerde in een vermindering van 99,99% in de groei van MRSA, wat de bacteriostatische activiteit van magnesiumoxide en magnesiumhydroxide nanodeeltjes suggereert.Methode C toonde geen remming van de bacteriegroei bij indirect contact. De resultaten gaven aan dat ZC21 de sterkste antibacteriële activiteit had tegen de adhesie en groei van MRSA, voor alle geteste monsters. In methode D werd geen levensvatbare stafylokok aureus geïdentificeerd in de 1,9A-, 1,9 AA- en EPD-monsters of hun gepaarde filterpapieren.Blootstelling aan de EPD-monsters na een knieval verminderde echter de bacteriegroei naar een paar cellen op het nanogestructureerde oppervlak en het uitgeklede filterpapier. Het identificeren van antimicrobiële activiteiten op nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken heeft geleid tot aanvullend onderzoek in bio-engineeringtoepassingen, waaronder die met betrekking tot chronische wonden en implantaatgerelateerde infecties.

evaluation-antimicrobial-activities-nanoparticles-nanostructured

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned Oppervlakken aan hyaluronzuur Interacties met kanker cellen te bestuderen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Voorbereiding van de thermoresponsieve nanogestructureerde oppervlakken voor Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Productie van Metaal Nanoparticles door Pulsed Laser Ablation in Liquids: Een Tool voor het bestuderen van de Antibacteriële Eigenschappen van Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese van Meerwandige koolstof nanobuisjes bewerkt met zilveren nanodeeltjes en evaluatie van hun antibacteriële activiteiten en cytotoxische eigenschappen

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. Thus, many novel biomaterials are being designed to mimic specific environments required for biomedical applications such as tissue engineering and controlled drug delivery. The development of materials with improved properties for the immobilization of cells or enzymes is also a current research topic in bioprocess engineering. However, one of the most desirable properties of a material in these applications is the antimicrobial capacity to avoid any undesirable infections. For this, we present easy-to-follow protocols for the antimicrobial characterization of materials based on (i) the agar disk diffusion test (diffusion method) and (ii) the ISO 22196:2007 norm to measure the antimicrobial activity on material surfaces (contact method). This protocol must be performed using Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast to cover a broad range of microorganisms. As an example, 4 materials with different chemical natures are tested following this protocol against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Candida albicans.The results of these tests exhibit non-antimicrobial activity for the first material and increasing antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria for the other 3 materials. However, none of the 4 materials are able to inhibit the growth of Candida albicans.

We present a protocol for the antimicrobial characterization of advanced materials. Here, the antimicrobial activity on material surfaces is measured by two methods that complement each other: one is based on the agar disk diffusion test, and the other is a standard procedure based on the ISO 22196:2007 norm.

Antimicrobiële karakterisering van geavanceerde materialen voor Bioengineering toepassingen

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...